Summary
تدخل الحمض النووي الريبي هو أسلوب قابل للتطبيق على نطاق واسع وقوية للتلاعب التعبير الجيني في مراحل تنموية محددة. هنا، ونحن وصف الخطوات اللازمة لتنفيذ هذه التقنية في الغوص المائية خنفساء Thermonectus marmoratus، من الحصول على تسلسل الجينات إلى الضربة القاضية من الجينات التي تؤثر على هيكل أو السلوك.
Abstract
لا يزال تداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) تقنية قوية تسمح بالتخفيض المستهدف للتعبير الجيني من خلال تدهور الحمض النووي الريبي الريبي . هذه التقنية قابلة للتطبيق على مجموعة واسعة من الكائنات الحية وكفاءة عالية في النظام الغنية بالأنواع Coleoptera (الخنافس). هنا، نلخص الخطوات اللازمة لتطوير هذه التقنية في كائن حي جديد ونوضح تطبيقها على المراحل التنموية المختلفة لخنخة الغوص المائية Thermonectus marmoratus. ويمكن الحصول على تسلسلات الجينات المستهدفة بفعالية من حيث التكلفة من خلال تجميع النسخ ضد قريب مع الجينوم المعروفة أو دي نوفو. يستخدم استنساخ الجينات المرشحة متجه استنساخ محدد (pCR4-TOPO plasmid)، والذي يسمح بتوليف الحمض النووي الريبي المزدوج (dsRNA) لأي جين مع استخدام التمهيدي واحد مشترك. يمكن حقن الـ dsRNA المركبة في الأجنة إما لعمليات النمو المبكرة أو اليرقات لعمليات النمو اللاحقة. ثم نوضح كيف يمكن حقن RNAi في اليرقات المائية باستخدام الجمود في agarose. لشرح هذه التقنية، ونحن نقدم أمثلة عدة من التجارب RNAi، وتوليد الضربات القاضية محددة مع الأنماط الظاهرية المتوقعة. على وجه التحديد، RNAi للزلغة الجين laccase2 يؤدي إلى تفتيح البشرة في كل من اليرقات والبالغين، وRNAi لبيض جين تصبغ العين تنتج البرق / عدم التصبغ في أنابيب العين. بالإضافة إلى ذلك ، يؤدي الضربة القاضية لبروتين العدسة الرئيسي إلى اليرقات مع نقص بصري وانخفاض القدرة على اصطياد الفريسة. مجتمعة، وهذه النتائج تجسد قوة RNAi كأداة للتحقيق في كل من النقش المورفولوجية والصفات السلوكية في الكائنات الحية مع قواعد البيانات النسخية فقط.
Introduction
مسألة كيفية الجينات محددة تسهم في تطور الصفات المتنوعة هو موضوع مثير في علم الأحياء. على مدى العقود القليلة الماضية، وقد أحرز تقدم كبير فيما يتعلق بتشريح الأسس الوراثية للعمليات التنموية في الكائنات نموذج قليلة، مثل الخيطية Caenorhabditis elegans، ذبابة الفاكهة Drosophila melanogaster، والمنزل موسكولوس موسكولو ماوس1. في الآونة الأخيرة ، اختراع تقنيات قوية لتحرير الجينات مثل متفاوتة المسافات بانتظام يكرر palindromic قصيرة (CRISPR) / Cas92 وفرت القدرة على تغيير الشفرة الجينية للكائنات غير النموذجية (لأمثلة انظر3،4). ونتيجة لذلك، حدثت طفرة في الدراسات الجينية على مجموعة متنوعة من الكائنات الحية التي لم تكن قد تم تناولها من قبل من خلال التقنيات الجزيئية. وبالنظر إلى التنوع الهائل في مملكتنا الحيوانية، مع العديد من الصفات المثيرة للاهتمام أو الاختلافات سمة التي يتم تمثيلها فقط في أنواع محددة، جعلت هذا التقدم هو وقت مثير لعلم الأحياء التطوري والتنموي ("إيفو-ديفو") العمل ذات الصلة. ومع ذلك، فإن تقنيات تحرير الجينوم المتاحة للكائنات غير النموذجية مقيدة نسبياً فيما يتعلق بالنقاط الزمنية التنموية التي يمكن تطبيقها عليها، مما يجعل من الصعب تمييز الخصائص الزمنية المرتبطة بالدور الذي تلعبه الجينات المحددة في أي سمة. بالإضافة إلى ذلك، غالباً ما تقتصر التقنيات المعدلة وراثياً على الجينات غير الأساسية للبقاء على قيد الحياة (أي التي لا تؤدي الضربة القاضية إلى الفتك). ولذلك، فبينما بدأت تقنيات تحرير الجينات تصبح شائعة، لا تزال هناك حاجة إلى تقنيات فعالة قابلة للتطبيق على مجموعة متنوعة من الكائنات الحية المختلفة في نقاط زمنية تنموية محددة وتسهل الضربات القاضية الجزئية (بدلاً من فقدان الوظيفة بالكامل). هنا ، ونحن نلفت الانتباه إلى تدخل الحمض النووي الريبي (RNAi) ، وهو تاريخ بعض الشيء بعد قوية الجينات الأسلوب5 التي هي قيمة خاصة باعتبارها نهجا التآزر لتحرير الجينات. على وجه التحديد، وضعنا إجراءات تسمح بتطبيق RNAi على خنافس الغوص المائية كمثال يوضح تنفيذ هذه التقنية، من الحصول على التسلسلات الجزيئية اللازمة للحقن الناجح للرنا المزدوج (dsRNA) في البيض واليرقات.
RNAi المستندة إلى ضرب الجينات استفيد من آلية الدفاع الفطرية من الكائنات الحية، والتي جزيئات DSRNA تسهيل إسكات توالي الحمض النووي الغازية، مثل الفيروسات transposons6. باختصار، يتم تناول الـ dsRNA في الخلية، حيث يتم قطعها إلى 20-25 قطعة من النيوكليوتيدات بواسطة إنزيم الـ Dicer. ثم تقوم هذه القطع بتنشيط تشكيل مجمع إسكات الـRNA الذي يسببه الجيش الملكي النيبالي (RISC)، والذي يمنع الـ MRNA المستهدفة من خلال الربط معها في مواقع محددة باستخدام حبلا الدليل. هذه العملية تؤدي في نهاية المطاف إلى تدهور مرنا وبالتالي يتداخل مع ترجمة مرنا إلى البروتين6. ولذلك تعتمد تقنية الضربة القاضية للجينات المستندة إلى RNAi المقدمة هنا على حقن dsRNA. بالنسبة لنماذج الحيوانات، وقد وضعت هذه التقنية أصلا في C. elegans7 و D. الميلانوغاستر8 ولكن منذ ذلك الحين ظهرت كأداة وراثية وظيفية قوية في الكائنات غير نموذج9،10. نظرا لطبيعتها الفعالة للغاية في بعض الحشرات ، يمكن حتى تطبيق RNAi في إدارة الآفات11.
كأداة بحثية، تم استخدام RNAi لدراسة كيفية عمل المسارات الجزيئية والتنموية الرئيسية في نماذج الحشرات غير التقليدية. على سبيل المثال، RNAi في خنفساء الدقيق Tribolium castaneum كان له دور فعال في تحديد مدى الجينات المحافظة على عمق تسهم في سمات محددة في تلك الخنفساء، كما يتضح من أجل تطوير أجنحة على شكل خاص12،,13،,14 وعيون15،,16. وقد وصفت جيدا التقنيات التي تكمن وراء التلاعب في T. castaneum 17 وتعتمد على القدرة على شل البيض الجاف نسبيا واليرقات على سطح لزجة. غير أن هذا الجمود غير ممكن للأشكال التنموية الرطبة للكائنات المائية مثل الغوص الشمس بيتف ثيرمونكتوس marmoratus. كما هو الحال بالنسبة للعديد من الكائنات العضوية النموذجية غير التقليدية ، فإنه يفتقر إلى جينوم مشروح. للتلاعب بالتعبير الجيني في أي كائن حي بدون جينوم ، فإن الخطوة الأولى المعقولة والفعالة من حيث التكلفة هي توليد نسخ وتحديد تسلسلات النوكليوتيدات المفترضة للجينات المعبّر عنها ذات الاهتمام استنادًا إلى تشابه التسلسل مع الكائنات النموذجية ذات الصلة ولكن الأكثر رسوخاً ، في هذه الحالة ، جينات Tribolium (Coleoptera) و Drosophila.
هنا، لإظهار كيف يمكن استخدام RNAi على كائن مائي، ونحن نناقش أولا بروتوكولات وبرامج لاستخراج الحمض النووي الريبي وتوليد النسخ وتجميع، والتي تسمح لتحديد تسلسلات الجينات المستهدفة محددة. ثم نلخص الخطوات اللازمة لتجميع الحمض النووي الخاص بالجينات. في وقت لاحق، ونحن توضيح كيف يمكن حقن البيض في بيئة مائية، وتبين بروتوكولات الحضانة لتنمية الأجنة النامية. بالإضافة إلى ذلك ، نبين كيف يمكن استخدام جل agarose لشل حركة اليرقات تمامًا أثناء عملية الحقن ، وهي تقنية مفيدة بشكل عام خلال الإجراءات المختلفة ويمكن تطبيقها على مجموعة متنوعة من المفصليات. لشرح كيف يمكن تطبيق RNAi على مراحل النمو المختلفة، ونحن تشمل مثالا الذي إسكات العين تصبغ الجينات البيضاء في الأجنة. بالإضافة إلى ذلك ، نصف مثالًا تم فيه إسكات اللاكليهالجيني للدباغة2(lac2) خلال كل من اليرقات الثانية (للتأثير على يرقات اليرقات الثالثة من النجوم) وstar اليرقات الثالثة (للتأثير على البالغين). وأخيراً، نثبت أن حقن تركيز أقل من الـ dsRNA يؤدي إلى ضربة قاضية جزئية، مما يدل على أن هذه التقنية يمكن تطبيقها أيضًا على الجينات التي من المعروف أن فقدان الوظيفة فيها قاتل.
Protocol
1. RNA العزلة والتجمع دي نوفو transcriptome
- تنفيذ عزل RNA الكلي من المرحلة الثالثة المتأخرة في الغوص الغوص أنابيب العين الخنافس والخنافس الكبار باستخدام RNA عزل عدة (انظر جدول المواد)التي تم تصميمها للأنسجة الغنية بالدهون. عزل مجموع RNA من T. marmoratus وتسلسل ذلك بعد الأساليب الموصوفة سابقا18.
- دي نوفو نص الجمعية
ملاحظة: لتجميع نسخة دي نوفو، يمكن استخدام منصات المعلوماتية الحيوية المختلفة (انظر جدول المواد). هذه الأنظمة الأساسية متوفرة تجارياً وفي بعض الحالات، موجودة كـ البرامج النصية سطر الأوامر المستندة إلى Unix. منذ الجمعية هو دي نوفو، فمن المستحسن لتجميع transcriptomes بشكل مستقل على اثنين من المنصات ومقارنة النتائج لاستبعاد ايجابيات كاذبة أو السلبيات كاذبة.- لبدء تجميع transcriptomes ، تحميل يقرأ الخام على منصة المعلوماتية الحيوية المعنية.
ملاحظة: هذه الملفات عادةً مضغوط و في تنسيق FASTQSANGER. Gz. لا توجد حاجة إلى إلغاء ضغط الملفات كما يتم قبول هذا التنسيق في الخطوة التالية. - باستخدام خط الأوامر التشرمى، قم بتشذيب القراءة الأولية لإزالة تسلسلات المحول أو القراءات القصيرة التي تقع تحت العتبة الافتراضية. فك ضغط يقرأ الخام قلصت؛ الملفات الآن سيكون في تنسيق FASTQ. قم بسلسلة القراءة الخام FASTQ لكل عينة للحصول على الملفات التي هي جاهزة لتجميع de novo.
- تجميع الخام متسلسلة يقرأ دي نوفو باستخدام أي نص سطر الأوامر التي يمكن تجميع transcriptomes دي نوفو. حفظ transcriptome تجميعها، والتي سيكون لها الآن قائمة contigs مع تسلسل كل منها، كملف FASTA. لزيادة تغطية التجميع ، والجمع بين وتجميع نسخ متعددة لنفس الأنواع.
ملاحظة: هذه العملية يزيد من فرص إنشاء contigs أكثر دقة و important خاصة إذا كان عدد نسخ منخفضة الجينات من الفائدة. - مرة واحدة تجميعها، وتقييم نسخة للاكتمال عن طريق حساب درجات التغطية (برنامج تقييم التغطية متاح مجانا، انظر جدول المواد).
ملاحظة: يعتبر نسخة مع درجة تغطية > 75٪ جيدة. ومع ذلك ، فإن أهمية هذه النتيجة تعتمد على سبب توليد النسخ. على سبيل المثال، إذا كان يتم استخدام نسخة لتحديد الجينات عدد نسخة منخفضة، ثم درجة > 85٪ هو أفضل، لأنه يدل على تغطية أكبر. - قم بـتشير نسخة دي نوفو المجمعة باستخدام أداة بحث محاذاة محلية أساسية (BLAST؛ انظر جدول المواد).
ملاحظة: لهذه التجربة، تم تعليق النص في المقام الأول ضد قاعدة بيانات من البروتينات Drosophila المعروفة وقاعدة بيانات من البروتينات الخنفساء المعروفة. يمكن تحميل قائمة التعليقات التوضيحية كملف جدول بيانات ويمكن تنزيل contig/contigs التي تشير إلى تشابه التسلسل مع بروتينات الكائنات الأخرى كملف FASTA. - تحديد عدد contig / أرقام البروتين من الفائدة واستخراج تسلسل النيوكليوتيدات. استخدم BLAST لتحديد ما إذا كانت المناطق المحفوظة الخاصة بالبروتين (مثل مجالات الصندوق المُعَمّم) موجودة في تسلسل الاهتمام بالنيوكليوتيدات المشروحة. تحقق contigs الأخرى مع نفس التعليق التوضيحي لتداخلات تسلسل النيوكليوتيدات لتوليد تسلسل نسخة خاصة بالجينات.
ملاحظة: لا يكون تحديد contigs مع تداخل التسلسل ممكنًا عادةً لجميع الجينات، خاصة بالنسبة للجينات ذات العدد المنخفض. - إذا كان هناك حاجة إلى تسلسل كامل طول الجين، تبدأ contig التي لديها أعلى تشابه تسلسل كنقطة بدء لتحديد تسلسل النوكليوتيدات من النص ناضجة كله باستخدام تقنيات مثل 3' و 5' التضخيم السريع للغات cDNA(19).
- قم بـتشير التجميع الذي تم الحصول عليه من النظام الأساسي الثاني باتباع الخطوات 1.2.4-1.2.7.
ملاحظة: من الناحية المثالية، ينبغي أن تكون النتائج مماثلة للبروتينات ذات الأهمية؛ ومع ذلك، يمكن أن تختلف التغطية بين الأنظمة الأساسية إلى حد ما. - استخدم النص المُجمَّع لتجميع الـ dsRNA الخاصة بالأنواع على النحو المبين في القسم 2.
- لبدء تجميع transcriptomes ، تحميل يقرأ الخام على منصة المعلوماتية الحيوية المعنية.
2. الاستنساخ والمورثات محددة التوليف DSRNA
ملاحظة: وقد وصفت الجينات الخاصة الاستنساخ والتوليف DSRNA بالتفصيل ل ت. كاستانيوم20,21,22. الخطوات التالية هي نظرة عامة موجزة.
- الاستنساخ، والتحول البكتيري، وتسلسل البلازميد
- عزل مجموع RNA من الكائن الحي (كما هو موضح في الخطوة 1.1) وإنشاء الحمض النووي التكميلي (cDNA) باستخدام مجموعة النسخ العكسي (انظر جدول المواد). تحديد واحد أو اثنين من 100-1000 bp تسلسل النيوكليوتيدات من contigs التي هي محددة للجينات ذات الاهتمام.
- تصميم أزواج التمهيدية التي تمتد على امتداد كامل المحدد من النيوكليوتيدات وتضخيم التسلسل من خلال تفاعل سلسلة البوليميراز (PCR). إضافة خطوة إضافية 30 دقيقة في نهاية لإنشاء 3'adenine تتراكم في المنتج الحمض النووي تضخيم. تنقية هذا المنتج باستخدام مجموعة تنقية PCR (انظر جدول المواد).
- استنساخ المنتج المنقى في ناقلات pCR4-TOPO plasmid (انظر جدول المواد)بعد بروتوكول البائع المقدمة مع مجموعة الاستنساخ. باستخدام العلاج بالصدمات الحرارية تحويل البلازميد المستنسخة إلى الخلايا البكتيرية المختصة (سلالة: E.coli DH10B) بعد بروتوكول البائع للخلايا المختصة (انظر جدول المواد)،وشاشة للخلايا المحولة بنجاح.
ملاحظة: يمكن لف اللوحات ذات المستعمرات في فيلم البارافين للاحتفاظ بالرطوبة وتخزينها عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد. - اختيار مستعمرات من الخلايا المحولة باستخدام 10 ميكرولتر ماصة تلميح والثقافة في مرق lysogeny (رطل) التي تحتوي على أمبيسيلين (50 ميكروغرام / مل) في حاضنة شاكر في 37 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة لمدة 24 ساعة.
ملاحظة: بالنسبة للتخزين على المدى الطويل، يمكن تخفيف الخلايا المستزرعة 1:1 مع 100٪ الجلسرين وتجميدها في -80 درجة مئوية كمخزونات الجلسرين. - عزل plasmids التي تحتوي على جين من الفائدة من هذه الثقافة باستخدام مجموعة عزل miniprep (انظر جدول المواد). تخزين plasmids معزولة (minipreps) في -20 درجة مئوية بعد تقييم العائد الطيفي. على وجه التحديد، قياس امتصاص العينة في 260 نانومتر، 280 نانومتر و 230 نانومتر. حساب النسب A260/A280 لتحديد الحمض النووي، و A260/A230 لتحديد نقاء الحمض النووي.
ملاحظة: نسبة 260/280 1.8 مقبولة عموماً كحمض نووي نقي بما فيه الكفاية، وتشير النسب الأقل من 1.5 إلى وجود الكواشف المتبقية مثل الفينول. وينبغي أن تكون نسبة 260/230 أكبر من نسبة 260/280 أو تساويها. وتشير النسب المنخفضة إلى التلوث المتبقي بالكاشف. ويتراوح العائد عادة بين 100 و500 نانوغرام/ميكرولتر. - تسلسل minipreps معزولة لتأكيد أن جزء الجينات الخاصة قد تم دمجها بنجاح, يجري يحيط بين 5' T7 و 3' T3 المروج المناطق في البلازميد; ويمكن القيام بذلك باستخدام T7 العالمي و T3 التمهيدي تسلسل22. استخدام minipreps مع تسلسل الجينات الخاصة من الفائدة لإعداد DSRNA.
- عزل مجموع RNA من الكائن الحي (كما هو موضح في الخطوة 1.1) وإنشاء الحمض النووي التكميلي (cDNA) باستخدام مجموعة النسخ العكسي (انظر جدول المواد). تحديد واحد أو اثنين من 100-1000 bp تسلسل النيوكليوتيدات من contigs التي هي محددة للجينات ذات الاهتمام.
- تضخيم PCR وفي المختبر التوليف DSRNA
- تضخيم PCR وتنقية المنتج
- تصميم البلازميد محددة أو الزهدّانات الخاصة بالجينات التي لديها تسلسل المروج T7 على جانبها 5 '(انظر المرجع22 للحصول على التفاصيل) لتضخيم جزء خطي من الجين إدراجها. تحسين العائد من خلال إعداد ما لا يقل عن 10 ردود فعل من 20 ميكرولتر لكل منهما.
ملاحظة: يحيط المنتج الناتج من قبل اثنين من 20 bp T7 مواقع البوليميراز ملزمة. - تنقية المنتج PCR باستخدام مجموعة تنقية المنتج PCR (انظر جدول المواد)،بعد بروتوكول elution القائم على عمود المورد. لزيادة العائد، كرر الخطوة elution النهائي تصل إلى 3 مرات مع نفس eluent. تقييم العائد الطيفي بشكل مطي.
ملاحظة: يتراوح العائد عادة من 100 إلى 700 نانوغرام/ميكرولتر. يمكن تخزين هذا المنتج النقي في -20 درجة مئوية حتى مزيد من الاستخدام.
- تصميم البلازميد محددة أو الزهدّانات الخاصة بالجينات التي لديها تسلسل المروج T7 على جانبها 5 '(انظر المرجع22 للحصول على التفاصيل) لتضخيم جزء خطي من الجين إدراجها. تحسين العائد من خلال إعداد ما لا يقل عن 10 ردود فعل من 20 ميكرولتر لكل منهما.
- في المختبر dsRNA التوليف وتنقية
- استخدام الجينات محددة PCR المنتج تنقية لتجميع dsRNA في المختبر وفقا لبروتوكول مجموعة التوليف DSRNA الاختيار. إذا لزم الأمر، تمديد وقت الحضانة لزيادة إنتاج DSRNA.
- تقييم تطور التفاعل على أساس عتامة خليط التفاعل (كلما كانت كمية منتج DSRNA أكبر ، كلما ارتفعت التعكر). في نهاية الحضانة، ووقف رد الفعل باستخدام العلاج DNase. للقيام بذلك إضافة 1 μL من مخزون من 2 U / μL، إلى خليط التفاعل. توسيع نطاق هذا العلاج إلى 1-2 ساعة لضمان التدهور الأمثل للحمض النووي قالب.
- تنقية dsRNA مع مجموعة تنقية أو عن طريق الخطوات التالية.
- تخفيف المنتج الناتج مع 115 ميكرولتر من المياه الخالية من النوى وإضافة 15 ميكرولتر من خلات الصوديوم 3 م. إضافة 2 مجلدات من الجليد الباردة 100٪ الإيثانول إلى هذا التفاعل الخليط ويعجل DSRNA بين عشية وضحاها في -20 درجة مئوية.
ملاحظة: في هذه المرحلة، يمكن تخزين العينات بأمان دون التأثير على العائد النهائي. - الطرد المركزي راسب في 0 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة في 9000 × ز والتخلص من افرط. غسل المنتج مرة واحدة مع الجليد الباردة 70٪ الإيثانول والطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 13000 × ز.
- إزالة عظمى والهواء الجاف بيليه لمدة 5-15 دقيقة. Resuspend بيليه في ما يصل إلى 40 ميكرولتر من المياه الخالية من النوى (يمكن تعديل هذا الحجم على أساس حجم بيليه معزولة) وتقييم العائد والنقاء الطيفي، كما هو موضح في 2.1.4.
- تخزين الـ dsRNA المنقى عند -20 درجة مئوية حتى الاستخدام الإضافي. استخدام dsRNA تنقية للحقن في مرحلة النمو المطلوب.
- تخفيف المنتج الناتج مع 115 ميكرولتر من المياه الخالية من النوى وإضافة 15 ميكرولتر من خلات الصوديوم 3 م. إضافة 2 مجلدات من الجليد الباردة 100٪ الإيثانول إلى هذا التفاعل الخليط ويعجل DSRNA بين عشية وضحاها في -20 درجة مئوية.
- تضخيم PCR وتنقية المنتج
3. جمع وإعداد مبكرة في مرحلة T. marmoratus الأجنة لحقن DSRNA
- إعداد لوحة agarose لاحتضان الأجنة T. marmoratus.
- أولاً، قم بإذابة 20 ملغ من مسحوق agarose منخفض الذوبان في 100 مل من الماء المقطر (2٪ agarose) ثم قم بغلي هذا الخليط في ميكروويف حتى يتم الحصول على حل واضح. رعاية مع الحل الساخن، كما يمكن أن تسبب فقاعات الهواء إلى تجاوز.
- Dispense هذا الحل في طبق بيتري الصغيرة. لجعل الأخانق (التي سوف تعقد الأجنة) على سطح لوحة agarose، ضع ثلاثة أنابيب بلاستيكية واسعة 1-2 مم (مثل نصائح من الماصات نقل البلاستيك) على سطح agarose السائل قبل أن يقوي.
- مرة واحدة في agarose يتجمد، واستخدام زوج من ملقط حادة لإزالة هذه الأنابيب. أضف 500 ميكرولتر من الماء المقطر المقطّر باستخدام p1000 micropette لتغطية هذه المسافات البادئة في الأغاروز.
- باستخدام فرشاة الشعر الطبيعي غرامة، وجمع الأجنة T. marmoratus التي هي 5-8 ساعة من مواقع تعشيش الخنفساء في طبق تجويف زجاجي مليئة بالماء المقطر autoclaved. مراقبة مواقع التعشيش بشكل متكرر لضمان أن البيض الذي تم الحصول عليه هو من العمر المناسب.
- dechorionate الأجنة تحت منظار مجسم باستخدام ملقط تشريح غرامة. للقيام بذلك، تصور المشيم تحت المجهر (في التكبير المطلوب) عن طريق وضع مصدر الضوء في زاوية مناسبة، ثم الاستيلاء على المشيم من جانبين مع ملقط حادة، مزق فتحه، وشريحة بلطف الجنين. كما أن هناك طبقتين، تأكد من أن يتم إزالة كل منهما.
- باستخدام فرشاة طلاء الشعر الطبيعي الدقيق، نقل بعناية الأجنة من طبق تجويف الزجاج إلى لوحة agarose وترتيبها في الأخادق تحت منظار مجسم. توخي الحذر الشديد خلال هذه العملية، حيث أن الأجنة المُهشمة هشة للغاية. استخدم الأجنة المعدة لحقن الـ dsRNA.
ملاحظة: الطرف الأكثر سمكاً قليلاً هو جانب الجنين الذي سيتطور فيه الرأس.
4. dsRNA الحقن المجهري في مرحلة مبكرة T. مارمراتوس الأجنة
- لحقن الأجنة مرحلة مبكرة مع جين محدد dsRNA، وإعداد الحقن المجهري الإبر باستخدام سحب إبرة الحقن المجهري (انظر جدول المواد). أثناء تصور طرف الإبرة تحت منظار مجسم، استخدم زوجًا من ملقط ناعم لكسر طرف الإبرة، مما يخلق حافة حادة. من الناحية المثالية، كسر طرف الإبرة قطريا بحيث تبقى حافة أكثر وضوحا على جانب واحد، والتي سوف تسمح لها بدخول الجنين مع التسبب في الحد الأدنى من الإصابات.
- اذيب محلول الأسهم المنقاة dsRNA على الجليد ، أضف 1 ميكرولتر من مخزن الحقن 10x وأغلى مع الماء المقطر المزدوج ، لجعل 10 ميكرولتر من محلول الحقن. للحقن، وتركيز DSRNA من 1 ميكروغرام/ميكرولتر عادة ما يكون مناسبة ولكن يمكن تعديلها وفقا لشدة الظاهريات من الحيوانات الناتجة).
ملاحظة: إعداد 1 مل من 10x حقن العازلة22 عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من 0.1 M العازلة فوسفات الصوديوم (التي أدلى بها خلط 8.5 مل من 1 M Na2HPO4 و 1.5 مل من 1 1 M NaH2PO4 تعديل إلى درجة 7.6 درجة مئوية في 25 درجة مئوية مع 100 ميكرولتر من 0.5 كيلولتر), 100 ميكرولتر من صبغة الطعام و 790 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج.- باستخدام ماصة P10، ردم إبرة الحقن المجهري مع حل dsRNA العمل. بمجرد أن يملأ الحل طرف الإبرة ، قم بإرفاقها بصاحب microneedle متصل بنظام الحقن المجهري الذي يستخدم تقنية طرد الضغط (انظر جدول المواد).
- بدوره على نظام الحقن المجهري وإمدادات الهواء المضغوط. باستخدام microvalve على نظام الحقن المجهري، وضبط ضغط الحقن إلى 15 psi. ضبط مدة الحقن باستخدام مقبض الوقت التكيف (تعيينها إلى "ثانية").
- كما مدة الحقن يعتمد على حجم الحقن المطلوبة, إذا لزم الأمر, ضبط هذه المعلمة على نظام الحقن المجهري قبل كل حقن. استخدم حجم حقن من 1-2 nL في مرحلة مبكرة من الأجنة T. marmoratus.
ملاحظة: تميل أحجام الحقن الأعلى إلى التداخل مع معدل بقاء الجنين.
- كما مدة الحقن يعتمد على حجم الحقن المطلوبة, إذا لزم الأمر, ضبط هذه المعلمة على نظام الحقن المجهري قبل كل حقن. استخدم حجم حقن من 1-2 nL في مرحلة مبكرة من الأجنة T. marmoratus.
- لقياس حجم السائل الحقن التي يتم الاستغناء عنها بواسطة نظام الحقن المجهري، ومعايرة حقن إبرة من خلال تقييم حجم فقاعة السوائل التي يتم تشكيلها في طرف الإبرة عند الحقن في الهواء. بالنسبة للجنين T. marmoratus، استخدم حجم فقاعة مثالي من 100-200 ميكرومتر. إبرة الحقن هي ذات نوعية جيدة إذا كان هذا يمكن أن يتحقق في 15 psi مع مدة حقن من ~ 3 s.
- محاذاة الإبرة ولوحة الأاروز التي تحتوي على الأجنة تحت منظار مجسم، بحيث تقترب الإبرة من الأجنة بزاوية تتراوح بين 45 و60 درجة.
- باستخدام ميكرومانبولاتور، نقل microneedle ببطء مع رصد التقدم المحرز من خلال منظار المجسم. بمجرد أن يلمس طرف الإبرة سطح الجنين ، حرّك الإبرة بعناية إلى الأمام حتى تخترق سطح الجنين. لا تثقيب الجنين بعمق مع طرف إبرة لأن هذا يمكن أن يؤثر على بقاء الجنين. للحد من التباين، تسليم الحقن في منتصف الجنين.
- بمجرد أن تكون الإبرة داخل الجنين ، اضغط بعناية على زر الحقن في الحقن الدقيق لتسليم جرعة من dsRNA إلى الجنين. بعد حقن 1-2 nL من الـ dsRNA، اسحب الإبرة ببطء من الجنين، بحيث لا تتسبب في تمزق الجنين.
- حقن الأجنة الأخرى بطريقة مماثلة. إذا أصبحت إبرة الحقن المجهري مسدودة أثناء الإجراء ، فكّر عن طريق زيادة ضغط الحقن ومدته. بصريا تحديد الأجنة حقن بنجاح عن طريق وجود بقعة ملونة في موقع الحقن (منذ العازل حقن يحتوي على تلوين الغذاء).
- ضع الطبق بعناية مع الأجنة المحقونة في غرفة الرطوبة.
- لبناء مثل هذه الغرفة، واتخاذ أي مربع من البلاستيك مع غطاء، تعقيم مع 70٪ الإيثانول، والسماح لها لتجف، ووضع الأنسجة غارقة في الماء autoclaved في الجزء السفلي لتوفير بيئة رطبة. ضع غرفة الرطوبة هذه في حاضنة مع درجة حرارة مناسبة (في هذه الحالة، 25 درجة مئوية) ودورة خفيفة من 14 ساعة خفيفة و 10 ساعة داكنة.
- السماح للأجنة المحقونة بالتطور إلى يرقات أول نجم، الأمر الذي يتطلب 4-5 أيام. مراقبة تقدم تطور الجنين يوميا باستخدام منظار مجسم لتحديد الأنماط الظاهرية الناهية المرئية بشكل رففولوجي كما هو مبين في الشكل 2.
- توثيق هذا التقدم من خلال التقاط الصور الرقمية باستخدام كاميرا عالية الدقة. إزالة الأجنة الميتة وتجديد المياه على صفيحة الأاغوروز يوميا لتجنب جفاف والانتشار المحتمل للتلوث الميكروبي إلى الأجنة الأخرى الباقية خلال فترة الحضانة.
- تنفيذ الضوابط المناسبة لحقن dsRNA، بما في ذلك الحقن العازلة، وحقن من dsRNA توليفها ضد حبلا الإحساس من الجين من الفائدة، وحقن من dsRNA توليفها ضد تسلسل التي لا وجود لها داخل الكائن الحي الهدف. تأكيد RNAi الضربة القاضية باستخدام أساليب جزيئية إضافية22.
5. إعداد يرقات T. marmoratus لحقن DSRNA
ملاحظة: على عكس الأجنة في المراحل المبكرة، فإن يرقات T. marmoratus قوية نسبيًا ويمكن حقنها بكميات أكبر. على سبيل المثال، يمكن حقن إنستارات الثانية مع ما يصل إلى 2 ميكرولتر من محلول عمل DSRNA والثالث مع ما لا يقل عن 3 ميكرولتر دون آثار سلبية ملحوظة على معدل البقاء على قيد الحياة. لحقن dsRNA ، من المفيد شل حركة اليرقات عن طريق تضمينها في agarose.
- قبل جمع اليرقات، تذوب 2٪ agarose والاحتفاظ بها في حمام مائي في 60-70 درجة مئوية للحفاظ عليه في شكل سائل. إعداد طبق شل عن طريق صب ذاب 2٪ agarose في طبق بيتري صغيرة ومن ثم التبريد حتى تتوطد. استخدام ملقط حادة لجعل الأخدود الضحلة في لوحة agarose (تقريبا حجم المفصلي لتكون جزءا لا يتجزأ) لكل التي سيتم حقنها.
- جمع اليرقات الصغيرة في المرحلة التنموية المناسبة (مرحلة واحدة قبل المرحلة المطلوبة للتحليل). للقيام بذلك ، استنزف بعناية المياه من أكواب الثقافة التي تحتوي على اليرقات واتبع الخطوات المذكورة أدناه.
- تخدير على الجليد (اختيار بعناية اليرقة من كوب الماء ووضعها بلطف على الجليد) حتى تظهر اليرقة أي تحركات ملحوظة. استخدم ملقطًا حادة وناعمة النهاية لرفع اليرقة بعناية من الجليد ووضعها على مرحلة الجمود مع رقبتها وجسدها في الأخدود ولكن ذيلها يقع فوق سطح agarose بحيث لا يتم تغطيتها ، مما يسمح لليرقة بمواصلة التنفس من خلال ذيلها spiracles.
- غطي اليرقة بطبقة سميكة من الأاروز التي لا تزال سائلة ولكنها ليست ساخنة بشكل خطير. إذا كان مغطى بطريق الخطأ، استخدم ملقط لتحرير الذيل والشرائح اثنين تحته من agarose. مرة واحدة agarose يتجمد، واستخدام اليرقة لحقن dsRNA.
6. dsRNA الحقن المجهري في يرقات T. marmoratus
- إعداد والردم إبرة الحقن المجهري مع الكمية المطلوبة من الجينات محددة DSRNA حل العمل (كما هو موضح في الخطوات 4.1-4.2). إرفاق الإبرة إلى حامل إبرة متصلة حقنة الحقن المجهرية التي يتم التحكم فيها يدويًا. قبل إرفاق الإبرة، سحب المكبس حقنة على طول الطريق لتجنب نفاد ضغط الحقن منتصف العملية.
- ضع اليرقات المُشلّة بحيث يكون موقع الحقن، الذي يقع على نحو دوري بين شطريات الجسم الثالث والرابع، متحاذياً مسار إبرة الحقن المجهري بزاوية مسطحة نسبيًا (موازية تقريبًا للمرحلة).
ملاحظة: من المهم صيد الإبرة واليرقة في هذا الموقف ، لأنه يوفر مسار أقل مقاومة لتلميح الإبرة لثقب اليرقات بأقل ضرر. - بمجرد وضع الإبرة واليرقة ، قم بتحريك طرف الإبرة بعناية إلى اليرقة باستخدام المايكروmanipulator أثناء مراقبة التقدم من خلال منظار مجسم.
- بعد أن يثقب طرف الأنسجة، ببطء وبعناية تطبيق الضغط على حقنة. ضبط ضغط الحقن عن طريق مراقبة حركة السوائل حقن الملونة في الإبرة تحت المجهر.
- سحب الإبرة بعناية بعد الحقن. استخدام ملقط لينة لتقشر بعيدا وبالتالي تحرير اليرقة من agarose. نقل اليرقة مرة أخرى إلى وعاء مع الماء (في درجة حرارة الغرفة) والسماح لها بمزيد من التطور في حاضنة أو غرفة الثقافة في 25\u201228 درجة مئوية ودورة خفيفة من 14 ساعة ضوء و 10 ح الظلام.
- استخدام الحقن التحكم المناسبة والكمية الضربة القاضية، كما هو موضح في الخطوة 4.10.
Representative Results
باستخدام البروتوكول المذكور أعلاه، نحن هدمت ثلاثة جينات مختلفة، وهي الأبيض، laccase2 (lac2)، و Lens3 (الجدول 1)، في مجموعة متنوعة من المراحل التنموية المختلفة من Sunburst الغوص بيتل T. marmoratus. قمنا بإجراء RNAi في T. marmoratus عن طريق حقن DSRNA في مرحلة مبكرة جدا أثناء تكوين الجنين(الشكل 1A). كما أن بعض الأجنة لا البقاء على قيد الحياة في هذه العملية وتحول إلى نخر(الشكل 1B)،فإنها تحتاج إلى إزالة للحفاظ على الأجنة المتبقية صحية. وتتمثل هنا في حقن DSRNA ضد الجين الأبيض. ومن المعروف جيدا هذا الجين في Drosophila باعتبارها واحدة من ثلاثة ATP ملزمة كاسيت (ABC) الناقلين المشاركة في امتصاص وتخزين السلائف من صبغة العين23. وفقا لذلك، يؤدي فقدان وظيفته في نمط ظاهري غير مبيض للعين البيضاء. تظهر نتائجنا أن حقن dsRNA التي تستهدف الجين الأبيض المتعمّم في أجنة T. marmoratus تؤدي إلى فقدان تصبغ العين في اليرقات الناشئة حديثًا. في هذه الحالة ، تتميز يرقات النوع البري بعيون مصطبغة بشدة ، ويؤدي الضربة القاضية RNAi من الأبيض إلى مستويات مختلفة من الحد وحتى القضاء الكامل على صبغة العين. عموما، لاحظنا على الأقل بعض الانخفاض في تلوين العين في 34٪ من الأجنة على قيد الحياة (ن = 35). الشكل 2A يقارن الفرد التحكم وفرد مع لون العين أخف قليلا. يوضح الشكل 2B ضربة قاضية أكثر شدة في الفرد ، حيث تكون العيون البطنية (العيون 2-5) من المجموعة غير محمصة تمامًا ، في حين أن العيون الظهرية لا تزال تظهر بعض التصبغ. هذه الاختلافات تسلط الضوء على كيفية كفاءة الضربة القاضية يمكن أن تختلف إقليميا، والتي ربما ترتبط الاختلافات في فعالية اختراق DSRNA في الأنسجة الكثيفة. يظهر فرد آخر أساسا فقدان الصباغ كاملة في جميع العيون (الشكل 2C).
للتحقيق في كيفية عمل RNAi بشكل جيد في مرحلة اليرقات من T. marmoratus، قمنا بحقن dsRNA استهداف الجين التانيك lac2 في ثاني يرقات instar قبل أيام قليلة من ذلك كان من المقرر أن تُولى إلى النجوم الثالثة (الشكل 3) وقيّمنا التأثير على التلوين الوَتَرَوي لليرقات الثالثة. Lac2 هو نوع من الفينولوكسيديز أنريكسي conjugates البروتينات لجعلها غير قابلة للذوبان، أصعب، وأكثر قتامة. وقد ثبت ضربة قاضية في خنفساء الدقيق T. castaneum أن يؤدي إلى الأفراد الملونة أخف وزنا في جرعات منخفضة ولكن يعتبر قاتلا في جرعات عالية24. يوضح الشكل 4 أن هذا العلاج يؤدي أيضًا إلى يرقات خنفساء الغوص الخفيفة ذات الألوان السونبورست. على وجه التحديد ، في هذه التجربة ، كان 75 ٪ من اليرقات المحقونة الباقية (ن = 12) قد خفضت التصبغ (مقارنة مع 0 ٪ في المجموعة الخاضعة للسيطرة). ويبين الشكل 4A شخص مع التصبغ خفيفة نسبيا، في حين أن الشكل 4C يوضح رأس يرقة T. marmoratus التي التلوين الداكن من بشرة غائبة تقريبا. وكان التصبغ واضحا بشكل خاص للنقش المظلم المركزي الذي هو نموذجي لهذه اليرقات، في حين ظل هذا النمط واضح للعيان في الفرد الذي حقنه التحكم(الشكل 4B). وبالإضافة إلى ذلك، لوحظ تفتيح من القصبة الهوائية الذيل، كما هو مبين في الشكل 4D. في حالة حقن lac2 dsRNA في يرقات الثالث ، تم الحصول على أفراد بالغين أخف (الشكل 5). لاحظ أن أجنحة خنفساء الضربة القاضية مشوهة إلى حد ما ، على الأرجح بسبب نعومتها غير العادية.
بالإضافة إلى تغيير الصفات المورفولوجية، من الممكن استخدام RNAi لاستهداف الجينات التي تؤثر على السلوك. لإثبات ذلك، قمنا بإجراء RNAi ضد جين رئيسي لتكويد البروتينات العدسة، Lens318، وحقنه في يرقات ثانية للتأثير على الخصائص البصرية للعيون اليرقات النجمية الثالثة. أي آثار على العدسة لوحظ هنا من المرجح لأن عيون اليرقات T. marmoratus الخضوع لنمو العين الرئيسية في هذا التحول، والذي ينطوي أيضا على تغييرات بصرية كبيرة من العدسة25. وكان RNAi الضربة القاضية في هذه التجربة كفاءة عالية. وأظهر التحقق من خلال qPCR نسبة نجاح 100 ٪؛ من أصل 13 فردًا تم اختبارهم ، تم هدم 12 شخصًا إلى أقل من 10٪ من مستوى التعبير للأفراد ، مع وجود مستوى تعبير 17 ٪ من مستوى التحكم (الملاحظة غير المنشورة). على مستوى الظاهرة ، كان بعض الأفراد فقط معاقين بشدة أو غير قادرين على التقاط الفريسة ، كما هو موضح في الشكل 6 للفرد الذي اقترب مرارا وتكرارا من فريسته من مسافة قريبة جدا ولكن باستمرار تجاوزها.
الجدول 1: تسلسل التمهيدي و amplicons للبروتينات البيضاء، lac2، و Lens3. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الجدول.
الشكل 1: توضيح لحقن الجنين. أ)أجنة مُمْثّلة مُبطلة الصُطف على صفيحة أغاروز وحقنَت بالقرب من مركزها باستخدام إبرة الحقن المجهري المليئة بـ dsRNA ومخزن الحقن المحتوي على صبغة غذائية. شريط مقياس يمثل 500 ميكرومتر. (ب) فرد مع ضربة قاضية أكثر شدة. يتم الاحتفاظ بالأجنة المحقونة في غرفة الرطوبة ويتم مراقبتها يوميًا لتسجيل الأنماط الظاهرية وإزالة الأفراد الموتى (التي تتحول إلى اللون البني). شريط مقياس يمثل 5 ملم.
الشكل 2: مثال للأجنة المتطورة بالكامل التي تم حقنها بـ dsRNA ضد الأبيض. (A) مقارنة الفرد مع انخفاض في تصبغ العين (يسار) وفرد حقن التحكم (يمين). E1 -E6 الرجوع إلى عيون 1-6. (ب) فرد مع نمط ظاهري أكثر شدة الضربة القاضية، والذي يوضح أنه في بعض الأحيان، بعض من العيون داخل الكتلة تتأثر بشدة من ضربة قاضية من غيرها. (C) الفرد مع فقدان كامل تقريبا من تصبغ العين. شريط مقياس يمثل 200 μm; واللّجَاقط باء وجيم مُمثَّلون بنفس النطاق. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: توضيح لحقن اليرقات. A)العديد من اليرقات التي شلت عن طريق تضمين في agarose 2٪ مع spiracles ذيلها تركت واضحة من أي agarose. (B) Microelectrode التي تحتوي على محلول الحقن وضعت بحيث يمكن أن تخترق طرفه الغشاء الدقيق بين جزأين. (C) صبغة حقن زرقاء مرئية في موقع الحقن بعد الحقن. تمثل أشرطة المقياس 1 سم.
الشكل 4: تطبيق RNAi لل laccase2 على يرقات الثانية من النجوم مما أدى إلى انخفاض تلوين بشرة في يرقات النجوم الثالثة. (A)خسارة خفيفة نسبيا من تلوين في lac2 RNAi الفردية (أسفل) بالمقارنة مع فرد التحكم في حقن (أعلى). شريط مقياس يمثل 5 مم (ب) رئيس فرد التحكم تظهر نمط اللون الداكن المميز في وسط الرأس. (C) ضربة قاضية شديدة نسبيا من lac2 مما يؤدي إلى فقدان كامل تقريبا من تلوين الرأس المركزي. (D) فقدان تلوين في بشرة ذيل الرئيسية من lac2 RNAi الفردية (أسفل) بالمقارنة مع الفرد التحكم في حقن (أعلى). تمثل أشرطة المقياس في B\u2012D 1 مم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تطبيق RNAi لل laccase2 على يرقة ثالثة في النجوم مما أدى إلى انخفاض تلوين بشرة في شخص بالغ. يتميز الفرد ضربة قاضية (يسار) أيضا من قبل elytra لينة جدا بالمقارنة مع عنصر التحكم (يمين). شريط مقياس يمثل 5 ملم.
الشكل 6: ضربة قاضية من بروتين العدسة الرئيسية مما يؤدي إلى أوجه القصور في التقاط فريسة. (أ– ج). ثلاثة أمثلة حيث الغوص Sunburst يرقات الخنفساء ، والتي تم فيها حث العجز البصري من خلال RNAi ، لم يتمكن من التقاط فريسة (يرقات البعوض). تم اختيار الصور الثابتة التمثيلية من تسجيل فيديو لـ Preys المميزة. (D) السيطرة على اليرقة اصطياد فريسة. جميع أشرطة مقياس تمثل 2 سم.
Discussion
هدفنا هو أن هذا التجميع من الأساليب سيجعل RNAi متاحة على نطاق واسع ، خاصة وأن هذه الأداة لا تزال تقنية تآزرية قوية لتحرير الجينات CRISPR / Cas9 ، مع ميزة أنه يمكن تطبيقها على المراحل التنموية المطلوبة من الكائنات الحية المدروسة. ولمثل هذه القوة، حقننا الـ(ديسرنا) في الأجنة وفي مراحل يرقات مختلفة. أثرت الحقن في البيض على نمو الأجنة (الشكل 2)، وكان للحقن في مرحلة اليرقات الثانية آثار واضحة على المرحلة الثالثة من اليرقات(الشكل 4 والشكل 6)، وأظهرت الحقن في مرحلة اليرقات الثالثة آثارًا في البالغين (الشكل 5). في حين أن التوقيت الدقيق يجب أن يحدد تجريبيا, عموما, الحقن نافذة المفعول في غضون أيام قليلة. يمكن أن يتأثر نجاح هذه العملية بطول تسلسل DSRNA. هنا، عرضنا أمثلة باستخدام ما يزيد قليلا على 200 نقطة بريتيش بتروليوم إلى أكثر من 800 نقطة بريتيش بتروليوم. كقاعدة عامة، يتم تفضيل تسلسل بين 100 و 600 BP للحد من الآثار خارج الهدف، ولكن تسلسل يصل إلى 1000 bp العائد نتائج جيدة22. سؤال واحد فيما يتعلق RNAi هو مدة الضربة القاضية التي يمكن تحقيقها من خلال هذه التقنية. وبما أن الأنماط الظاهرية كانت نهائية في كل مرحلة، لا يمكننا التعليق على هذه المسألة بناءً على النتائج التي تم عرضها. ومع ذلك، فقد سبق أن لوحظ أن آثار RNAi عموما عمر طويل نسبيا، وأن تركيزات أعلى تؤدي إلى الضربات الهزية أطول أمدا20.
أحد القيود على هذه التقنية هو أنه يعمل بشكل أفضل لبعض الكائنات الحية من غيرها ، ويبدو أنه لا توجد طريقة مباشرة للتنبؤ بمدى نجاحها. ومع ذلك، فقد تبين أن العمل جيد بالنسبة لمجموعة كبيرة من الكائنات الحية المختلفة. داخل المفصليات ، وهذا يشمل arachnids26، القشريات27، ومجموعة متنوعة من الحشرات ، مع معدلات نجاح عالية بشكل خاص في الخنافس28. وهناك تعقيد آخر هو أن الاختلافات في شدة النمط الظاهري غالبا ما تحدث بين الأفراد على الرغم من تطبيق نفس الكمية من dsRNA. كما هو موضح في الشكل 2B، يمكن أن يحدث حتى الاختلاف داخل الفرد. في دراساتنا RNAi التي تستهدف جينات مختلفة تشارك في تطوير العين اليرقات T. marmoratus ، وجدنا في كثير من الأحيان أن بعض العيون تتأثر بشدة أكثر من غيرها. قد تكون هذه الظاهرة مرتبطة بالأنسجة الكثيفة نسبيًا من مجموعة العين ، مع DSRNA قادرة بشكل أفضل على الوصول إلى بعض الوحدات.
من المهم للغاية لتحسين تنفيذ تجارب RNAi بنجاح أن يتم تحسين عدة معلمات للجين المستهدف. على سبيل المثال، يمكن تركيز DSRNA وطول الجين المستهدف تؤثر بقوة على النتيجة20. معلمة أخرى حرجة هي كيفية تنفيذ الحقن، حيث يمكن أن تؤثر هذه العملية بشكل كبير على معدل البقاء على قيد الحياة. بالنسبة للأجنة، حققنا أفضل النتائج باستهداف مركز الجنين. لوحة مُضَمّرة جيداً تسمح بحقن 100 جنين أو أكثر في جلسة واحدة. بالنسبة لليرقات ، من المهم إدخال إبرة الحقن بين الأجزاء. تتطلب هذه الحقن المزيد من اليرقات، وبناء على توافر اليرقات، فإن مجموعات الحقن لدينا هنا تتكون عادة فقط من عدد قليل من الحيوانات في وقت واحد. لجميع الحقن ، من المهم منع الهواء من دخول الكائن الحي.
في بعض الحالات، يمكن أن تؤثر حلقات التغذية المرتدة لشبكة تنظيمية جينية والتكرار الوراثي على ازدواجية الأنماط الظاهرية RNAi، على الرغم من الضربات القاضية المتسقة. ويبدو أن هذا هو الحال بالنسبة لملاحظاتنا السلوكية من اليرقات مع الضربات القاضية ناجحة للغاية من بروتين عدسة بارزة، Lens318. على الرغم من أننا تحققنا من الكفاءة العالية لهذه الضربات القاضية من خلال qPCR ، لوحظ اختلاف كبير في الأنماط الظاهرية المرتبطة بها. هذه النتيجة تسلط الضوء على ضرورة تحديد بشكل صحيح RNAi knockdowns (للحصول على تفاصيل حول الخيارات انظر22). إذا لم يكن هناك توقع واضح مسبقًا فيما يتعلق بالنمط الظاهري الناتج ، فإن الطريقة الجيدة للتحكم في التأثيرات غير المستهدفة للرنابي هي استهداف نفس الجين بمسلسلين غير متداخلين من dsRNA وتقييم النتائج للنمط الظاهري الشائع.
وعلى النقيض من تقنيات تحرير الجينات، فإن RNAi هو أيضا أداة قوية لدراسة الجينات القاتلة، وهناك طريقتان للقيام بذلك. على سبيل المثال، إذا كان أحد مهتم بالمساهمة الوظيفية للجين حيث فقدان الوظيفة في وقت مبكر من التنمية هو معروف أن تكون قاتلة، يمكن تحقيق وظيفية من هذا الجين ببساطة عن طريق السماح للحيوان أن تتطور بشكل طبيعي ومن ثم هدم الجين عن طريق RNAi في وقت لاحق في التنمية (أي، في الكبار). وبدلاً من ذلك، يمكن التحقيق في جين يعرف أن فقدان الوظيفة بالكامل قاتلاً من خلال ضربة قاضية جزئية، وهو ما يمكن تحقيقه عن طريق حقن مجموعة من تركيزات الحمض النووي الريبي. تظهر بعض نتائجنا الضربات القاضية من اللاك2، والتي من المعروف أنها قاتلة إذا أصبح بشرة الحشرات ناعمة بشكل مفرط24. حتى خنفساء lac2 RNAi المصورة في الشكل 5 من غير المرجح أن تبقى خارج ظروف المختبر. يتم قطعجين آخر قاتل ، والتي رموز لعامل النسخ الذي هو أساسي لمواصفات الخلية مصير في أنظمة الجهاز المختلفة في المفصليات ، وقد تم ربطها بتطوير غليا في نظام Drosophila البصري29. استنادا إلى تجربتنا مع قطع RNAi في الأجنة T. marmoratus، يمكننا استحضار أنماط الظاهريات العين بالمعلومات في الأجنة التي هي قادرة على استكمال نمو العين الجنينية (ملاحظات غير منشورة). هنا, جرعات أعلى يبدو أن يؤدي إلى معدلات أعلى الفتك, في حين أن الجرعات المنخفضة تؤدي إلى أنماط ظاهرية ملحوظة وغنية بالمعلومات.
بروتوكولنا لا يسرد فقط الخطوات اللازمة للباحث لمتابعة تجارب RNAi على T. marmoratus، كما هو موضح ، ولكن ينطبق أيضًا بشكل عام على الكائنات الأخرى ، وخاصة الكائنات المائية. ومن بين الكائنات المائية، هناك بالفعل عدة أمثلة داخل القشريات مثل براغيث المياه دافنيا30 والجمبري (للاطلاع على استعراض حديث، انظر المرجع31). هناك فرص وافرة بين الحشرات المائية، حيث تشير التقديرات إلى أنها تشكل حوالي 6٪ من جميع تنوع الحشرات، مع احتمال أكثر من 200،000 نوع32. وعلاوة على ذلك، تم بالفعل تنفيذ RNAi على المياه الحادة التي تميل إلى أن تسكن سطح البيئات المائية33. إذا لم يكن هناك جينوم موجود ، ثم transcriptome يمكن تجميعها دي نوفو. طالما أن هذه العملية تكشف عن contigs من بضع مئات من النيوكليوتيدات، يمكن تصميم dsRNA ضد جينات محددة. ومن المرجح أن يكون بروتوكولنا لشل حركة الحشرات في أغاروز مفيدًا أيضًا لإجراءات أخرى ، خاصة بالنسبة للكائنات الناعمة والمرنة والمائية. وتبقى RNAi، مجتمعة، تقنية قوية للتلاعب في التعبير الجيني في مجموعة متنوعة من الكائنات الحية، حتى عندما لا تتوفر أدوات جزيئية وجينية أخرى.
Disclosures
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
نود أن نشكر الدكتور جوش بنوا لمساعدته في المعلوماتية الحيوية هايلي توبلر لمساعدتها في رفع خنافس الغوص Sunburst وتمارا بيس للحصول على المساعدة التحريرية. وقد تم دعم هذا البحث من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم في إطار المنح IOS-1456757 و IOS-1856341 إلى EKB و IOS157936 إلى YT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. RNA isolation and de novo transcriptome assembly | |||
| liquid nitrogen | University Stockroom | Typically locally available at research institutions | |
| pipette tips | Fisher Scientific | size dependent | Products from other vendors would work equally well |
| RNeasy lipid tissue mini kit (RNA isolation kit) | Qiagen | 74804 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| spectrophotometer (NnanoDrop) | Thermo Fisher | 9836674 | Other models would work equally well |
| 1.2. De novo transcriptome assembly. | |||
| BUSCO.v3 | https://busco.ezlab.org/ | Any freely available software for assessing trasncriptome completeness can be used. | |
| CLC Genomics workbench | Qiagen | 832021 | Other equivalent software packages are also available |
| Galaxy workbench | https://usegalaxy.org/ | An open source online transcriptome assembly & annotation pipeline | |
| NCBI BLASTx | https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?LINK_LOC=blasthome&PAGE_TYPE=BlastSearch&PROGRAM=blastx | An open source online alignment and annotation pipeline | |
| 2. cDNA synthesis, Cloning & Miniprep isolation | |||
| ampicillin sodium salt | Gibco | 11593-027 | Products from other vendors would work equally well |
| glycerol | Fisher Scientific | G33-500 | Products from other vendors would work equally well |
| LB broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | Products from other vendors would work equally well |
| Omniscript RT (reverse trasncription) kit | Qiagen | 205111 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| One Shot™ TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404010 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | Products from other vendors would work equally well |
| PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit | ThermoFischer | 771471 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| shaker-incubator | Labnet | 211DS | Other models would work equally well |
| spectrophotometer (NnanoDrop) | Thermo Fisher | 9836674 | Other models would work equally well |
| thermal cycler for PCR | BioRad | T100 | Other models would work equally well |
| TOPO TA Cloning kit | Invitrogen | 1845069 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| X-Gal Solution | Thermo Scientific | R0941 | Products from other vendors would work equally well |
| 2.2 PCR amplification & in vitro dsRNA synthesis | |||
| Centrifuge | Fisher Scientific | accuSpin Micro 17R | Other models would work equally well |
| ethanol | Fisher Scientific | A4094 | Products from other vendors would work equally well |
| FastTaq DNA Polymerase, dNTPack | Roche | 13873432 | This kit contains all the reagents necessary for a PCR |
| MEGAclear Transcriiption clean up kit | ThermoFischer | AM1908 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| MEGAscript T7 Transcription kit | ThermoFischer | AM1334 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| nuclease-free water | Fisher Scientific | AM9932 | Products from other vendors would work equally well |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| sodium acetate | Fisher Scientific | BP333-500 | Make 3M working solution |
| Spectrophotometer (NnanoDrop) | Thermo Fisher | 9836674 | Other models would work equally well |
| 3. Collecting and preparing early stage T. marmoratus embryos for dsRNA injections | |||
| agarose | Fisher Scientific | 9012-36-6 | Products from other vendors would work equally well |
| distilled water | Fisher Scientific | 9180 | Products from other vendors would work equally well |
| forceps (Dumon #4 Biology) | Fine Science Tools | 11242-40 | Products from other vendors would work equally well |
| glass cavity dish (3 well-dish) | Fisher Scientific | 50-243-43 | Products from other vendors would work equally well |
| microwave | Welbilt | turn-table | Other models would work equally well |
| natural hair paintbrush | Amazon | Any fine brush will do | |
| P1000 micro-pipetter | Gilson | F123602 | Other models would work equally well |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | Products from other vendors would work equally well |
| stereomicroscope | Microsocope Central | 10446293 | Any good stereomicroscope will work |
| transfer pipettes | Fisher Scientific | 21-200-109 | Products from other vendors would work equally well |
| 4. dsRNA micro-injections in early stage T. marmoratus embryos | |||
| digital camera | Edmund optics (Qimaging) | Retiga 2000R | Other models would work equally well |
| ethanol | Fisher Scientific | A4094 | Products from other vendors would work equally well |
| food dye | Kroger | Any available food dye should work fine | |
| humidity chamber | take any plastic box with a lid, sterilize it with 70% ethanol and let it dry | ||
| incubator | Labline | 203 | Other models would work equally well |
| injection buffer | Prepared for 1 mL following reference #22 : Mix 10 µL of 0.1 M sodium phosphate buffer, 100 µL of 0.5 M potassium chloride solution, 100 µL of food dye and 790 µL of double-distilled water. Store in 4 °C. | ||
| intracellular Microinjection Systems (Picospritzer) | Parker | 052-0500-900 | Currently the model III is available, but older models work also |
| micro needle holder | A-M Systems | 672441 | Other products would work equally well |
| microinjection needles (1.2 mm x 0.68 mm, 4 inches) | A-M Systems | 603000 | Other models would work equally well |
| micromanipulator | Drummond Scientific Company | 3-000-024-R | Any quality micromanipulator will work |
| monosodium phosphate | Fischer scientific | 7558-80-7 | To make 10 mL of 1 M working solution: Add 1.2 g of monosodium phosphate powder to 10 mL of Double distilled water and mix until clear solution is obtained |
| P-1000 Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-1000 | Puller settings:Heat 575, Pull 60, Velocity 75 Delay 110, Pressure 700. |
| P10 micro-pipetter | Gilson | F144802 | Other models would work equally well |
| P1000 micro-pipetter | Gilson | F123602 | Other models would work equally well |
| potassium chloride | Fischer scientific | 7447-40-7 | To make 100 mL of 0.5 M potassium chloride solution: Add 3.73 g of potassium chloride crystals to 100 mL of double distilled water and mix until clear solution is obtained. |
| sodium phosphate buffer (0.1M) | To make 10 mL of 0.1 M of this buffer: Mix 8.5 mL of 1 M sodium phosphate dibasic solution with 1.5 mL of 1 M monosodium phosphate solution. Check the pH with a pH meter and adjust accordingly to pH 7.6 at room temprature. | ||
| sodium phosphate dibasic | Fischer scientific | 7558-79-4 | To make 10 mL of 1 M working solution: Add 1.42 g of sodium phosphate dibasic powder to 10 mL of Double distilled water and mix until clear solution is obtained |
| stereomicroscope | Microsocope Central | 10446293 | Any good stereomicroscope will work |
| 5. Preparing T. marmoratus larvae for dsRNA injections | |||
| agarose | Fisher Scientific | 9012-36-6 | Products from other vendors would work equally well |
| forceps (Dumon #4 Biology) | Fine Science Tools | 11242-40 | Products from other vendors would work equally well |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | Products from other vendors would work equally well |
| 6. dsRNA micro-injections in T. marmoratus larvae | |||
| injection buffer (10x) | See section 4 | ||
| microinjection needles (1.2 mm x 0.68 mm, 4 inches) | A-M Systems | 603000 | Other models would work equally well |
| microinjection syringe | A-M Systems | 603000 | Other models would work equally well |
| micro needle holder | A-M Systems | 672441 | Other products would work equally well |
| P-1000 Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-1000 | Puller settings:Heat 575, Pull 60, Velocity 75 Delay 110, Pressure 700. |
| stereomicroscope | Microsocope Central | 10446293 | Any good stereomicroscope will work |
References
- Muller, B., Grossniklaus, U. Model organisms - A historical perspective. Journal of Proteomics. 73, 2054-2063 (2010).
- Gilbert, L. A., et al. CRISPR-Mediated Modular RNA-Guided Regulation of Transcription in Eukaryotes. Cell. 154, 442-451 (2013).
- Westerman, E. L., et al. Aristaless Controls Butterfly Wing Color Variation Used in Mimicry and Mate Choice. Current Biology. 28, 3469 (2018).
- Perry, M., et al. Molecular logic behind the three-way stochastic choices that expand butterfly colour vision. Nature. 535, 280 (2016).
- Boettcher, M., McManus, M. T. Choosing the Right Tool for the Job: RNAi, TALEN, or CRISPR. Molecular Cell. 58, 575-585 (2015).
- Meister, G., Tuschl, T. Mechanisms of gene silencing by double-stranded RNA. Nature. 431, 343-349 (2004).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
- Kennerdell, J. R., Carthew, R. W. Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway. Cell. 95, 1017-1026 (1998).
- Mello, C. C., Conte, D.
- Agrawal, N., et al. RNA interference: Biology, mechanism, and applications. Microbiol. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67, 657 (2003).
- Gu, L. Q., Knipple, D. C. Recent advances in RNA interference research in insects: Implications for future insect pest management strategies. Crop Protection. 45, 36-40 (2013).
- Ravisankar, P., Lai, Y. T., Sambrani, N., Tomoyasu, Y. Comparative developmental analysis of Drosophila and Tribolium reveals conserved and diverged roles of abrupt in insect wing evolution. Developmental Biology. 409, 518-529 (2016).
- Tomoyasu, Y., Wheeler, S. R., Denell, R. E. Ultrabithorax is required for membranous wing identity in the beetle Tribolium castaneum. Nature. 433, 643-647 (2005).
- Tomoyasu, Y., Arakane, Y., Kramer, K. J., Denell, R. E. Repeated Co-options of Exoskeleton Formation during Wing-to-Elytron Evolution in Beetles. Current Biology. 19, 2057-2065 (2009).
- Yang, X., et al. Probing the Drosophila retinal determination gene network in Tribolium (II): The Pax6 genes eyeless and twin of eyeless. Developmental Biology. 333, 215-227 (2009).
- ZarinKamar, N., et al. The Pax gene eyegone facilitates repression of eye development in Tribolium. Evodevo. 2, 15 (2011).
- Linz, D. M., Clark-Hachtel, C. M., Borras-Castells, F., Tomoyasu, Y. Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum. Journal of Visualized Experiments. , e52059 (2014).
- Stahl, A., S, B. R., Cook, T. A., Buschbeck, E. K. A complex lens for a complex eye. Integrative and Comparative Biology. 57, 1071-1081 (2017).
- Yeku, O., Frohman, M. A. Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE). RNA, Methods In Molecular Biology. , Springer. 107-122 (2011).
- Miller, S. C., Miyata, K., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. Dissecting Systemic RNA Interference in the Red Flour Beetle Tribolium castaneum: Parameters Affecting the Efficiency of RNAi. Plos One. 7, (2012).
- Tomoyasu, Y., Denell, R. E. Larval RNAi in Tribolium (Coleoptera) for analyzing adult development. Development Genes and Evolution. 214, 575-578 (2004).
- Philip, B. N., Tomoyasu, Y. Molecular Methods for Evolutionary Genetics. Orgogozo, V., Rockman, M. V. , Humana Press. 471-497 (2011).
- Mackenzie, S. M., Howells, A. J., Cox, G. B., Ewart, G. D. Sub-cellular localisation of the White/Scarlet ABC transporter to pigment granule membranes within the compound eye of Drosophila melanogaster. Genetica. 108, 239-252 (2000).
- Arakane, Y., Muthukrishnan, S., Beeman, R. W., Kanost, M. R., Kramer, K. J. Laccase 2 is the phenoloxidase gene required for beetle cuticle tanning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 11337-11342 (2005).
- Werner, S., Buschbeck, E. K. Rapid and step-wise eye growth in molting diving beetle larvae. Journal of Comparative Physiology. 201, 1091-1102 (2015).
- Prpic, N. M., Schoppmeier, M., Damen, W. G. Gene Silencing via Embryonic RNAi in Spider Embryos. Cold Spring Harbor protocols. 3, 1-4 (2008).
- Sagi, A., Manor, R., Ventura, T. Gene Silencing in Crustaceans: From Basic Research to Biotechnologies. Genes. 4, 620-645 (2013).
- Zhu, K. Y., Palli, S. R. Annual Review of Entomology. Douglas, A. E. 65, Annual Reviews. 293-311 (2020).
- Bauke, A. C., Sasse, S., Matzat, T., Klaembt, C. A transcriptional network controlling glial development in the Drosophila visual system. Development. 142, 2184 (2015).
- Lin, C. Y., et al. RNAi analysis of doublesex1 expression in Daphnia pulex Leydig, 1860 (Cladocera). Crustaceana. 92, 137-154 (2019).
- Nguyen, D. V., Christiaens, O., Bossier, P., Smagghe, G. RNA interference in shrimp and potential applications in aquaculture. Reviews in Aquaculture. 10, 573-584 (2018).
- Dijkstra, K. D. B., Monaghan, M. T., Pauls, S. U. Annual Review of Entomology. Berenbaum, M. R. 59, Annual Reviews. 143-163 (2014).
- Crumiere, A. J. J., Khila, A. Hox genes mediate the escalation of sexually antagonistic traits in water striders. Biology. Letters. 15, 5 (2019).
