Summary
プロトコルは、異なる種からの2-ミクログロブリン(β 2m)置換 βの可能性を通じて安定な主要組織適合性複合体(MHC)クラスIを得るための実験的方法を記述する。2mの相同と異種βにより安定化したMHCIの構造比較を検討した。
Abstract
主要組織適合性複合体(MHC)は、感染症や腫瘍発生に対する抗原ペプチド提示およびT細胞免疫応答において極めて重要な役割を果たしている。異種由来の異種β 2-ミクログロブリン(β 2m)置換と混成したハイブリッドMHCを、インビトロで安定化させることができる。これは、哺乳動物のMHCIを研究するための実現可能な手段であり、相同β 2mが利用できない場合である。一方、哺乳動物β 2m置換はペプチドの提示に有意に影響を及ぼさないことが示されている。しかし、ハイブリッドMHCの方法論や技術に関する要約は、2-ミクログロブリン(β 2m)β異種と複合したハイブリッドMHCに関する限られた要約がある。本明細書において、MHC I研究における異種β 2m置換の実現可能性を評価する方法が提示される。これらのメソッドには、式の構成要素の準備が含まれます。インクルージョン体の精製とMHC複合体のリフォールディング;タンパク質の安定性の決定;結晶スクリーニングと構造決定。本研究は、MHC Iの機能と構造を理解するための勧告を提供し、また、感染症および腫瘍免疫療法におけるT細胞応答評価に重要である。
Introduction
主要な組織適合性複合体(MHC)は、すべての脊椎動物に存在し、感染性病原体に対する細胞介在免疫を決定する遺伝子のセットである。MHCクラスIは、ウイルス感染時に産生されるウイルス成分などの内因性ペプチドを、細胞性免疫を媒介し免疫調節1に関与するCD8+T細胞の表面上のT細胞受容体(TCR)に提示する。ペプチドに結合するMHC Iの構造研究は、CD8+ T細胞免疫応答の評価およびワクチン開発において重要な役割を果たすMHC I分子によるペプチド結合モチーフおよび提示特徴に関する情報を提供する。
ビョルクマンら2によるMHC I分子の最初の結晶化と構造決定以来、MHCI分子の結晶構造解析は、ペプチドがMHC I分子に結合する方法の理解を大きく促進し、重鎖およびペプチドとの軽鎖の相互作用を理解するのに役立つ。一連のフォローアップ研究は、軽鎖をコードする遺伝子がMHCと関連していないが、軽鎖はMHC I分子3,4の集合体にとって重要なタンパク質であることを示した。これは、複数の表面上のMHCクラスI分子の3つのドメインと相互作用する。軽鎖が存在しない場合、MHCクラスI分子は抗原提示細胞の表面上で正しく発現できず、TCRと相互作用して免疫学的機能を発揮することができません。
MHCIは重鎖(H鎖)と軽鎖(すなわち、β 2-ミクログロブリン(β 2m))から構成され、適当なペプチド5に結合して組み立てられる。H鎖の細胞外セグメントは、α1、α2およびα3ドメイン6から成る。α1およびα2ドメインは、ペプチド結合溝(PBG)を形成する。β 2m鎖は、MHC Iにおけるアセンブリ複合体の構造サブユニットとして機能し、複合体の立体構造を安定化させ、かつMHC IH鎖折りたたみ7、8、9に対する分子シャペロンである。一連の研究は、コウモリ(カイロプテラ)(Ptal-N*01:01)10、アカゲザル(霊長類)(マムB*17)11(Mamu-A*01)12(Mamu-A*02)13、マウス(Rodentia)(H-14)などの様々な哺乳類からのMHC I H鎖が示されています(H-14) 15,犬 (カルニボラ) (DLA-88*50801)16, 牛 (アルチオダクチラ) (BoLA-A11)17と馬 (ペリソダクチラ) (Eqca-N*00602 および Eqca-N*00601)18はヘテロβ 2m ) と組み合わせることができる。 これらのハイブリッド分子は、構造および機能研究でしばしば使用されます。.しかしながら、2mの異種βを有するハイブリッドMHCIの機能・構造研究のための方法論は、まだ要約されていない。一方、異なるタキサ間の2mの交換βの構造的根拠は不明のままである。
ここで、MHC I発現の手順は、再折、結晶化、結晶データ収集及び構造決定について要約する。また、異種から2mのβの潜在的な置換は、2mの相同と異種によって安定化したMHCIの構造立体構造を比較β分析される。これらの方法は、癌および感染症におけるさらなるMHC I構造研究およびCD8+T 細胞免疫応答評価に有用である。
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Protocol
1. 式構築の準備
- NCBIデータベースからコウモリからMHCクラスI遺伝子(予測遺伝子を含む)の配列を取り出します。
- 免疫多型データベース(IPD)(www.ebi.ac.uk/ipd/mhc)およびUniProtデータベース(www.uniprot.org)から高い哺乳動物MHC I重鎖配列を取得する。
- 可溶性MHC複合体を得るために、変異原性の配列を変異させ、細胞細胞および膜貫通領域を除去する。
- コウモリPtal-N*01:01(GenBank no.KT98792919)(残基1-277)とバットβ 2m(GenBankno.XP_006920478.1) (残基 1 - 98) pET-28a ベクター (中国、北京、ノバゲン) にそれぞれ。
- 最適化された( 大腸菌用)配列を挿入し、修飾pET-28aベクターの NcoI と EcoR1 サイトの間に挿入した。
- ヒトβ 2m発現プラスミドを構築する。
2. ペプチド合成
- ペプチド予測
- 前に説明したとおり、Ptal-N*01:01に結合し得るペプチドをスクリーニングし、コウモリ関連ウイルスヘンドラウイルス(HeV)のタンパク質体を用いて候補ペプチドを予測する。オンラインサーバから構造モデルに基づいて高親和性ペプチドを得るために、NetMHCpan 4.0サーバ(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/)21およびロゼッタFlexPepDock22は、選択されたペプチド画分における潜在的結合を予測した。また、BIMAS、免疫エピトープデータベース(IEDB)、NetCTL 1.2、およびSYFPEITHIを含む他のソフトウェアおよびデータベースも使用することができ、それらすべてをペプチド-MHCクラスI結合親和性、抗原処理(TAP)輸送効率に関連するトランスポーター、プロテアソームC末端切断およびペプチドHLクラスIA分子の半時間の解離の予測を統合することができる。
- 高結合ペプチドを予測するには、NetMHCpan とロゼッタ FlexPepDock サーバーの両方を使用します。
注: 残念ながら、どちらの予測も実験データと一致しません。これは、現在のMHC結合ペプチド予測が、コウモリなどの非ヒトおよび非マウス哺乳類には適していなかったことを示し、これはペプチド結合の方法が異なる可能性がある。そのため、様々な予測ソフトと実験結果を組み合わせて、高親和性ペプチドを得る必要があります。
- ペプチドの調製と保存
- カスタムペプチドを生成するのではなく、専門のサービスプロバイダーを使用します。より高い結合スコアを有するペプチド予測ツールに続いて、商業的に全てのペプチドを購入する。ペプチド純度はHPLCおよび質量分析法により95%と判定した。
- 購入したペプチドはすべて−80°Cの凍結乾燥粉末として保存し、使用前にジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解します。
3. 封入体の浄化
- 大腸菌の変容
- バットMHC I Ptal-N*01:01 H鎖を含むプラスミドの10 ngを変換し、2mまたは2mのバットβヒトβ BL21(DE3)大腸菌の100 μLに変換します。氷の中で30分間入浴します。
- 90sの42°Cで熱ショックを受け、続いて氷に2分間入浴する。
- リソジニーブロス(LB:酵母エキス、トリプトン、NaCl)を800 μL加え、 材料表を参照)をステップ3.1.2にし、37°Cのロッキングプラットフォームで毎分200回転(rpm)で20分間揺れます。
- 以前の構成物と同じである、対応する抗生物質耐性(アンピシリン:100 ng/mL)を含むプレートに100μLの細菌懸濁液を塗布する。
- イノキュレート文化
- 最近変容した細菌クローンを、抗生物質培地(アンピシリン:100 ng/mL)でLBの3mLに選び、37°Cで培養し、揺れるプラットフォーム上で200rpmで振って細菌を活性化します。培養物は夜遅くに接種することができ、翌朝の誘導の準備ができている。
- 1晩前に、活性化細菌ストックの500 μLを抗生物質培地(アンピシリン:100 ng/mL)で50mLのLBに移し、37°Cで一晩インキュベートし、200rpmで振る。次の接種を調製する際の便宜上、残りの活性菌ストックを1mLアリコート(500μLの40%グリセロールで500μL)で次の調製が必要になるまで、−80°Cで凍結します。
- 大量の組換えタンパク質を生成するには、抗生物質培地(アンピシリン:100ng/mL)を1:100の割合で2LのLBに移し、200rpmで振りながら37°Cでインキュベートする。600nmで0.6の吸光度が達成されるまでの培養。1 mM イソプロピル-1-チオ-β-D-ガラクトピラノシド(IPTG)を加え(異なるMHCsのIPTG濃度を変化させます、主に0.1 mM-1 mMMの間)、タンパク質発現の誘導のためにフラスコに。
- 収穫細菌
- 4°Cで20分間5000 x g で遠心分離器ボトルと遠心分離機に細菌を移します。 今後のすべてのステップは4°Cで行う必要があります。
- 60 mLのリン酸緩衝液生理食塩水(PBS)で細菌を再懸濁し、超音波細胞破壊によって発現した組換えタンパク質を遊離する。
注:一般的に、我々はこのマシンに設定プログラムは、超音波6S、間隔12S、300 W、99回です。
- 封入体の精製
- 遠心分離機は30分間12,000 x g で超音波処理された細菌の懸濁液を。上清を捨てて、適切な洗浄バッファー(0.5%トリトン-100、50 mMトリスpH 8.0、300 mM NaCl、10 mM EDTA、10 mM DTT)でペレットを再懸濁します。このプロセスをもう一度繰り返します。
- 10~20分間、12,000 x g の遠心分離機。上澄みを捨てて、再懸濁液バッファー内のインクルージョンボディを再中断します(50 mM Tris pH 8.0、100 mM NaCl、10 mM EDTA、10 mM DTT)。SDS-PAGE用に20μLサンプル(リサスペンションバッファ内のインクルージョンボディ)を取り出して、封入体の純度をテストします。
- 残りの準備を10~20分間12,000 x g で遠心します。上清を捨てます。包封体を含むペレットの重量を量り、溶解バッファー(6 M グア-HCl、10% グリセリン、50 mM トリス pH 8.0、100 mM NaCl、10 mM EDTA)を 30 mg/mL の最終濃度に加えます。封入体が溶解バッファーに溶解するまで、4 °C の磁気撹拌機を使用してゆっくりとかき混ぜます。
- 遠心分離機 12,000 x g 10~20 分間、 沈殿物を廃棄します。封入体は-20°Cまたは−80°Cで保管してください。
注:封入体の精製を進める前に、組換えタンパク質の誘導と発現が成功したことを確認してください。各培養物からサンプルを実行 (IPTG 誘導の前後に採取) タンパク質ゲル上で実行します。15% SDS-PAGE (SDS-PAGE濃縮ガム: H2O, 30% アクリルアミド, 1 M トリス-HCl pH 6.8, 10% SDS, 10% APS および TEMED;SDS-PAGE分離ゲル: H2O, 30% アクリルアミド, 1.5 M トリス-HCl pH 8.8, 10% SDS, 10% APS および TEMED;Hチェーンの2m、10%SDS-PAGEのβについては、材料表)を参照してください。
4. MHC複合体の再折りたたみ
注:封入体の効率は、得られたタンパク質の収量に影響を与えます。折り畳みは重合と競合するため、低タンパク質濃度でのリフォールディングが最も成功した方法が一般的に受け入れられています。本論文では、封入体濃度は30mg/mLである。
- バッファーの折り返しを準備します。
- タンパク質に応じてリフォールディングバッファーの組成を変化させます。例えば、pH、イオン強度、酸化還元条件およびリガンドの存在は、リフォールディング結果に影響を与える。最も一般的なのは、NaCl濃度が50〜500mMの中性pHでTrisまたはHEPESベースのバッファを使用することですが、これは標的タンパク質にも依存します。この資料で使用するバッファーの再折り返し式を次に示します。
- 100 mM トリス-HCl pH 8.0、400 mM L-アルギニン、2 mM EDTA-2Na で折りたたみバッファーを準備します。
- バッファーを 250~300 mL フラスコで 4 °C に冷却し、5 mM 還元グルタチオン (GSH) と 0.5 mM 酸化グルタチオン (GSSG) を加えます。4°Cの磁気撹拌機を使用してさらに10〜20分間ゆっくりと攪拌してから、封入体とペプチドを加えます。
- MHC H鎖およびβ 2mの注入および希釈
注: リフォールディングが行われる温度は変化する場合がありますが、一般的には凝集を最小限に抑えるには4°Cが最適です。私たちは、タンパク質を再折り畳むために希釈を使用しています。- 1 mL シリンジからの針を使用して、2 つのリフォールディング バッファー (1 リットル) に 1 mL の hβ2m 封入体または bβ2m 包み込み体をそれぞれ注入します。激しく回転する攪拌ロッドの近くに注入し、迅速かつ効率的な希釈を得る。β 2mは比較的容易に折り返し、H鎖が存在しない場合でも安定したままである。
- β 2mがリフォールディング溶液に溶解した後、DMSOにペプチド(5 mg/mL)を溶解し、200 μLを再折り返し溶液に素早く注入します。Hチェーンを追加する前に、10〜20分間ゆっくりとかき混ぜます。
- β 2mについて、上述の手順と同じ手順でH鎖を注入する。H鎖は非常に不安定である。したがって、注射の順序は非常に重要です。H鎖包封体の3mLを、それぞれhβ2mまたはbβ2mの2つの異なるリフォールディングバッファー(それぞれ1リットル)に注入する。タンパク質の全量の単一の適用の代わりに小さなアリコートの連続的な注入は、再折り畳まれたMHCの収率を増加させる。再折り返しを4°Cで8~10時間進めます。
- 再折り返しタンパク質の濃度
- リフォールディングタンパク質の濃度に10 kDa MMCO膜を有する加圧チャンバーでの限外ろ過を使用してください。この方法は便利で、バッファ交換と組み合わせることができます。交換バッファー(20 mM Tris-HCl、50 mM NaCl pH 8.0)をチャンバに追加し、最終容積の30~50 mLに濃縮します。
- リフォールディング溶液を遠心分離管に移し、4°Cで15分間12,000 x g でスピンし、沈殿物を除去します。
- 上清を慎重に移し、さらに最終容積〜1mLに濃縮する。
- 10~20分間、12,000 xg の遠心分離機。上清を滅菌チューブに移し、10/300 GLサイズ排除カラムを使用してタンパク質を精製します。
- ピーク時にサンプルを収集し、SDS-PAGE(15%ポリアクリルアミドゲル)を使用して分析します。
- MHC複合ピークを収集し、15 mg/mLの最終濃度に濃縮します。
- 結晶化のために7.5mg/mLと15mg/mLに錯体を希釈します。
5. 結晶化、データ収集、処理
- シッティングドロップ蒸気拡散技術を用いて、複合化MHCとペプチドの結晶化を行う。
- Ptal-N*01:01/ペプチド複合体を市販のクリスタルキットでスクリーニングします(例えば、クリスタルスクリーンキットI/II、インデックススクリーンキット、PEGIonキットI/II、PEGRxキット)。
- 得られた溶液を密封し、4または18°Cで100μLのリザーバー溶液に対して平衡化します。
- 3日間、1週間、2週間、1ヶ月、3ヶ月、6ヶ月間の培養で結晶成長を観察する。顕微鏡を使用して、結晶板の各ドロップに結晶があるかどうかを確認します。
注:Ptal-N*01:01/HeV1(bβ2m)結晶は、0.2 M NaCl、0.1 Mビストリ(pH 5.5)、25%(w/v)ポリエチレングリコール3,350濃度7.5mg/mLで観察されました。Ptal-N*01:01/HeV1(hβ2m)結晶は、0.1 M HEPES,pH 7.0, 2%w/vポリエチレングリコール3,350で7.5mg/mLの濃度で観察された。 - 極低温保護のために、20%のグリセロールを含む貯蔵溶液に結晶を移し、100K気体窒素流で急速に冷却する。
- 上海放射光施設(上海、中国)のビームラインBL19UからX線回折データを収集します。
6. 構造決定・分析
- 高解像度の構造データを使用して、DenzoプログラムとHKL2000ソフトウェアパッケージ(https://hkl-xray.com/)23を使用してコレクションの強度を処理し、スケーリングします。
- タンパク質データバンク(PDB)でより良い初期モデルを選択した後、CCP424(http://www.ccp4.ac.uk/) のプログラムPhaser MRとの分子置換を使用して構造を決定します。使用したモデルは、タンパク質データバンク(PDB)コード5F1Iを用いた構造座標であった。
- 初期関節の細分化には、洗練された X 線モデルを使用します。それぞれ、X線のみ、関節中性子とX線の精緻化のために、フェニックスの精緻化と関節モードを使用します。
- すべての洗練のラウンドの後、手動でFo - Fcと2Fo - Fc正核密度マップに対してモデルをチェックします https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/。これは、水と特定のD原子の適切な配置を容易にします。構造の全ての図はPyMOL(http://www.pymol.org/)によって作成されました。
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Representative Results
前の研究は、HeV由来HeV1(DFANTFLP)ペプチドがPtal-N*01:0110、19によって提示されたことを報告しました。本明細書において、このペプチドとPtal-N*01:01に対する結合能は、2mβ(bβ2m)及びヒトβ 2m(hβ2m)の相同コウモリとの間に2m(hβ2m)(図1C,1D)を有する。より高い分解能を持つ結晶がそれぞれ形成された(図1E,1F)。bβ2mでレナ化して形成されたPtal-N*01:01/HeV1複合体から結晶が形成され、分解能は2.31Åです。結晶は、hβ2mでレナ化を通して形成されたPtal-N*01:01/HeV1複合体から形成され、分解能は1.6Åです。Ptal-N*01:01/HeV1複合体は、bβ2 mとhβ2mの両方でレナ化を通じて正常に形成された(図1C,1D)。この文脈では、2m(図1A)とhβ2mを通して正しく折り畳むH-2Kdの β存在なしに、Ptal-N*01:01/HeV1複合体が形成されないことを示した(図1B)。
Ptal-N*01:01/HeV1/bβ2mおよびPtal-N*01:01/HeV1/hβ2mの構造を分析した。Ptal-N*01:01/HeV1/bβ2m構造において、残基R3、H31、Q34、D53、W60、Bβ2mのY63は、PBGおよび残基の底を通ってH鎖残基に結合し、Q8、Y10、R12、N24、Y28、N98、N99、N99を結合する。Ptal-N*01:01/HeV1/bβ2m コンプレックスと同様、 Ptal-N*01:01/HeV1/hβ2 m構造において、bβ2 mに相当するhβ2mの保存残基H31、D53、W60、Y63、PBG及び保存残基の底部に接触したQ8,Y10,R12,N24は、bβ-2 mに結合した図2B(AB)に結合したBβ-N*/2mである。
全体の構造では、Ptal-N*01:01/HeV1/bβ2mおよびPtal-N*01:01/HeV1/hβ2 m,H鎖の平均根平均平方偏差(RMSD)はH鎖の1~184(α1α2 PBGを形成する)を全てのC αの下で0.248であった。この知見は、これら2つの複合体の間に違いがないことを示した。次に、異なるβ 2mの複合体における類似のペプチドの立体構造を比較した。ペプチドアライメントの構造は、これら2つの複合体におけるHeV1ペプチドの立体構造が非常に類似していることを示した(図3B)。また、H-2Dbによって提示されたgp33(KAVYNFATM)の構造をマウスβ 2m(mβ2m)またはhβ2mと複合して整列させた。H-2Dbのα1α2 PBGのRMSDは0.283であり、これら2つの構造におけるペプチドの全体的な立体構造も同様であった(図3C,3D)。これらのデータは、bβ2mとhβ2mの間のβ 2m置換、およびmβ2mおよびhβ2mが提示されたペプチドの立体構造に影響を与えないことを示す。
配列アライメントは、異種から2mのβのアミノ酸が高度に保存されていることを示した(図4)。異種から2mのβの分析の後、MHCIのH鎖と水素結合を形成していたβ 2mのアミノ酸のほとんどが保存されていたことを示した(図4、表2)。一方、多様な残基は、哺乳類において同様の化学的性質を有するアミノ酸でもあった。しかしながら、MHCのH鎖に結合するβ 2mに関与する主残基は、ニワトリ、魚および両生類中の多型を示した(図4)。
表1:様々な哺乳動物は2m β異種と結合する。こちらの表をダウンロードしてください。
表2:異種β 2mの水素結合相互作用と、各種種のMHCIにおける重鎖の相互作用。こちらの表をダウンロードしてください。
図1:溶解性および再折り畳みPtal-N*01:01/HeV1複合タンパク質の精製と回折解析に使用される結晶の写真MはkDaの分子量マーカーである。P1 は集計です。P2 は MHC コンプレックスです。P3はβ 2m(A)Ptal-N*01:01/HeV1複合体は、hβ2m(C)Ptal-N*01:01/HeV1複合体をbβ2mでレナーテーションで形成したβ 2m(B)H-2Kd複合体が存在しないまま形成されなかった。 プロファイルは、75.0、44.0、および13.7 kDaの分子質量標準の近似位置でマークされています。(D) Ptal-N*01:01/ Hβ2 mでの編水によりヘV1複合体が形成された (E) 結晶は、bβ2mでレナクレーションを介して形成されたPtal-N*01:01/HeV1複合体から形成された。黒い矢印は、X線回折時にデータを収集するために使用される結晶を表します。(F)結晶は、hβ2mでレナ化を通して形成されたPtal-N*01:01/HeV1複合体から形成される。黒い矢印は、X線回折時にデータを収集するために使用される結晶を表します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ハイブリッドMHC I錯体におけるβ 2mと重鎖との間の水素結合。β 2mとH鎖の間の水素結合(A)Ptal-N*01:01/bβ2m/HeV1 および(B)Ptal-N*01:01/hβ2m/HeV1 MHC 複合体.水素結合相互作用は黒い点線で表される。正方形は、対応する色付きのボックスでズームインし、右に表示される領域を表します。赤色は、同じβ 2mと異種β 2mがH鎖と水素結合を形成するのに同じアミノ酸を使用することを表す。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:ハイブリッドMHC I複合体におけるMHC複合体および抗原性ペプチドの同様の立体構造。(A)α1α2ドメインの重ね合わせ(緑)とPtal-N*01:01/bβ2m(グレー)の2m(灰色)(B)各Ptal-N*01:01分子のα1α2ドメインの重ね合わせに伴うHeV1ペプチドの重ね合わせ。HeV1ペプチドは、ピンク色として示され、Ptal-N*01:01/bβ2 mでは黄色、Ptal-N*01:01/hβ2m(C)H-2Db/マウスβ 2m(緑)およびH-2Db/hβ2m(灰色)のα1α2ドメインの重ね合わせとして表される。(D)各H-2Db分子のα1α2ドメインの重ね合わせと共にgp33ペプチドの重ね合わせ。ペプチドgp33は、H-2Db /mβ2mで青色、H-2Db /hβ2 mのピンク色として表され、この図のより大きなバージョンを表示するにはここをクリックしてください。
図4:他の種の2mをβ hβ2mの構造ベース配列アライメント。黒い矢印はβストランドを示します。赤で強調表示された残基は完全に保存され、青いボックスの残基は非常に(>80%)保存。黄色の三角形は、β 2 mとH鎖の間の相互作用のキーアミノ酸を表します。シーケンスアライメントは、Clustal X32と ESPript33を使用して生成されました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
異なるタキサからの異種置換によるハイブリッドタンパク質複合体の構築は、MHC Iおよびそのリガンドなど、相同錯体が利用できない場合の機能的および構造的調査のための一般的な戦略である。しかし、方法論や技術に関する要約は限られています。ここで、コウモリMHC Iの構造を、Ptal-N*01:01、bβ2mまたはhβ2mで安定化し、解析した。ptal-N*01:01に結合するβ 2mのアミノ酸のキーアミノ酸は、コウモリとヒトの間で保存されていることがわかった。さらなる分析の結果、MHCのH鎖に結合するβ 2mに関与する主要残基は、哺乳類では保存されているが、ニワトリ、魚類および両生類では多形であることが判明した。これらのデータは、異種β 2m置換が哺乳動物のMHC Iを研究するための実行可能な手段であることを示している。しかしながら、哺乳類と鳥類、魚類または両生類の間の置換は実現不可能である。
構造研究は、MHC I分子によるペプチド提示の分子メカニズムを理解する上で極めて重要な役割を果たす。異種β 2m置換は、MHC I構造研究14、16、17、18、26、27、28で一般的に使用される。以前の研究では、ウシMHC Iでは、N*01801、マウスβ 2mおよびウシβ 2mがN*01801 H鎖17のα1α2ドメインに結合する際に同様に振る舞われたことが示されている。本明細書において、MHCIの同じH鎖によって提示された単一のペプチドの構造を2mの異なるβが分析した。これらのデータは、ペプチドの立体構造が2mのクロスタキサβによって安定化された場合に類似していることを示し、したがって2mの異種β置換がペプチド提示に影響しないことを示す。
MHC Iによって提示される抗原ペプチドは、T細胞活性化29を媒介するためにTCRによって認識される。ウイルス感染の際、抗原特異的T細胞免疫応答の評価は、ウイルス感染および宿主免疫応答の理解を大幅に向上させる。ペプチド-MHCテトラマーは、T細胞の応答を評価するための重要な技術です;MHCモノマー分子を四量体化し、その親和性を改善し、T細胞上の複数のTCRSと組み合わせる技術です。テトラマーは、研究と臨床診断14、29、30で広く使用されています。近年、TCR工学的T細胞(TCR-T)は、悪性腫瘍31の治療におけるそれらの潜在的効力に対する腫瘍免疫療法において話題となっている。MHC Iテトラマー染色法は、MHC I分子29によって提示された癌関連抗原ペプチドに特異的TCR結合をスクリーニングするための重要な方法である。従って、MHC I四トラマー製剤はTCRスクリーニングにおいて重要な役割を果たす。MHC I H鎖の結合に加えて、β 2mはT細胞表面上のCD8にも結合し、MHC I四量体染色によるTCRスクリーニング中に非特異的染色を招く可能性がある。異種β 2m置換は、MHC I四量計のこの非特異的結合を減少させる可能性がある。
ただし、プロトコルにはいくつかの制限があります。第一に、大腸菌は組換えタンパク質の主要な発現宿主であり続けるが、翻訳後修飾の多くは行うことができず、発現したタンパク質産物は不溶性の封入体を形成する。そして、哺乳類β 2mの非哺乳動物βの類似の置換により、2mの哺乳動物以外 βの哺乳類を2mの異種β 2mに置換してMHC構造を支援し安定化させることができるかは不明である。プロトコルでは、NetMHCpan とロゼッタ FlexPepDock サーバーの両方を使用して、試行された分析に関する説明が含まれています。残念ながら、どちらも予測が実験データと一致していません。これは、現在のMHC結合ペプチド予測が、コウモリなどの非ヒトおよび非マウス哺乳類には適していなかったことを示し、これはペプチド結合の方法が異なる可能性がある。そのため、様々な予測ソフトと実験結果を組み合わせて、高親和性ペプチドを得る必要があります。
ここで説明するプロトコルでは、MHCを正しく再来させることができるという重要なステップがあります。高いリフォールディング効率でMHC複合体を得ることは非常に重要です。したがって、適切なペプチドを選択し、封入体の純度を高めるために注意を払うことは重要です。
結論として、本明細書では、MHC I発現、再折、結晶化、結晶データ収集および構造決定のためのプロトコルを要約する。さらに、MHCIの研究における異種β 2m置換の実現可能性を分析した。本研究は、構造研究および機能研究におけるMHC Iを理解するための健全な参考文献を提供する。また、これらのデータは、感染症および腫瘍免疫療法中のT細胞応答の評価にも重要である。
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Disclosures
著者は宣言するものは何もありません。
Acknowledgments
この研究は、中国南京大学医薬バイオテクノロジーの国家主要研究所のオープンファンドによって支援されました(グラントいいえ。KF-GN-201905)、中国の国立自然科学財団(助成金81971501)。ウィリアム・J・リュウは、NSFC(81822040)の優秀な若手科学者プログラムと北京新星科学技術計画(Z1811100006218080)によって支えられます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 kDa MMCO membrane | Merck millipore | PLGC07610 | |
| 30% Acrylamide | LABLEAD | A3291-500ml*5 | |
| 5×Protein SDS Loading | Novoprotein | PM099-01A | |
| AMICON ULTRA-15 15ML-10 KDa cutoff | Merck millipore | UFC901096 | |
| Ampicillin | Inalco | 1758-9314 | |
| APS | Sigma | A3678-100G | |
| BL21(DE3) strain | TIANGEN | CB105-02 | |
| DMSO | MP | 219605580 | Wear suitable gloves and eye/face protection. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice. |
| DTT | Solarbio | D1070 | Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice. |
| EDTA-2Na | KeyGEN BioTECH | KGT515500 | |
| Glycerin | HUSHI | 10010618 | |
| GSH | Amresco | 0399-250G | |
| GSSG | Amresco | 0524-100G | |
| Guanidine hydrochloride | Amresco | E424-5KG | |
| hβ2m | our lab | Zhang, S. et al. Structural basis of cross-allele presentation by HLA-A*0301 and HLA-A*1101 revealed by two HIV-derived peptide complexes. Mol Immunol. 49 (1-2), 395-401, (2011). | |
| IPTG | Inalco | 1758-1400 | |
| L-Arginine Hydrochloride | Amresco | 0877-5KG | |
| NaCl | Solarbio | S8210 | |
| Protein Marker | Fermentas | 26614 | |
| SDS | Boao Rui Jing | A112130 | |
| Superdex Increase 200 10/300 GL | GE Healthcare | 28990944 | |
| TEMED | Thermo | 17919 | Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen. |
| Tris-HCl | Amresco | 0497-5KG | |
| Triton X-100 | Bioruler | RH30056-100mL | |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 |
References
- Vyas, J. M., Van der Veen, A. G., Ploegh, H. L. The known unknowns of antigen processing and presentation. Nature Reviews Immunology. 8 (8), 607-618 (2008).
- Bjorkman, P. J., et al. Structure of the human class I histocompatibility antigen, HLA-A2. Nature. 329 (6139), 506-512 (1987).
- Seong, R. H., Clayberger, C. A., Krensky, A. M., Parnes, J. R. Rescue of Daudi cell HLA expression by transfection of the mouse beta 2-microglobulin gene. Journal of Experimental Medicine. 167 (2), 288-299 (1988).
- Zijlstra, M., et al. Beta 2-microglobulin deficient mice lack CD4-8+ cytolytic T cells. Nature. 344 (6268), 742-746 (1990).
- Gao, G. F., et al. Crystal structure of the complex between human CD8alpha(alpha) and HLA-A2. Nature. 387 (6633), 630-634 (1997).
- Bjorkman, P. J., Parham, P. Structure, function, and diversity of class I major histocompatibility complex molecules. Annual Review of Biochemistry. 59, 253-288 (1990).
- Achour, A., et al. Structural basis of the differential stability and receptor specificity of H-2Db in complex with murine versus human beta 2-microglobulin. Journal of Molecular Biology. 356 (2), 382-396 (2006).
- Kubota, K. Association of serum beta 2-microglobulin with H-2 class I heavy chains on the surface of mouse cells in culture. Journal of Immunology. 133 (6), 3203-3210 (1984).
- Bernabeu, C., van de Rijn, M., Lerch, P. G., Terhorst, C. P. Beta 2-microglobulin from serum associates with MHC class I antigens on the surface of cultured cells. Nature. 308 (5960), 642-645 (1984).
- Lu, D., et al. Peptide presentation by bat MHC class I provides new insight into the antiviral immunity of bats. PLoS Biology. 17 (9), 3000436 (2019).
- Wu, Y., et al. Structural basis of diverse peptide accommodation by the rhesus macaque MHC class I molecule Mamu-B*17: insights into immune protection from simian immunodeficiency virus. Journal of Immunology. 187 (12), 6382-6392 (2011).
- Chu, F., et al. First glimpse of the peptide presentation by rhesus macaque MHC class I: crystal structures of Mamu-A*01 complexed with two immunogenic SIV epitopes and insights into CTL escape. Journal of Immunology. 178 (2), 944-952 (2007).
- Liu, J., et al. Diverse peptide presentation of rhesus macaque major histocompatibility complex class I Mamu-A*02 revealed by two peptide complex structures and insights into immune escape of simian immunodeficiency virus. Journal of Virology. 85 (14), 7372-7383 (2011).
- Liu, W. J., et al. Protective T cell responses featured by concordant recognition of Middle East respiratory syndrome coronavirus-derived CD8+ T cell epitopes and host MHC. Journal of Immunology. 198 (2), 873-882 (2017).
- Mitaksov, V., Fremont, D. H. Structural definition of the H-2Kd peptide-binding motif. Journal of Biological Chemistry. 281 (15), 10618-10625 (2006).
- Xiao, J., et al. Diversified anchoring features the peptide presentation of DLA-88*50801: first structural insight into domestic dog MHC class I. Journal of Immunology. 197 (6), 2306-2315 (2016).
- Li, X., et al. Two distinct conformations of a rinderpest virus epitope presented by bovine major histocompatibility complex class I N*01801: a host strategy to present featured peptides. Journal of Virology. 85 (12), 6038-6048 (2011).
- Yao, S., et al. Structural illumination of equine MHC class I molecules highlights unconventional epitope presentation manner that is evolved in equine leukocyte antigen alleles. Journal of Immunology. 196 (4), 1943-1954 (2016).
- Wynne, J. W., et al. Characterization of the antigen processing machinery and endogenous peptide presentation of a bat MHC class I molecule. Journal of Immunology. 196 (11), 4468-4476 (2016).
- Zhang, S., et al. Structural basis of cross-allele presentation by HLA-A*0301 and HLA-A*1101 revealed by two HIV-derived peptide complexes. Molecular Immunology. 49 (1-2), 395-401 (2011).
- Hoof, I., et al. NetMHCpan, a method for MHC class I binding prediction beyond humans. Immunogenetics. 61 (1), 1-13 (2009).
- Raveh, B., London, N., Zimmerman, L., Schueler-Furman, O. Rosetta FlexPepDock ab-initio: simultaneous folding, docking and refinement of peptides onto their receptors. PLoS One. 6 (4), 18934 (2011).
- Otwinowski, Z., Minor, W. Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Methods in Enzymology. 276, 307-326 (1997).
- Brunger, A. T., et al. Crystallography & NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 54, Pt 5 905-921 (1998).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K.
- Glithero, A., et al. Crystal structures of two H-2Db/glycopeptide complexes suggest a molecular basis for CTL cross-reactivity. Immunity. 10 (1), 63-74 (1999).
- Tungatt, K., et al. Induction of influenza-specific local CD8 T-cells in the respiratory tract after aerosol delivery of vaccine antigen or virus in the Babraham inbred pig. PLoS Pathogens. 14 (5), 1007017 (2018).
- McCoy, W. H. t, Wang, X., Yokoyama, W. M., Hansen, T. H., Fremont, D. H. Structural mechanism of ER retrieval of MHC class I by cowpox. PLoS Biology. 10 (11), 1001432 (2012).
- Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
- Zhao, M., et al. Heterosubtypic protections against human-infecting avian influenza viruses correlate to biased cross-T-cell responses. mBio. 9 (4), (2018).
- Zhao, L., Cao, Y. J. Engineered T cell therapy for cancer in the clinic. Search Results. 10, 2250 (2019).
- Thompson, J. D., Gibson, T. J., Plewniak, F., Jeanmougin, F., Higgins, D. G. The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research. 25 (24), 4876-4882 (1997).
- Gouet, P., Robert, X., Courcelle, E. ESPript/ENDscript: Extracting and rendering sequence and 3D information from atomic structures of proteins. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3320-3323 (2003).
