Summary
该协议描述了通过从不同物种获得2-微球蛋白（β 2米）替代的潜在β获得稳定的主要组织相容性复合物（MHC）I类的实验方法。调查了由同源和异质β 2米稳定下来的MHC I的结构比较。
Abstract
主要的组织相容性复合物（MHC）在抗原肽的表达和T细胞对传染病和肿瘤发展的免疫反应中起着关键作用。杂交MHC I与异种β 2-微球蛋白（β 2米）从不同物种的替代可以稳定体外。这是研究哺乳动物MHC I的可行方法，当同源β 2米不可用时。同时，指出哺乳动物β 2米替代不会显著影响肽的表达。然而，对于与异种β 2-微球蛋白（β 2米）复合的混合MHC I的方法和技术的总结有限。在此，提出了在MHC I研究中评估异质β 2米替代的可行性的方法。这些方法包括准备表达结构：净化包容机构和重新折叠 MHC 综合体;确定蛋白质热稳定性;晶体筛选和结构确定。本研究为了解MHC I的功能和结构提供了建议，对传染病和肿瘤免疫治疗期间的T细胞反应评价也具有重要意义。
Introduction
主要的组织相容性复合物（MHC）存在于所有脊椎动物中，是一组基因，决定细胞介质对传染性病原体的免疫力。MHC类I向CD8+T 细胞表面的T细胞受体（TCR）展示内源肽，如病毒感染时产生的病毒成分，以调节细胞免疫和参与免疫调节1。MHC I 与肽结合的结构研究提供了有关 MHC I 分子的肽结合主题和表现特征的信息，在评估 CD8+ T 细胞免疫反应和疫苗开发中起着至关重要的作用。
自比约克曼等人首次对MHC I分子进行结晶和结构测定以来，MHCI分子的晶体结构分析极大地促进了对肽如何与MHC I分子结合的理解，有助于理解轻链与重链和肽的相互作用。一系列后续研究表明，虽然编码光链的基因与MHC无关，但光链是MHC I分子3、4组位的关键蛋白质。它与多个表面上的 MHC I 类分子的三个域相互作用。当光链缺失时，MHC I类分子不能正确表达在抗原呈现细胞表面，也不能与TCR相互作用以发挥其免疫功能。
MHC I由重链（H链）和轻链（即β 2-微球蛋白（β 2米）组成，通过与合适的肽5结合组装而成。H 链的细胞外部分由 α1、α2 和 α3 域6组成。α1 和 α2 域形成肽结合槽 （PBG）。β 2米链作为MHC I装配综合体的结构子团，稳定了复合物的构象，是MHC I H链折叠7、8、9的分子伴奏。一系列研究表明，MHC I H链来自各种哺乳动物，如蝙蝠（脊柱菌）（Ptal-N*01：01）10，恒河猴（灵长类动物）（马穆） -B*17）11 （马木-A*01）12 （马穆-A*02）13，鼠标 （罗登蒂亚） （H-2Kd）14，015，狗 （卡尼沃拉） （DLA-88*50801）16，牛 （阿蒂奥达蒂拉） （博拉-A11）17和马 （佩里索德） （Eqca-N*00602 和 Eqca-N*00601）18可与异质β2米（表1）相结合。这些混合分子经常用于结构和功能研究。然而，杂交MHC I与异质β 2m的功能和结构研究方法尚未总结。同时，不同税种之间2米β互换的结构基础仍不明朗。
在此，总结了MHC I表达、重新折叠、结晶、晶体数据收集和结构测定的过程。此外，通过比较由同源和异质β 2米稳定下来的MHC I的结构构象，分析不同物种β 2米的潜在替代。这些方法将有助于进一步的MHC I结构研究和CD8+T 细胞免疫反应评估癌症和传染病。
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Protocol
1. 表达结构的准备
- 从NCBI数据库中检索MHC I类基因（包括预测基因）的序列。
- 从免疫多态性数据库 （IPD） （www.ebi.ac.uk/ipd/mhc） 和 UniProt 数据库 （www.uniprot.org） 检索更高的哺乳动物 MHC I 重链序列。
- 要获得可溶性 MHC 复合物，请将序列变异以去除细胞反子和跨膜区域。
- 克隆编码蝙蝠Ptal-N*01：01（根银行号）的基因。KT98792919） （残留物 1-277） 和蝙蝠β2米 （根银行号XP_006920478.1） （残留 1-98） 成 pET-28a 矢量（中国北京诺维根）。
- 在经过改良的 pET-28a 矢量的NcoI和EcoR1站点之间插入优化的（用于大肠杆菌）序列。
- 构造人类β 2米表达质粒，如先前描述的20。
2. 肽合成
- 肽预测
- 如前10条所述，要筛选可能与Ptal-N*01：01结合的肽，使用蝙蝠相关病毒亨德拉病毒（HeV）的蛋白质体预测候选肽。为了从在线服务器的结构模型获得高亲和力肽，NetMHCpan 4.0服务器（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/）21 和罗塞塔FlexPepDock22 预测了所选肽部分的潜在结合。此外，其他软件和数据库，包括 BIMAS ，免疫表皮数据库（ IEDB ）、 NetCTL 1 . 2 和 SYFPEITHI 也可用于此，它们都集成了肽 - MHC I 类结合亲和力的预测、与抗原处理（ TAP ）传输效率相关的运输器、蛋白酶 C 端和肽 - HLA 类 I 分子的半衰期分离。
- 要预测高结合度肽，请同时使用 NetMHCpan 和罗塞塔 FlexPepDock 服务器。
注：不幸的是，两个生成的预测都与实验数据不符。这可能表明，目前的MHC结合肽预测不适合非人类和非小鼠哺乳动物，如蝙蝠，这可能有不同的肽结合方式。因此，我们需要结合各种预测软件和实验结果进行综合分析，以获得高亲和力肽。
- 肽制备和保存
- 与其生成自定义肽，不如使用专门的服务提供商。购买所有肽商业遵循肽预测工具，具有较高的绑定分数。HPLC 和质谱确定肽纯度为 +95%。
- 将所有购买的肽作为冷冻干燥粉末储存在+80°C，并在使用前溶解在二甲基硫化物（DMSO）中。
3. 净化包容机构
- 大肠杆菌的转化
- 将含有蝙蝠MHC I Ptal-N*01：01 H链的10克质粒，或人类β 2米或蝙蝠β 2米转化为100μL的BL21（DE3） 大肠杆菌。在冰中沐浴30分钟。
- 90 秒在 42 °C 下的热冲击，然后在冰中沐浴 2 分钟。
- 加入800μL的裂解肉汤（LB：酵母提取物，tryptone和NaCl;见 材料表）步骤3.1.2和摇动在200旋转每分钟（rpm）在37°C的摇摆平台上20分钟。
- 将100μL的细菌悬浮物涂抹在含有相应抗生素耐药性的板材上（安非他明：100 ng/mL），这与以前的结构相同。
- 接种文化
- 挑选一个最近转化的细菌克隆成3毫升LB与抗生素介质（安普西林：100 ng/mL）和培养在37°C，同时在200 rpm的摇动平台上摇动激活细菌。文化可以在深夜接种，准备第二天早上上岗。
- 提前一晚，将500μL的活性细菌存量转移到50毫升LB中，用抗生素介质（安普西林：100 ng/mL），并在37°C下孵育过夜，在200 rpm时摇晃。为方便准备下一次接种，请将剩余的活性细菌库存冻结在+80°C（500微升培养物，500微升40%甘油）中，直到需要下一次准备。
- 要生成大量的重组蛋白，请将细菌制剂以 1：100 的比例与抗生素介质（安普西林：100 ng/mL）一起转移到 2 L LB 中，在 200 rpm 下摇动时在 37 °C 下孵化。培养，直到达到0.6在600nm的吸收。在烧瓶中加入1 mM异丙基-1-β-D-银河苷（IPTG）（改变不同MHC的IPTG浓度，大多在0.1 mM-1m之间）到烧瓶中，以诱导蛋白质表达。
- 收获细菌
- 将细菌转移到离心瓶和离心机在5000 x g 20分钟在4°C。 从现在起，所有步骤应在4°C下执行。
- 将细菌重新悬浮在60mL的磷酸盐缓冲盐酸（PBS）中，并通过超声波细胞干扰剂释放表达重组蛋白。
注：一般来说，我们在这台机器上设置的程序是超声波6S，间隔12S，300W，99次）。
- 净化包容机构
- 离心声波细菌悬浮在12，000 x g 30分钟。丢弃超纳坦，在适当数量的洗涤缓冲区（0.5% 特里顿-100，50 mM 特里斯 pH 8.0，300 mM NaCl，10 mM EDTA，10 mM DTT）中重新悬浮颗粒。再次重复此过程。
- 离心机在12，000 x g 10-20分钟。丢弃超纳坦并重新悬浮在悬浮缓冲器中的包容体（50 mM 特里斯 pH 8.0，100 mM NaCl，10 mM EDTA，10 mM DTT）。取出 20 μL 样本（悬念缓冲区中的内含物），用于 SDS-PAGE 以测试内含物的纯度。
- 将剩余的预制在 12，000 x g 下，时间为 10-20 分钟。丢弃超纳坦。称重含有内含物的颗粒，并将溶解缓冲液（6 M瓜-HCl、10%甘油、50 m M特里斯 pH 8.0、100 mM NaCl、10 mM EDTA）添加到最终浓度为 30 mg/mL。在 4 °C 下使用磁搅拌器缓慢搅拌，直到内含物溶解在溶解缓冲区。
- 离心机 12，000 x g，10-20 分钟。丢弃沉淀物。将内含物存储在 +20 °C 或 +80 °C。
注：在进行内含物的净化之前，确认重组蛋白的诱导和表达是成功的。在蛋白凝胶上运行来自每个培养物的样本（在 IPTG 感应前后采集）：15% SDS-PAGE（SDS-PAGE 浓缩口香糖：H2O、30% 丙烯酰胺、1 M 特里斯-HCL pH 6.8、10% SDS、10% APS 和 TEMED;SDS-PAGE 分离凝胶：H2O、30% 丙烯酰胺、1.5 M 特里斯-HCl pH 8.8、10% SDS、10% APS 和 TEMED;见材料表）为β 2米，10%SDS-PAGE为H链。
4. MHC复合物的重新折叠
注：被重新折叠的内含体的效率将影响获得的蛋白质的产量。折叠与聚合竞争，因此人们普遍认为低蛋白浓度的折叠是最成功的方法。本文中，包容体浓度为30毫克/mL。
- 准备重新折叠缓冲区。
- 根据蛋白质变化重新折叠缓冲的成分。例如，pH 值、离子强度、重氧化条件和配体的存在将影响重新折叠结果。最常见的是使用三叶草或基于 HEPES 的缓冲区，在中性 pH 度下，NaCl 浓度为 50-500 mM，但这也取决于目标蛋白质。以下是本文中使用的重新折叠缓冲公式。
- 准备折叠缓冲区与 100 m 特里斯 - Hcl ph 8.0， 400 mm L - 精氨酸， 2 mm Edta - 2na 。
- 在 250-300 mL 烧瓶中将缓冲区冷却至 4°C，然后添加 5 mM 减少谷胱甘肽 （GSH） 和 0.5 mm 氧化谷胱甘肽 （GSSG）。在加入内含物和肽之前，在 4 °C 下使用磁搅拌器缓慢搅拌 10-20 分钟。
- MHC H 链的注射和稀释，β2米
注：执行重新折叠的温度可能会有所不同，但一般来说，为了尽量减少聚合，最好是 4 °C。我们用稀释来重新折叠蛋白质。- 使用 1 mL 注射器中的针头，分别将 1 mL 的h+2m 内含物或b+2m 内含体注射到两个重新折叠缓冲区（每个 1 升）中。在剧烈旋转的搅拌杆附近注入，以获得快速高效的稀释。β 2米重折叠相对容易，即使在没有H链的情况下保持稳定。
- β 2米后溶解在重新折叠溶液中，溶解DMSO中的肽（5毫克/mL），并快速将200μL注入重新折叠溶液中。在添加 H 链之前，缓慢搅拌 10-20 分钟。
- 将 H 链注入上述相同的程序，β2米。H链非常不稳定：因此，注射顺序是相当重要的。将 3 mL 的 H 链内含物分别注入两个不同的重新折叠缓冲区（每升 1 升），带h+2米或b+2米。连续注射小点，而不是单次应用全部蛋白质量，可提高重新折叠MHC的产量。允许重新折叠在 4 °C 下进行 8-10 小时。
- 重新折叠的蛋白质浓度
- 使用超滤在加压室与10 kDa MMCO膜浓度的重新折叠蛋白。此方法很方便，可与缓冲器交换相结合。将交换缓冲区（20 mM 三轮车，50 mM NaCl pH 8.0）添加到会议厅，并集中到 30-50 mL 的最终体积。
- 将重新折叠溶液转移到离心管中，在 4 °C 下以 12，000 x g 旋转 15 分钟，以去除沉淀物。
- 小心地转移超强剂，并进一步集中到最终的体积为~1 mL。
- 离心机在12，000 xg 10-20分钟。将超纳坦转移到无菌管中，使用 10/300 GL 尺寸排除柱净化蛋白质。
- 在峰值时收集样品，并使用 SDS-PAGE（15% 聚丙烯酰胺凝胶）进行分析。
- 收集 MHC 复杂峰值，并集中到 15 毫克/mL 的最终浓度。
- 将复合物稀释至 7.5 毫克/mL 和 15 毫克/mL 以进行结晶。
5. 结晶、数据收集和处理
- 使用坐落蒸汽扩散技术对复杂的 MHC 和肽进行结晶。
- 使用商业水晶套件（例如水晶屏幕套件 I/II、索引屏幕套件、PEGIon 套件 I/II 和 PEGRx 套件）筛选 Ptal-N*01：01/肽复合物。
- 在 4 或 18 °C 时密封生成的溶液并平衡 100μL 的储层溶液。
- 观察3天、1周、2周、1个月、3个月和6个月的晶体生长。使用显微镜观察晶体板中的每一滴是否有晶体。
注：Ptal-N*01：01/HeV1（b+2m）晶体在浓度为7.5毫克/mL的0.2M纳克、0.1米比斯-特里斯（pH 5.5）和25%（w/v）聚乙烯乙二醇3，350中观察到。Ptal-N*01：01/HeV1（h+2m）晶体在浓度为7.5毫克/mL的0.1 M HEPES、pH 7.0、2%w/v聚乙二醇3，350中观察到。 - 为了保护低温，将晶体转移到含有20%甘油的储存液中，然后在100K气氮流中快速冷却。
- 从上海同步辐射设施（中国上海）的光束线BL19U收集X射线衍射数据。
6. 结构确定和分析
- 使用 Denzo 程序和 HKL2000 软件包 （https://hkl-xray.com/） 23，具有高分辨率结构数据、处理和扩展集合的强度。
- 在蛋白质数据库 （PDB） 中选择更好的初始模型后，在 CCP4 24（http://www.ccp4.ac.uk/）中使用分子替换与程序相位 MR 进行分子替换确定结构。所使用的模型是与蛋白质数据库 （PDB） 代码 5F1I 的结构坐标。
- 使用精制的 X 射线模型进行初始联合改进。单独使用菲尼克斯精炼和联合模式进行X射线单独和联合中子和X射线精炼。
- 每次改进后，手动检查模型对 Fo - Fc 和 2Fo - Fc 正核密度图在 Coot25 （https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/）。这有助于正确放置水和某些D原子。所有结构图均由PyMOL（http://www.pymol.org/）创建。
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Representative Results
先前的工作报告说，HeV衍生的 HeV1 （DFANTFLP） 肽是由 Ptal-N*01：0110，19.在这里，评估了这种肽与Ptal-N*01：01的结合能力，同源蝙蝠β 2米（b+2米）和异质人类β 2米（h+2米）（图1C，1D）。 分别形成了分辨率较高的晶体（图1E，1F）。晶体由Ptal-N*01：01/HeV1复合体组成，该复合物通过2米×2m的重新自然形成，分辨率为2.31+。晶体由Ptal-N*01：01/HeV1复合体组成，该复合物通过h+2m的重新自然形成，分辨率为 1.6 é。Ptal-N*01：01/HeV1 复合体通过重新自然形成，同时具有b+2m 和h+2m（图 1C，1D）。在此背景下，我们显示，Ptal-N*01：01/HeV1 复合体不是在没有β2米（图1A）和 H-2Kd的情况下形成的，这些复合体通过 h+2 米（图 1B）正确折叠。
然后分析了Ptal-N*01：01/HeV1/b+2米和Ptal-N*01：01/HeV1/h+2m的结构。在Ptal-N*01：01/HeV1/b+2米结构中， 残留 R3， H31， Q34， D53， W60， Y63 的 b+2米绑定到 H 链残留通过 PBG 的底部和残留 Q8， Y10， R12， N24， Y28， N98， N99 绑定到 H 链的 3 域.类似于Ptal-N*01：01/HeV1/b+2m建筑群，在Ptal-N*01：01/HeV1/h+2米结构中， 保存的残留物H31，D53，W60，Y63的h+2米，对应b+2米，与PBG的底部接触，并保存残留物Q8，Y10，R12，N24，对应b+2米绑定到+3域（图2A，2B）。
在整体结构中，Ptal-N*01：01/HeV1/b+2米和Ptal-N*01：01/HeV1/h+2米， H 链残留物 1-184 的平均根均方差 （RMSD） 在所有 Cα原子叠加 （图 3A） 下为 0.248。这一发现表明，这两个综合体之间没有区别。然后比较了不同β 2米复合物中类似肽的构象。肽对齐的结构表明，这两个复合物中 HeV1 肽的构象非常相似（图 3B）。此外，H-2Db呈现的 gp33（卡文法特姆）结构与鼠标β 2 米（m+2米）或h+2m的复杂结构对齐。H-2Db的 β1=2 PBG 的 RMSD 为 0.283，这两种结构中的肽的总体构象也相似（图 3C，3D）。这些数据表明，β2m和h+2m之间的2米置换，以及m+2m和 h+2m 之间的替换不会影响呈现肽的构象。
序列对齐表明，不同物种β 2米氨基酸受到高度保护（图4）。对不同物种的β 2米进行分析后发现，与MHC I H链形成氢键的β 2米氨基酸大部分被保存下来（图4，表2）。同时，不同的残留物也是在哺乳动物中具有类似化学性质的氨基酸。然而，与MHC I H链β 2米结合的关键残留物显示了鸡、鱼和两栖动物的多态性（图4）。
表1：各种哺乳动物与异质β 2米结合。请点击这里下载此表。
表2：不同物种MHC I中异质β 2米和重链之间的氢键相互作用。请点击这里下载此表。
图1：净化可溶性和重新折叠的Ptal-N*01：01/HeV1复合蛋白和用于衍射分析的晶体照片。M是kDa中的分子量标记。P1 是聚合。P2 是 MHC 综合体。P3 是β2米（A）Ptal-N*01：01/HeV1 复合体，没有β2米（B）H-2Kd复合体的存在而形成，通过与 h+2 m（C）Ptal-N*01：01/HeV1 复合体的重新自然形成，通过 b+2m 的重新自然形成。该配置文件标有 75.0、44.0 和 13.7 kDa 分子质量标准的大致位置。（D） Ptal-N*01：01/ HeV1 复合体是通过h+2m（E） 的重新自然形成的，晶体由 Ptal-N*01：01/HeV1 复合体组成，该复合物通过2m的重新自然形成。黑色箭头表示用于在 X 射线衍射期间收集数据的晶体。（F） 晶体由Ptal-N*01：01/HeV1复合体组成，该复合物是通过h+2m的重新自然形成的。黑色箭头表示用于在 X 射线衍射期间收集数据的晶体。请点击这里查看此数字的较大版本。
图2：混合MHC I复合物中β 2米和重链之间的氢结合。β 2米和H链之间的氢结合在（A） Ptal-N*01：01/b+2 m/HeV1 和（B） Ptal-N*01：01/h+2 m/HeV1 MHC 复合体中。氢键相互作用由黑色虚线表示。正方形表示放大的区域，并显示在相应的彩色框中。红色表示同源β 2米，异质β 2米使用相同的氨基酸与H链形成氢键。请点击这里查看此数字的较大版本。
图3：混合MHC I复合物中MHC复合物和抗原肽的类似构象。（A） ptal-N*01：01/b+ 2m（绿色）和 Ptal-N*01：01/h+2 m（灰色）的+1+2域叠加。（B） HeV1肽的叠加与每个Ptal-N*01：01分子的[1]2域叠加。HeV1 肽在 Ptal-N*01：01/b+2 米中表示为粉红色，在 Ptal-N*01：01/h+2 米中表示为黄色。 （C） h-2Db/mouse的 +1+2 域叠加β2米（m+2m） （绿色）和 H-2Db/h+2 m（灰色）。 （D） gp33肽叠加与每个H-2Db分子的 α1=2 域叠加。肽 gp33 在 H -2Db /m+2 m 中表示为蓝色，在 H-2Db/h+2 m 中表示为粉红色。请单击此处查看此数字的较大版本。
图4：基于结构的序列对齐h+2m与其他物种β 2米。黑色箭头表示β链。红色突出显示的残留物完全保存完好吗，蓝色盒子中的残留物高度（+80%）保守。黄色三角形表示β 2米和H链之间相互作用的关键氨基酸。序列对齐是使用 Clustal X32 和 ESPript33生成的。 请点击这里查看此数字的较大版本。
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Discussion
在无法使用同源复合物（如 MHC I 及其配体）时，通过不同分类的异质替代构建混合蛋白复合物是功能和结构研究的常见策略。然而，关于方法和技术的总结有限。在这里，分析了蝙蝠MHC I，Ptal-N*01：01，稳定在b+2米或h+2m的结构。发现与Ptal-N*01：01结合的β 2米键氨基酸在蝙蝠和人类之间保存。经进一步分析，与MHC I H链β 2米结合的关键残留物在哺乳动物中保存，但在鸡、鱼和两栖动物中多态性。这些数据表明，异质β 2米替代是研究哺乳动物MHC I的可行方法。然而，哺乳动物和鸟类、鱼类或两栖动物之间的替代可能不可行。
结构研究在理解MHC I分子肽表达的分子机制方面发挥着关键作用。异质β 2米替代通常用于MHC I结构研究14，16，17，18，26，27，28。先前的研究表明，在牛MHC I，N*01801，β 2米和牛β 2米的行为相似，在绑定到N*01801 H链17的1[2]2域。在此，分析了由MHC I同一H链呈现但不同β 2米所呈现的单个肽的结构。这些数据表明，在2米β通过交叉分类稳定时，肽的构象相似，从而表明异种β 2米替代不会影响肽的表达。
MHC I提出的抗原肽被TCR认可为调解T细胞活化29。在病毒感染期间，对抗原特异性T细胞免疫反应的评估将大大提高对病毒感染和宿主免疫反应的了解。肽-MHC四重奏是评价T细胞反应的重要技术：它是一种技术，四聚一体的MHC单体分子，提高其亲和力，并结合它与T细胞上的多个TCRS。泰特拉默斯广泛应用于研究和临床诊断14，29，30。最近，TCR工程T细胞（TCR-T）已成为肿瘤免疫治疗的热门话题，其潜在的疗效在恶性肿瘤治疗31。MHC I 四聚体染色是筛查 MHC I 分子29中与癌症相关的抗原肽的特定 TCR 结合的关键方法。因此，MHC I 四聚体制剂在 TCR 筛查中起着至关重要的作用。除了 MHC I H 链的结合外，β 2m还与 T 细胞表面的 CD8 结合，这可能导致 MHC I 四体染色在 TCR 筛查过程中出现非特异性染色。异质β 2米替代可能会减少MHC I四重奏的这种非特定约束。
但是，协议存在一些限制。首先，虽然 大肠杆菌 仍然是重组蛋白的主要表达宿主，但许多转化后修改无法进行，表达蛋白产品形成不溶性内含体。然后，由于一些非哺乳动物β 2米与哺乳动物β 2米类似的替代，不知道非哺乳动物β 2米是否可以被异质β 2米取代，以帮助和稳定其MHC结构。在协议中，我们使用 NetMHCpan 和罗塞塔 FlexPepDock 服务器对已尝试的分析进行了描述。不幸的是，两个生成的预测都与实验数据不符。这可能表明，目前的MHC结合肽预测不适合非人类和非小鼠哺乳动物，如蝙蝠，这可能有不同的肽结合方式。因此，我们需要结合各种预测软件和实验结果进行综合分析，以获得高亲和力肽。
在此处描述的协议中，关键步骤是 MHC 可以正确地重新自然。获得具有高重新折叠效率的 MHC 复合体非常重要。因此，必须注意选择合适的肽，提高体内的纯度。
总之，这里总结了MHC I表达、重新折叠、结晶、晶体数据收集和结构确定的协议。此外，还分析了MHC I研究中异质β 2米替代的可行性。这项研究为理解MHC I在结构和功能研究方面提供了良好的参考。此外，这些数据对于评估传染病和肿瘤免疫治疗期间的T细胞反应也具有重要意义。
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Disclosures
作者没有什么可申报的。
Acknowledgments
本研究由中国南京大学医药生物技术国家重点实验室开放基金资助。KF-GN-201905），中国国家自然科学基金（赠款81971501）。刘晓波得到了国家自然科学基金（81822040）和北京新星科技计划（Z18110006218080）的优秀青年科学家项目的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 kDa MMCO membrane | Merck millipore | PLGC07610 | |
| 30% Acrylamide | LABLEAD | A3291-500ml*5 | |
| 5×Protein SDS Loading | Novoprotein | PM099-01A | |
| AMICON ULTRA-15 15ML-10 KDa cutoff | Merck millipore | UFC901096 | |
| Ampicillin | Inalco | 1758-9314 | |
| APS | Sigma | A3678-100G | |
| BL21(DE3) strain | TIANGEN | CB105-02 | |
| DMSO | MP | 219605580 | Wear suitable gloves and eye/face protection. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice. |
| DTT | Solarbio | D1070 | Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice. |
| EDTA-2Na | KeyGEN BioTECH | KGT515500 | |
| Glycerin | HUSHI | 10010618 | |
| GSH | Amresco | 0399-250G | |
| GSSG | Amresco | 0524-100G | |
| Guanidine hydrochloride | Amresco | E424-5KG | |
| hβ2m | our lab | Zhang, S. et al. Structural basis of cross-allele presentation by HLA-A*0301 and HLA-A*1101 revealed by two HIV-derived peptide complexes. Mol Immunol. 49 (1-2), 395-401, (2011). | |
| IPTG | Inalco | 1758-1400 | |
| L-Arginine Hydrochloride | Amresco | 0877-5KG | |
| NaCl | Solarbio | S8210 | |
| Protein Marker | Fermentas | 26614 | |
| SDS | Boao Rui Jing | A112130 | |
| Superdex Increase 200 10/300 GL | GE Healthcare | 28990944 | |
| TEMED | Thermo | 17919 | Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen. |
| Tris-HCl | Amresco | 0497-5KG | |
| Triton X-100 | Bioruler | RH30056-100mL | |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 |
References
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