異種β 2-ミクログロブリンを有するコウモリ主要組織適合性複合体クラスIの安定性と構造
Summary
プロトコルは、異なる種からの2-ミクログロブリン(β 2m)置換 βの可能性を通じて安定な主要組織適合性複合体(MHC)クラスIを得るための実験的方法を記述する。2mの相同と異種βにより安定化したMHCIの構造比較を検討した。
Abstract
主要組織適合性複合体(MHC)は、感染症や腫瘍発生に対する抗原ペプチド提示およびT細胞免疫応答において極めて重要な役割を果たしている。異種由来の異種β 2-ミクログロブリン(β 2m)置換と混成したハイブリッドMHCを、インビトロで安定化させることができる。これは、哺乳動物のMHCIを研究するための実現可能な手段であり、相同β 2mが利用できない場合である。一方、哺乳動物β 2m置換はペプチドの提示に有意に影響を及ぼさないことが示されている。しかし、ハイブリッドMHCの方法論や技術に関する要約は、2-ミクログロブリン(β 2m)β異種と複合したハイブリッドMHCに関する限られた要約がある。本明細書において、MHC I研究における異種β 2m置換の実現可能性を評価する方法が提示される。これらのメソッドには、式の構成要素の準備が含まれます。インクルージョン体の精製とMHC複合体のリフォールディング;タンパク質の安定性の決定;結晶スクリーニングと構造決定。本研究は、MHC Iの機能と構造を理解するための勧告を提供し、また、感染症および腫瘍免疫療法におけるT細胞応答評価に重要である。
Introduction
主要な組織適合性複合体(MHC)は、すべての脊椎動物に存在し、感染性病原体に対する細胞介在免疫を決定する遺伝子のセットである。MHCクラスIは、ウイルス感染時に産生されるウイルス成分などの内因性ペプチドを、細胞性免疫を媒介し免疫調節1に関与するCD8+T細胞の表面上のT細胞受容体(TCR)に提示する。ペプチドに結合するMHC Iの構造研究は、CD8+ T細胞免疫応答の評価およびワクチン開発において重要な役割を果たすMHC I分子によるペプチド結合モチーフおよび提示特徴に関する情報を提供する。
ビョルクマンら2によるMHC I分子の最初の結晶化と構造決定以来、MHCI分子の結晶構造解析は、ペプチドがMHC I分子に結合する方法の理解を大きく促進し、重鎖およびペプチドとの軽鎖の相互作用を理解するのに役立つ。一連のフォローアップ研究は、軽鎖をコードする遺伝子がMHCと関連していないが、軽鎖はMHC I分子3,4の集合体にとって重要なタンパク質であることを示した。これは、複数の表面上のMHCクラスI分子の3つのドメインと相互作用する。軽鎖が存在しない場合、MHCクラスI分子は抗原提示細胞の表面上で正しく発現できず、TCRと相互作用して免疫学的機能を発揮することができません。
MHCIは重鎖(H鎖)と軽鎖(すなわち、β 2-ミクログロブリン(β 2m))から構成され、適当なペプチド5に結合して組み立てられる。H鎖の細胞外セグメントは、α1、α2およびα3ドメイン6から成る。α1およびα2ドメインは、ペプチド結合溝(PBG)を形成する。β 2m鎖は、MHC Iにおけるアセンブリ複合体の構造サブユニットとして機能し、複合体の立体構造を安定化させ、かつMHC IH鎖折りたたみ7、8、9に対する分子シャペロンである。一連の研究は、コウモリ(カイロプテラ)(Ptal-N*01:01)10、アカゲザル(霊長類)(マムB*17)11(Mamu-A*01)12(Mamu-A*02)13、マウス(Rodentia)(H-14)などの様々な哺乳類からのMHC I H鎖が示されています(H-14) 15,犬 (カルニボラ) (DLA-88*50801)16, 牛 (アルチオダクチラ) (BoLA-A11)17と馬 (ペリソダクチラ) (Eqca-N*00602 および Eqca-N*00601)18はヘテロβ 2m ) と組み合わせることができる。 これらのハイブリッド分子は、構造および機能研究でしばしば使用されます。.しかしながら、2mの異種βを有するハイブリッドMHCIの機能・構造研究のための方法論は、まだ要約されていない。一方、異なるタキサ間の2mの交換βの構造的根拠は不明のままである。
ここで、MHC I発現の手順は、再折、結晶化、結晶データ収集及び構造決定について要約する。また、異種から2mのβの潜在的な置換は、2mの相同と異種によって安定化したMHCIの構造立体構造を比較β分析される。これらの方法は、癌および感染症におけるさらなるMHC I構造研究およびCD8+T 細胞免疫応答評価に有用である。
Protocol
Representative Results
Discussion
異なるタキサからの異種置換によるハイブリッドタンパク質複合体の構築は、MHC Iおよびそのリガンドなど、相同錯体が利用できない場合の機能的および構造的調査のための一般的な戦略である。しかし、方法論や技術に関する要約は限られています。ここで、コウモリMHC Iの構造を、Ptal-N*01:01、bβ2mまたはhβ2mで安定化し、解析した。ptal-N*01:01に結合するβ 2mのアミノ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、中国南京大学医薬バイオテクノロジーの国家主要研究所のオープンファンドによって支援されました(グラントいいえ。KF-GN-201905)、中国の国立自然科学財団(助成金81971501)。ウィリアム・J・リュウは、NSFC(81822040)の優秀な若手科学者プログラムと北京新星科学技術計画(Z1811100006218080)によって支えられます。
Materials
| 10 kDa MMCO membrane | Merck millipore | PLGC07610 | |
| 30% Acrylamide | LABLEAD | A3291-500ml*5 | |
| 5×Protein SDS Loading | Novoprotein | PM099-01A | |
| AMICON ULTRA-15 15ML-10 KDa cutoff | Merck millipore | UFC901096 | |
| Ampicillin | Inalco | 1758-9314 | |
| APS | Sigma | A3678-100G | |
| BL21(DE3) strain | TIANGEN | CB105-02 | |
| DMSO | MP | 219605580 | Wear suitable gloves and eye/face protection. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice. |
| DTT | Solarbio | D1070 | Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice. |
| EDTA-2Na | KeyGEN BioTECH | KGT515500 | |
| Glycerin | HUSHI | 10010618 | |
| GSH | Amresco | 0399-250G | |
| GSSG | Amresco | 0524-100G | |
| Guanidine hydrochloride | Amresco | E424-5KG | |
| hβ2m | our lab | Zhang, S. et al. Structural basis of cross-allele presentation by HLA-A*0301 and HLA-A*1101 revealed by two HIV-derived peptide complexes. Mol Immunol. 49 (1-2), 395-401, (2011). | |
| IPTG | Inalco | 1758-1400 | |
| L-Arginine Hydrochloride | Amresco | 0877-5KG | |
| NaCl | Solarbio | S8210 | |
| Protein Marker | Fermentas | 26614 | |
| SDS | Boao Rui Jing | A112130 | |
| Superdex Increase 200 10/300 GL | GE Healthcare | 28990944 | |
| TEMED | Thermo | 17919 | Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen. |
| Tris-HCl | Amresco | 0497-5KG | |
| Triton X-100 | Bioruler | RH30056-100mL | |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 |
References
- Vyas, J. M., Van der Veen, A. G., Ploegh, H. L. The known unknowns of antigen processing and presentation. Nature Reviews Immunology. 8 (8), 607-618 (2008).
- Bjorkman, P. J., et al. Structure of the human class I histocompatibility antigen, HLA-A2. Nature. 329 (6139), 506-512 (1987).
- Seong, R. H., Clayberger, C. A., Krensky, A. M., Parnes, J. R. Rescue of Daudi cell HLA expression by transfection of the mouse beta 2-microglobulin gene. Journal of Experimental Medicine. 167 (2), 288-299 (1988).
- Zijlstra, M., et al. Beta 2-microglobulin deficient mice lack CD4-8+ cytolytic T cells. Nature. 344 (6268), 742-746 (1990).
- Gao, G. F., et al. Crystal structure of the complex between human CD8alpha(alpha) and HLA-A2. Nature. 387 (6633), 630-634 (1997).
- Bjorkman, P. J., Parham, P. Structure, function, and diversity of class I major histocompatibility complex molecules. Annual Review of Biochemistry. 59, 253-288 (1990).
- Achour, A., et al. Structural basis of the differential stability and receptor specificity of H-2Db in complex with murine versus human beta 2-microglobulin. Journal of Molecular Biology. 356 (2), 382-396 (2006).
- Kubota, K. Association of serum beta 2-microglobulin with H-2 class I heavy chains on the surface of mouse cells in culture. Journal of Immunology. 133 (6), 3203-3210 (1984).
- Bernabeu, C., van de Rijn, M., Lerch, P. G., Terhorst, C. P. Beta 2-microglobulin from serum associates with MHC class I antigens on the surface of cultured cells. Nature. 308 (5960), 642-645 (1984).
- Lu, D., et al. Peptide presentation by bat MHC class I provides new insight into the antiviral immunity of bats. PLoS Biology. 17 (9), 3000436 (2019).
- Wu, Y., et al. Structural basis of diverse peptide accommodation by the rhesus macaque MHC class I molecule Mamu-B*17: insights into immune protection from simian immunodeficiency virus. Journal of Immunology. 187 (12), 6382-6392 (2011).
- Chu, F., et al. First glimpse of the peptide presentation by rhesus macaque MHC class I: crystal structures of Mamu-A*01 complexed with two immunogenic SIV epitopes and insights into CTL escape. Journal of Immunology. 178 (2), 944-952 (2007).
- Liu, J., et al. Diverse peptide presentation of rhesus macaque major histocompatibility complex class I Mamu-A*02 revealed by two peptide complex structures and insights into immune escape of simian immunodeficiency virus. Journal of Virology. 85 (14), 7372-7383 (2011).
- Liu, W. J., et al. Protective T cell responses featured by concordant recognition of Middle East respiratory syndrome coronavirus-derived CD8+ T cell epitopes and host MHC. Journal of Immunology. 198 (2), 873-882 (2017).
- Mitaksov, V., Fremont, D. H. Structural definition of the H-2Kd peptide-binding motif. Journal of Biological Chemistry. 281 (15), 10618-10625 (2006).
- Xiao, J., et al. Diversified anchoring features the peptide presentation of DLA-88*50801: first structural insight into domestic dog MHC class I. Journal of Immunology. 197 (6), 2306-2315 (2016).
- Li, X., et al. Two distinct conformations of a rinderpest virus epitope presented by bovine major histocompatibility complex class I N*01801: a host strategy to present featured peptides. Journal of Virology. 85 (12), 6038-6048 (2011).
- Yao, S., et al. Structural illumination of equine MHC class I molecules highlights unconventional epitope presentation manner that is evolved in equine leukocyte antigen alleles. Journal of Immunology. 196 (4), 1943-1954 (2016).
- Wynne, J. W., et al. Characterization of the antigen processing machinery and endogenous peptide presentation of a bat MHC class I molecule. Journal of Immunology. 196 (11), 4468-4476 (2016).
- Zhang, S., et al. Structural basis of cross-allele presentation by HLA-A*0301 and HLA-A*1101 revealed by two HIV-derived peptide complexes. Molecular Immunology. 49 (1-2), 395-401 (2011).
- Hoof, I., et al. NetMHCpan, a method for MHC class I binding prediction beyond humans. Immunogenetics. 61 (1), 1-13 (2009).
- Raveh, B., London, N., Zimmerman, L., Schueler-Furman, O. Rosetta FlexPepDock ab-initio: simultaneous folding, docking and refinement of peptides onto their receptors. PLoS One. 6 (4), 18934 (2011).
- Otwinowski, Z., Minor, W. Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Methods in Enzymology. 276, 307-326 (1997).
- Brunger, A. T., et al. Crystallography & NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 54, 905-921 (1998).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66, 486-501 (2010).
- Glithero, A., et al. Crystal structures of two H-2Db/glycopeptide complexes suggest a molecular basis for CTL cross-reactivity. Immunity. 10 (1), 63-74 (1999).
- Tungatt, K., et al. Induction of influenza-specific local CD8 T-cells in the respiratory tract after aerosol delivery of vaccine antigen or virus in the Babraham inbred pig. PLoS Pathogens. 14 (5), 1007017 (2018).
- McCoy, W. H. t., Wang, X., Yokoyama, W. M., Hansen, T. H., Fremont, D. H. Structural mechanism of ER retrieval of MHC class I by cowpox. PLoS Biology. 10 (11), 1001432 (2012).
- Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
- Zhao, M., et al. Heterosubtypic protections against human-infecting avian influenza viruses correlate to biased cross-T-cell responses. mBio. 9 (4), (2018).
- Zhao, L., Cao, Y. J. Engineered T cell therapy for cancer in the clinic. Search Results. 10, 2250 (2019).
- Thompson, J. D., Gibson, T. J., Plewniak, F., Jeanmougin, F., Higgins, D. G. The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research. 25 (24), 4876-4882 (1997).
- Gouet, P., Robert, X., Courcelle, E. ESPript/ENDscript: Extracting and rendering sequence and 3D information from atomic structures of proteins. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3320-3323 (2003).
