Protokollen beskriver eksperimentelle metoder for å oppnå stabile store histokompatibilitetskompleks (MHC) klasse I gjennom potensielle β 2-mikroglobulin (β2m) substitusjoner fra forskjellige arter. Den strukturelle sammenligningen av MHC I stabilisert av homolog og heterolog β2m ble undersøkt.
Det store histokompatibilitetskomplekset (MHC) spiller en avgjørende rolle i antigenpeptidpresentasjon og T-celle immunresponser mot smittsom sykdom og tumorutvikling. Hybrid MHC I kompleks med heterolog β2-microglobulin (β2m) substitusjon fra forskjellige arter kan stabiliseres in vitro. Dette er et mulig middel for å studere MHC I av pattedyr, når homologe β2m ikke er tilgjengelig. I mellomtiden er det indikert at β2m substitusjon ikke påvirker peptidpresentasjonen betydelig. Det er imidlertid begrenset oppsummering av metodikken og teknologien for hybrid MHC I kompleks med heterolog β2-microglobulin (β2m). Her presenteres metoder for å evaluere muligheten for heterolog β2m substitusjon i MHC I-studien. Disse metodene inkluderer utarbeidelse av uttrykkskonstruksjoner; rensing av inklusjonsorganer og refolding av MHC-komplekset; bestemmelse av protein termobilitet; krystall screening og struktur bestemmelse. Denne studien gir en anbefaling for å forstå funksjon og struktur av MHC I, og er også viktig for T celle respons evaluering under smittsom sykdom og tumor immunterapi.
Det store histokompatibilitetskomplekset (MHC) finnes i alle virveldyr og er et sett med gener som bestemmer den cellemedierte immuniteten mot smittsomme patogener. MHC klasse I presenterer endogene peptider, for eksempel viruskomponenter produsert ved virusinfeksjon, til T cellereseptorer (TCR) på overflaten av CD8+ T-celler for å megle cellulær immunitet og delta i immunregulering1. En strukturell studie av MHC I binding til peptider gir informasjon om peptidbindende motiver og presentasjonsfunksjoner av MHC I molekyler, som spiller viktige roller i evalueringen av CD8+ T celle immunresponser og vaksineutvikling.
Siden den første krystalliseringen og strukturelle bestemmelsen av MHC I molekylær av Bjorkman et al. 2 , har krystallstrukturanalysen av MHCI-molekyleri stor grad fremmet forståelsen av hvordan peptider binder seg til MHC I molekyler, og bidrar til å forstå samspillet mellom lette kjeder med tunge kjeder og peptider. En rekke oppfølgingsstudier indikerte at selv om genene som koder lyskjeden ikke er forbundet med MHC, er lyskjeden et viktig protein for montering av MHCI-molekyler 3,4. Den samhandler med de tre domenene i MHC klasse I molekyler på flere overflater. Når lyskjeden er fraværende, kan mhc klasse I molekyler ikke uttrykkes riktig på overflaten av antigen-presentere celler og kan ikke samhandle med TCR for å utøve sine immunologiske funksjoner.
MHC I består av et tungt kjede (H-kjede) og lett kjede (f.eks. β2-mikroglobulin (β2m)), og monteres gjennom binding til et egnet peptid5. Det ekstracellulære segmentet av H-kjeden består av α1-, α2- og α3-domener6. α1- og α2-domenene danner peptidbindingssporet (PBG). Den β2m kjeden fungerer som en strukturell underenhet av monteringskomplekset i MHC I, stabiliserer konformasjonen av komplekset, og er en molekylær chaperone for MHC I H kjede folding7,8,9. En rekke studier har vist at MHC I H kjeder fra ulike pattedyr som (Chiroptera) (Ptal-N * 01:01)10, rhesus macaque (Primates) (Mamu-B*17)11 (Mamu-A*01)12 (Mamu-A*02)13, mus (Rodentia) (H-2Kd)14,15, hund (Carnivora) (DLA-88 * 50801)16, storfe (Artiodactyla) (BoLA-A11)17 og equine (Perissod (Eqca-N*00602 og Eqca-N*00601)18 kan kombineres med heterolog β2m (tabell 1). Disse hybridmolekylene brukes ofte i strukturelle og funksjonelle studier. Metoden for den funksjonelle og strukturelle studien av hybrid MHC I med heterologøse β2m er imidlertid ennå ikke oppsummert. Samtidig er det strukturelle grunnlaget for det omskiftede β2m mellom ulike taxa fortsatt uklart.
Heri oppsummeres prosedyren for MHC I-uttrykk, refolding, krystallisering, krystalldatainnsamling og strukturbestemmelse. I tillegg analyseres potensielle substitusjoner på β2m fra forskjellige arter gjennom å sammenligne den strukturelle konformasjonen av MHC I stabilisert av homolog og heterolog β2m. Disse metodene vil være nyttige for videre MHC I strukturell studie og CD8+ T celle immunrespons evaluering i kreft og smittsomme sykdommer.
Byggingen av et hybridproteinkompleks gjennom heterologisk substitusjon fra ulike taxa er en vanlig strategi for funksjonelle og strukturelle undersøkelser når homologkomplekset ikke er tilgjengelig, for eksempel i MHC I og dets ligandes. Det er imidlertid begrenset oppsummering av metodikken og teknologien. Heri ble strukturen til MHC I, Ptal-N*01:01, stabilisert av bβ2m eller hβ2m analysert. De viktigste aminosyrene til β2m binding til Ptal-N * 01: 01 ble funnet å være bevart mel…
The authors have nothing to disclose.
Denne studien ble støttet av det åpne fondet for statlige viktige laboratorier for farmasøytisk bioteknologi, Nan-jing University, Kina (Grant no. KF-GN-201905), National Natural Science Foundation of China (bevilgninger 81971501). William J. Liu støttes av Excellent Young Scientist Program fra NSFC (81822040) og Beijing New-star Plan of Science and Technology (Z181100006218080).
10 kDa MMCO membrane | Merck millipore | PLGC07610 | |
30% Acrylamide | LABLEAD | A3291-500ml*5 | |
5×Protein SDS Loading | Novoprotein | PM099-01A | |
AMICON ULTRA-15 15ML-10 KDa cutoff | Merck millipore | UFC901096 | |
Ampicillin | Inalco | 1758-9314 | |
APS | Sigma | A3678-100G | |
BL21(DE3) strain | TIANGEN | CB105-02 | |
DMSO | MP | 219605580 | Wear suitable gloves and eye/face protection. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice. |
DTT | Solarbio | D1070 | Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice. |
EDTA-2Na | KeyGEN BioTECH | KGT515500 | |
Glycerin | HUSHI | 10010618 | |
GSH | Amresco | 0399-250G | |
GSSG | Amresco | 0524-100G | |
Guanidine hydrochloride | Amresco | E424-5KG | |
hβ2m | our lab | Zhang, S. et al. Structural basis of cross-allele presentation by HLA-A*0301 and HLA-A*1101 revealed by two HIV-derived peptide complexes. Mol Immunol. 49 (1-2), 395-401, (2011). | |
IPTG | Inalco | 1758-1400 | |
L-Arginine Hydrochloride | Amresco | 0877-5KG | |
NaCl | Solarbio | S8210 | |
Protein Marker | Fermentas | 26614 | |
SDS | Boao Rui Jing | A112130 | |
Superdex Increase 200 10/300 GL | GE Healthcare | 28990944 | |
TEMED | Thermo | 17919 | Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen. |
Tris-HCl | Amresco | 0497-5KG | |
Triton X-100 | Bioruler | RH30056-100mL | |
Tryptone | Oxoid | LP0042 | |
Yeast extract | Oxoid | LP0021 |