Summary

Stabilità e struttura del pipistrello Maggiore Istocompatibilità Complesso Classe I con Eterolologo β2-Microglobulina

Published: March 10, 2021
doi:

Summary

Il protocollo descrive metodi sperimentali per ottenere sostituzioni stabili del complesso di istocompatibilità maggiore (MHC) classe Iattraversopotenziali sostituzioni di β 2-microglobulina (β2m) da diverse specie. Sono stati studiati il confronto strutturale dell’MHC I stabilizzato da β omologo edeterologodi 2 m.

Abstract

Il principale complesso di istocompatibilità (MHC) svolge un ruolo fondamentale nella presentazione del peptide antigene e nelle risposte immunitarie delle cellule T contro le malattie infettive e lo sviluppo tumorale. L’MHC I ibrido complesso con sostituzione eterologo β 2-microglobulina (β2m) da diverse specie può essere stabilizzato in vitro. Questo è un mezzo fattibile per studiare l’MHC I dei mammiferi, quando l’β2m non è disponibile. Nel frattempo, è indicato che il βsostituzione di 2m non influisce in modo significativo sulla presentazione peptidica. Tuttavia, c’è una sintesi limitata per quanto riguarda la metodologia e la tecnologia per l’MHC ibrido I complessa con β eterologo2-microglobulina (β2m). Nel presente documento vengono presentati metodi per valutare la fattibilità βsostituzione eterologodi 2 m nello studio MHC I. Questi metodi includono la preparazione di costrutti di espressione; purificazione dei corpi di inclusione e ripiezione del complesso MHC; determinazione della termostabilità proteica; screening cristallino e determinazione della struttura. Questo studio fornisce una raccomandazione per la comprensione della funzione e della struttura dell’MHC I ed è anche significativo per la valutazione della risposta delle cellule T durante le malattie infettive e l’immunoterapia tumorale.

Introduction

Il principale complesso di istocompatibilità (MHC) esiste in tutti i vertebrati ed è un insieme di geni che determina l’immunità mediata dalle cellule agli agenti patogeni infettivi. La classe MHC I presenta peptidi endogeni, come componenti virali prodotti dopo l’infezione da virus, ai recettori delle cellule T (TCR) sulla superficie delle cellule CD8+ T per mediare l’immunità cellulare e partecipare alla regolazione immunitaria1. Uno studio strutturale dell’MHC I che si lega ai peptidi fornisce informazioni sui motivi di legame peptidico e sulle caratteristiche di presentazione da parte delle molecole MHC I, che svolge un ruolo vitale nella valutazione delle risposteimmunitarie delle cellule CD8 + T e nello sviluppo del vaccino.

Sin dalla prima cristallizzazione e determinazione strutturale dell’MHC I molecolare di Bjorkman etal. Una serie di studi di follow-up ha indicato che sebbene i geni che codificano la catena luminosa non siano associati all’MHC, la catena luminosa è una proteina chiave per l’assemblaggio delle molecole di MHC I3,4. Interagisce con i tre domini delle molecole di classe I dell’MHC su più superfici. Quando la catena luminosa è assente, le molecole di classe I dell’MHC non possono essere espresse correttamente sulla superficie delle cellule che presentano antigeni e non possono interagire con il TCR per esercitare le loro funzioni immunologiche.

MHC I è composto da una catena pesante (catena H) e catena leggera (cioè β2-microglobulina (β 2 m)), ed èassemblato attraversoil legame con un peptideadatto 5. Il segmento extracellulare della catena H è costituito da α1, α2 e α3 domini6. I domini α1 e α2 formano il solco di legame peptidico (PBG). La catena β2m agisce come una subunità strutturale del complesso di assemblaggio in MHC I, stabilizzando la conformazione del complesso, ed è un chaperone molecolare per la piegatura della catena MHC I H7,8,9. Una serie di studi hanno dimostrato che mhc I H catene da vari mammiferi come pipistrello (Chiroptera) (Ptal-N*01:01)10, rhesus macaque (Primati) (Mamu -B*17)11 (Mamu-A*01)12 (Mamu-A*02)13, topo (Rodentia) (H-2Kd)14,15, cane (Carnivora) (DLA-88*50801)16,bovini (Artiodactyla) (BoLA-A11)17 ed equini (Perissodactyla) (Eqca-N*00602 ed Eqca-N*00601)18 possono combinarsi con β eterologadi 2m(tabella 1). Queste molecole ibride sono spesso utilizzate in studi strutturali e funzionali. Tuttavia, la metodologia per lo studio funzionale e strutturale dell’MHC I ibrido con β2m non è ancora riassunta. Nel frattempo, la base strutturale per l’β2milioni tra diversi taxa rimane poco chiara.

Nel presente documento vengono riassunte la procedura per l’espressione MHC I, il ripieliatura, la cristallizzazione, la raccolta dei dati cristallini e la determinazione della struttura. Inoltre, le potenziali sostituzioni di β 2 m da diverse specievengonoanalizzate confrontando la conformazione strutturale dell’MHC I stabilizzata da β2m omologi ed eterologi. Questi metodi saranno utili per ulteriori studi strutturali MHC I e valutazione della rispostaimmunitaria delle cellule CD8 + T nel cancro e nelle malattie infettive.

Protocol

1. Preparazione dei costrutti di espressione Recupera le sequenze dei geni di classe I dell’MHC (inclusi i geni previsti) dai pipistrelli dal database NCBI. Recuperare sequenze di catene pesanti MHC I di mammiferi superiori dal database ipd (Immuno Polymorphism Database) (www.ebi.ac.uk/ipd/mhc) e dal database UniProt (www.uniprot.org). Per ottenere complessi MHC solubili, mutagenizzare le sequenze per rimuovere le regioni citosoliche e transmembrane. Clonare i geni che codificano g…

Representative Results

Lavori precedenti riportavano che il peptide HeV1 (DFANTFLP) derivato da HeV era presentato da Ptal-N*01:0110,19. Nel presente documento è stata valutata la capacità di legame di questo peptide a Ptal-N*01:01 con pipistrello omologo β2m (bβ<font face="Helvetica Neue, Arial, sans-serif…

Discussion

La costruzione di un complesso proteico ibrido attraverso la sostituzione eterologo da diversi taxa è una strategia comune per le indagini funzionali e strutturali quando il complesso omologo non è disponibile, come nell’MHC I e nei suoi ligandi. Tuttavia, vi è una sintesi limitata per quanto riguarda la metodologia e la tecnologia. Qui è stata analizzata la struttura del pipistrello MHC I, Ptal-N*01:01, stabilizzata da bβ2m o hβ2m. Gli amminoacidi chiave di β2m che si legano a Pta…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo studio è stato sostenuto dal fondo aperto del laboratorio statale chiave di biotecnologia farmaceutica, Università di Nan-jing, Cina (Grant no. KF-GN-201905), la National Natural Science Foundation of China (sovvenzioni 81971501). William J. Liu è supportato dall’Excellent Young Scientist Program della NSFC (81822040) e dal Beijing New-star Plan of Science and Technology (Z181100006218080).

Materials

10 kDa MMCO membrane Merck millipore PLGC07610
30% Acrylamide LABLEAD A3291-500ml*5
5×Protein SDS Loading Novoprotein PM099-01A
AMICON ULTRA-15 15ML-10 KDa cutoff Merck millipore UFC901096
Ampicillin Inalco 1758-9314
APS Sigma A3678-100G
BL21(DE3) strain TIANGEN CB105-02
DMSO MP 219605580 Wear suitable gloves and eye/face protection. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice.
DTT Solarbio D1070 Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice.
EDTA-2Na KeyGEN BioTECH KGT515500
Glycerin HUSHI 10010618
GSH Amresco 0399-250G
GSSG Amresco 0524-100G
Guanidine hydrochloride Amresco E424-5KG
hβ2m our lab Zhang, S. et al. Structural basis of cross-allele presentation by HLA-A*0301 and HLA-A*1101 revealed by two HIV-derived peptide complexes. Mol Immunol. 49 (1-2), 395-401, (2011).
IPTG Inalco 1758-1400
L-Arginine Hydrochloride Amresco 0877-5KG
NaCl Solarbio S8210
Protein Marker Fermentas 26614
SDS Boao Rui Jing A112130
Superdex Increase 200 10/300 GL GE Healthcare 28990944
TEMED Thermo 17919 Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen.
Tris-HCl Amresco 0497-5KG
Triton X-100 Bioruler RH30056-100mL
Tryptone Oxoid LP0042
Yeast extract Oxoid LP0021

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Zhang, D., Liu, K., Lu, D., Wang, P., Zhang, Q., Liu, P., Zhao, Y., Chai, Y., Lyu, J., Qi, J., Liu, W. J. Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous β2-Microglobulin. J. Vis. Exp. (169), e61462, doi:10.3791/61462 (2021).

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