Summary
הפרעות RNA היא טכניקה ישימה ורבת עוצמה למניפולציה ביטוי גנים בשלבים התפתחותיים ספציפיים. כאן, אנו מתארים את הצעדים הדרושים ליישום טכניקה זו חיפושית הצלילה הימית תרמונקטוס מרמורטוס, מרכישת רצפי גנים ועד לחיסול גנים המשפיעים על מבנה או התנהגות.
Abstract
הפרעות RNA (RNAi) נשאר טכניקה רבת עוצמה המאפשרת הפחתה ממוקדת של ביטוי גנים באמצעות השפלה mRNA. טכניקה זו ישימה למגוון רחב של אורגניזמים ויעילה מאוד בסדר העשיר במין Coleoptera (סלקות). כאן, אנו מסכמים את הצעדים הדרושים לפיתוח טכניקה זו באורגניזם חדשני וממחישים את יישומה לשלבים ההתפתחותיים השונים של חיפושית הצלילה הימית תרמונקטוס מרמורטוס. רצפי גנים היעד ניתן להשיג חסכוני באמצעות הרכבה של transcriptomes נגד קרוב משפחה עם גנומיקה ידועה או דה נובו. שיבוט גנים מועמד מנצל וקטור שיבוט ספציפי (pCR4-TOPO plasmid), המאפשר סינתזה של RNA כפול גדילים (dsRNA) עבור כל גן עם שימוש פריימר משותף יחיד. DSRNA מסונתז ניתן להזריק לתוך עוברים עבור תהליכים התפתחותיים מוקדמים או זחלים לתהליכים התפתחותיים מאוחרים יותר. לאחר מכן אנו ממחישים כיצד ניתן להזריק RNAi לזחלים ימיים באמצעות אימוביליזציה באגרוז. כדי להדגים את הטכניקה, אנו מספקים מספר דוגמאות של ניסויי RNAi, יצירת נוקאאוטים ספציפיים עם פנוטיפים צפויים. באופן ספציפי, RNAi עבור הגן שיזוף laccase2 מוביל הבהרה הציפורן הן זחלים ומבוגרים, white ו RNAi עבור הגן פיגמנטציה העין לבן מייצר הבהרה / חוסר פיגמנטציה בצינורות עיניים. בנוסף, הנוקאאוט של חלבון עדשת מפתח מוביל זחלים עם ליקויים אופטיים ויכולת מופחתת לצוד טרף. יחד, תוצאות אלה מדגישות את העוצמה של RNAi ככלי לחקירת דפוסים מורפולוגיים ותכונות התנהגותיות באורגניזמים עם מסדי נתונים תעתיק בלבד.
Introduction
השאלה כיצד גנים ספציפיים תורמים לאבולוציה של תכונות מגוונות היא נושא מרגש בביולוגיה. במהלך העשורים האחרונים, נעשתה התקדמות רבה בכל הנוגע לנתח את התסיסים הגנטיים של תהליכים התפתחותיים בכמה אורגניזמים מודל, כגון הנמטודה Caenorhabditis elegans, פרי לעוף Drosophila מלנוגאסטר, ואת עכבר הבית השרירים1. לאחרונה, המצאת טכניקות רבות עוצמה לעריכת גנים כגון אשכולות קבועים בין-מרחבים קצרים פלינדרומיים חוזרים (CRISPR)/Cas92 סיפק את היכולת לשנות את הקוד הגנטי של אורגניזמים שאינם מודל (לדוגמה ראה3,4). כתוצאה מכך, יש כבר גל של מחקרים גנטיים על מגוון רחב של אורגניזמים שלא ניגשו בעבר באמצעות טכניקות מולקולריות. בהתחשב במגוון העצום של ממלכת החיות שלנו, עם תכונות מעניינות רבות או שונות תכונות המיוצגות רק מינים ספציפיים, התקדמות זו הפכה אותו לזמן מרגש עבור ביולוגיה אבולוציונית-התפתחותית ("evo-devo") עבודה הקשורה. עם זאת, טכניקות עריכת הגנום הזמינות אורגניזמים שאינם מודל מוגבלים יחסית לגבי נקודות זמן התפתחותיות שבו הם יכולים להיות מיושמים, מה שהופך את זה מאתגר להבחין בתכונות הזמניות הקשורות לתפקיד כי גנים ספציפיים לשחק בכל תכונה. בנוסף, טכניקות טרנסגניות מוגבלות לעתים קרובות לגנים אינם חיוניים להישרדות (כלומר, שהנוקאאוט שלהם אינו תוצאתו קטלניות). לכן, בעוד טכניקות עריכת גנים החלו להיות פופולרי, יש עדיין צורך בטכניקות יעילות החלות על מגוון רחב של אורגניזמים שונים בנקודות זמן התפתחותיות ספציפיות ולהקל על נוקאאוטים חלקיים (במקום אובדן מוחלט של פונקציה). כאן, אנו מושכים תשומת לב להפרעה RNA (RNAi), טכניקה קצת מיושנת אךרבת עוצמה נוק-דאון גנים 5 כי הוא יקר במיוחד כגישה סינרגטית לעריכת גנים. באופן ספציפי, פיתחנו הליכים המאפשרים את היישום של RNAi לחפשיות צלילה ימית כדוגמה הממחישה את היישום של טכניקה זו, מרכישת הרצפים המולקולריים הדרושים להזרקה מוצלחת של RNA דו-גדילי (dsRNA) לתוך ביצים וזחלים.
נוק-דאון גנטי מבוסס RNAi ממנף מנגנון הגנה מולד של אורגניזמים, שבו מולקולות dsRNA להקל על השתקת רצפי חומצה גרעין פולשים, כגון וירוסים ו transposons6. בקצרה, dsRNA נלקח לתוך התא, שם הוא נחתך 20-25 חתיכות נוקלאוטיד על ידי אנזים Dicer. חלקים אלה מפעילים את היווצרות קומפלקס ההשתקה המושרה על-ידי RNA (RISC), אשר מעכב את ה-mRNA המכוונת על-ידי כריכה אליו באתרים ספציפיים באמצעות קווצת המדריך. תהליך זה בסופו של דבר מוביל להשפלה mRNA ולכן מפריע התרגום של mRNA לתוך החלבון בהתאמה6. טכניקת הנוק-דאון של הגן המבוסס על RNAi המוצגת כאן ולכן מסתמכת על הזרקת DSRNA. עבור מודלים של בעלי חיים, טכניקה זו פותחה במקור C. elegans7 ו D. מלנוגסטר8, אבל מאז התגלה ככלי גנטי פונקציונלי רב עוצמה אורגניזמים שאינם מודל9,,10. בשל אופיו היעיל מאוד חרקים מסוימים, RNAi יכול אפילו להיות מיושם בניהול מזיקים11.
ככלי מחקר, RNAi שימש כדי לבחון כיצד מסלולים מולקולריים-התפתחותיים מפתח לתפקד במודלים חרקים לא מסורתיים. לדוגמה, RNAi ב קסטניום חיפושית הקמח Tribolium כבר אינסטרומנטלי בקביעת כמה עמוק גנים שנשרמו לתרום תכונות ספציפיות חיפושית זו, כפי שמדגים לפיתוחשל כנפיים מעוצבות במיוחד 12,13,,14 ועיניים15,16., הטכניקות שמתוארות למניפולציות ב-T. castaneum תוארו היטב 17 ומסתמכות על היכולת לשתק ביצים יבשות יחסית וזחלים על משטח דביק. עם זאת, אי-תנועה כזו אינה אפשרית עבור הצורות ההתפתחותיות הרטובות של אורגניזמים ימיים כגון חיפושית הצלילה של קרניהשמש. כמו במקרה של אורגניזמים מודל לא מסורתיים רבים, זה חסר גנום ביאורים. כדי לתמרן ביטוי גנים בכל אורגניזם ללא גנום, צעד ראשון סביר וחסכוני הוא ליצור transcriptomes ולזהות את רצפי נוקלאוטיד putative של הגנים המבוטאים של עניין בהתבסס על דמיון רצף עם אורגניזמים מודל קשורים אך מבוססים יותר, במקרה זה, בעיקר טריבוליום (Coleoptera) וגנים Drosophila.
כאן, כדי להדגים כיצד ניתן להשתמש ב-RNAi על אורגניזם ימי, אנו דנים תחילה בפרוטוקולים ובתוכנה לחילוץ RNA ותעתוק והרכבה, המאפשרים זיהוי רצפי גנים ממוקדים ספציפיים. לאחר מכן אנו מסכמים את השלבים הדרושים לסנתז dsRNA ספציפי לגנים. לאחר מכן, אנו ממחישים כיצד ניתן להזריק ביצים בסביבה מימית ולהפגין פרוטוקולי דגירה לתחינת עוברים מתפתחים. בנוסף, אנו מראים כיצד ג'ל agarose יכול לשמש כדי לשתק לחלוטין זחלים במהלך תהליך ההזרקה, טכניקה כי הוא שימושי בדרך כלל במהלך הליכים שונים, ניתן להחיל על מגוון רחב של פרוקי רגליים. כדי להדגים כיצד ניתן להחיל RNAi על שלבים התפתחותיים שונים, אנו כוללים דוגמה שבה השתקנו את גן פיגמנטציה העין לבן בעוברים. בנוסף, אנו מתארים דוגמה שבה הגן שיזוף laccase2(lac2) הושתק במהלך instar הזחל השני (כדי להשפיע על הזחלים של instar הזחל השלישי) ואת instar הזחל השלישי (כדי להשפיע על מבוגרים). לבסוף, אנו מוכיחים כי הזריקה של ריכוז נמוך יותר של dsRNA מוביל נוק-דאון חלקי, אשר מראה כי טכניקה זו יכולה להיות מיושמת גם על גנים שבהם אובדן של תפקוד ידוע להיות קטלני.
Protocol
1. בידוד RNA והרכבת תמלול דה נובו
- לבצע בידוד RNA מוחלט מהשלב המאוחר של שלב שלישי חיפושית צלילה חיפושית זחל צינורות עיניים ו חיפושיות למבוגרים באמצעות ערכת בידוד RNA (ראה טבלת חומרים)המיועד רקמה עשירה בשומנים. בודדו את ה-RNA הכולל מ-T. marmoratus ורצף אותו באופן הבא לשיטותשתוארו קודם לכן 18.
- הרכבת תמלול דה נובו
הערה: כדי להרכיב את התמליל דה נובו, ניתן להשתמש בפלטפורמות ביו-פורמטיקה שונות (ראה טבלת חומרים). פלטפורמות אלה זמינות מסחרית, ובמקרים מסוימים קיימות כקבצי Script מבוססי שורת פקודה של Unix. מאחר שההרכבה היא דה נובו, מומלץ להרכיב את התמלילים באופן עצמאי בשתי פלטפורמות ולהשוות את התוצאות כדי לא לכלול תוצאות חיוביות שגויות או תשלילים כוזבים.- כדי להתחיל להרכיב את התמלילים, העלו את הקריאה הגולמית בפלטפורמת הביו-אינפורמטיקה המתאימה.
הערה: קבצים אלה נדחסים בדרך כלל ובתבנית FASTQSANGER. ג'י-סי. אין צורך לשחרר את הדחיסה של הקבצים מכיוון שתבנית זו מתקבלת בשלב הבא. - באמצעות שורת הפקודה Trimmomatic, חתוך את הקרמות הגולמיות כדי להסיר רצפי מתאם או קריאה קצרה הנוקשים מתחת לסף ברירת המחדל. תחסם את הלחץ של הקריאה הגולמית הקצוצות; הקבצים יהיו כעת בתבנית FASTQ. עבור כל דוגמה כדי להשיג קבצים המוכנים להרכבת דה נובו.
- להרכיב את raw concatenated קורא דה נובו באמצעות כל סקריפט שורת פקודה שיכול להרכיב transcriptomes דה נובו. שמור את transcriptome מורכב, אשר יהיה כעת רשימה של contigs עם רצפים בהתאמה שלהם, כקובץ FASTA. כדי להגדיל את הכיסוי של ההרכבה, לשלב ולהרכיב תעתיקים מרובים עבור אותו מין.
הערה: תהליך זה מגדיל את הסיכויים ליצירת contigs מדויק יותר והוא חשוב במיוחד אם גנים מספר עותק נמוך הם בעלי עניין. - לאחר ההרכבה, להעריך את transcriptome לשלמות על ידי חישוב ציוני כיסוי (תוכנת הערכת כיסוי זמינה באופן חופשי, ראה טבלת חומרים).
הערה: תעתיק עם ציון כיסוי >75% נחשב טוב. עם זאת, הרלוונטיות של ציון זה תלויה בסיבה לתמלול דור. לדוגמה, אם התעתיק משמש לזיהוי גנים של מספר עותק נמוך, ציון >85% טוב יותר, מכיוון שהוא מסמל כיסוי גדול יותר. - ביאורים את התמלילים של דה נובו שנאספו באמצעות כלי חיפוש בסיסי של יישור מקומי (BLAST; ראה טבלת חומרים).
הערה: עבור ניסוי זה, transcriptome היה ביאור בעיקר נגד מסד נתונים של חלבוני Drosophila ידועים ומסד נתונים של חלבוני חיפושית ידועים. ניתן להוריד את רשימת הביאורים כקובץ גיליון אלקטרוני וcontig/contigs המציינים דמיון רצף לחלבונים של אורגניזמים אחרים ניתן להוריד כקובץ FASTA. - זהה את המספר/מספרים של החלבון של עניין ולחלץ את רצפי נוקלאוטיד. השתמש ב-BLAST כדי לזהות אם אזורים שזונים ספציפיים לחלבון (כגון תחומי homeobox) נמצאים ברצף העניין של נוקלאוטיד עם ביאורים. בדוק contigs אחרים עם אותו ביאור עבור רצף נוקלאוטיד חופף כדי ליצור את הרצף של תעתיק ספציפי לגן.
הערה: זיהוי רציפים עם חפיפה רצף אינו אפשרי בדרך כלל עבור כל הגנים, במיוחד עבור גנים מספר עותק נמוך. - אם רצף באורך מלא של הגן יש צורך, להתחיל עם contig כי יש את הדמיון הרצף הגבוה ביותר כ נקודת חניכה לזיהוי רצף נוקלאוטיד של התמליל הבוגר כולו באמצעות טכניקות כגון 3′ ו 5′ ההגדלה המהירה של קצוות cDNA (RACE19).
- ביאור ההרכבה שהתקבלה מהפלטפורמה השנייה לאחר שלבים 1.2.4-1.2.7.
הערה: באופן אידיאלי, התוצאות צריכות להיות דומות לחלבונים של עניין; עם זאת, כיסוי יכול להיות שונה בין פלטפורמות במידה מסוימת. - השתמש בתעתיק המורכב כדי לסנתז dsRNA ספציפי למינים כמתואר בסעיף 2.
- כדי להתחיל להרכיב את התמלילים, העלו את הקריאה הגולמית בפלטפורמת הביו-אינפורמטיקה המתאימה.
2. שיבוט וסינתזת dsRNA ספציפית לגנים
הערה: שיבוט ספציפי גנים סינתזה dsRNA תואר בפירוט עבור T. castaneum20,21,22. השלבים הבאים הם מבט כולל קצר.
- שיבוט, טרנספורמציה חיידקית, ו רצף פלסמיד
- בודדו את ה-RNA הכולל מהאורגניזם (כמתואר בשלב 1.1) וצור DNA משלים (cDNA) באמצעות ערכת שעתוק הפוכה (ראה טבלת חומרים). זהה אחד או שניים 100-1000 bp רצפי נוקלאוטיד מcontigs כי הם ספציפיים עבור הגנים של עניין.
- עיצוב זוגות פריימר המשתרעים על פני כל מתיחה מזוהה של נוקלאוטידים ולהגביר את הרצף באמצעות תגובת שרשרת פולימראז (PCR). להוסיף צעד נוסף 30 דקות בסוף כדי ליצור 3′ אדנין overhangs במוצר ה-DNA מוגבר. טהר מוצר זה באמצעות ערכת טיהור PCR (ראה טבלת חומרים).
- שכפל את המוצר המטוהר לווקטור פלסמיד pCR4-TOPO (ראה טבלתחומרים) תוך כדי ביצוע פרוטוקול הספק שסופק עם ערכת השיבוט. באמצעות טיפול בהלם חום להפוך את הפלסמידים המשובטים לתאים חיידקיים מוסמכים (זן: E.coli DH10B) בהתאם לפרוטוקול של הספק עבור תאים מוסמכים (ראה טבלת חומרים),ומסנן תאים שהשתנו בהצלחה.
הערה: צלחות עם מושבות ניתן לעטוף בסרט פרפין כדי לשמור על לחות ומאוחסנים ב 4 מעלות צלזיוס עד חודש אחד. - לבחור מושבות של תאים שהשתנו באמצעות קצה פיפטה 10 μL ותרבות במרק lysogeny (LB) המכיל אאמפיצילין (50 μg / mL) ב שייקר-אינקובטור ב 37 ° C ו 200 סל"ד עבור 24 שעות.
הערה: עבור אחסון לטווח ארוך, תאים תרבותיים ניתן לדלל 1:1 עם 100% גליטרול וקפוא ב -80 °C כמו מניות גליטרול. - בודדו פלסמידים המכילים את הגן המעניין מתרבות זו באמצעות ערכת בידוד מיני-פרפ (ראה טבלת חומרים). אחסן את הפלסמיות המבודדות (minipreps) ב-20°C לאחר הערכת התפוקה באופן ספקטרופוטומטרי. באופן ספציפי, למדוד את ספיגת הדגימה ב 260 נה"מ, 280 נה"מ ו 230 נה"מ. חשב את היחסים A260/A280 לכמת DNA, ו-260/ A230 לכמת טוהר DNA.
הערה: יחס 260/280 של 1.8 מקובל בדרך כלל כ-DNA טהור מספיק, יחסים נמוכים מ- 1.5 מצביעים על נוכחות של שאריות של ריגנטים חילוץ שיורית כגון פנול. יחס 260/230 צריך להיות גדול או שווה ליחס 260/280. יחסים נמוכים יותר מצביעים על זיהום ריגנט שיורית. התשואה נעה בדרך כלל בין 100 ל-500 ng/μL. - רצף minipreps מבודד כדי לאשר כי השבר הספציפי לגן כבר משולב בהצלחה, להיות מאוגף בין 5′ T7 ו 3′ T3 אזורי מקדם בפלסמיד; ניתן לעשות זאת באמצעות פריימרים רצף T7 ו- T3אוניברסליים 22. השתמש minipreps עם רצף ספציפי לגן של עניין להכנת dsRNA.
- בודדו את ה-RNA הכולל מהאורגניזם (כמתואר בשלב 1.1) וצור DNA משלים (cDNA) באמצעות ערכת שעתוק הפוכה (ראה טבלת חומרים). זהה אחד או שניים 100-1000 bp רצפי נוקלאוטיד מcontigs כי הם ספציפיים עבור הגנים של עניין.
- PCR הגבירה במבחנה dsRNA סינתזה
- ההגדלה וטיהור המוצרים של PCR
- עיצוב פריימרים ספציפיים לפלסמיד או ספציפיים לגן בעלי רצף מקדם T7 בצדדים של 5'(ראה הפניה 22 לפרטים) כדי להגביר שבר ליניארי של הגן שנוסף. לייעל את התשואה על ידי הגדרת לפחות 10 תגובות של 20 μL כל אחד.
הערה: המוצר שנוצר מוקף בשני אתרי איגוד פולימראז T7 20 bp. - טהר את מוצר ה- PCR באמצעות ערכת טיהור מוצרי PCR (ראה טבלת חומרים),בהתאם לפרוטוקול ההתזה המבוסס על עמודות של הספק. כדי להגדיל את התשואה, חזור על שלב ההתחכות הסופי עד 3 פעמים עם אותו eluent. להעריך את התשואה בספקטרופוטומטריה.
הערה: התשואה נעה בדרך כלל בין 100 ל- 700 ng/μL. ניתן לאחסן מוצר מטוהר זה ב-20°C עד לשימוש נוסף.
- עיצוב פריימרים ספציפיים לפלסמיד או ספציפיים לגן בעלי רצף מקדם T7 בצדדים של 5'(ראה הפניה 22 לפרטים) כדי להגביר שבר ליניארי של הגן שנוסף. לייעל את התשואה על ידי הגדרת לפחות 10 תגובות של 20 μL כל אחד.
- סינתזה וטיהור במבחנה
- השתמש במוצר מטוהר PCR ספציפי לגנים כדי לסנתז dsRNA במבחנה על פי הפרוטוקול של ערכת סינתזה dsRNA של בחירה. במידת הצורך, להאריך את זמן הדגירה לייצור dsRNA מוגברת.
- להעריך את ההתקדמות של התגובה בהתבסס על האטימות של תערובת התגובה (גדל את כמות המוצר dsRNA, גבוה יותר את המערבולת). בסוף הדגירה, להפסיק את התגובה באמצעות טיפול DNase. כדי לעשות זאת להוסיף 1 μL ממלאי של 2 U / μL, לתערובת התגובה. הרחב טיפול זה ל- 1-2 שעות כדי להבטיח את ההשפלה האופטימלית של ה-DNA של התבנית.
- נקה את ה- dsRNA באמצעות ערכת טיהור או באמצעות השלבים הבאים.
- לדלל את המוצר שנוצר עם 115 μL של מים ללא גרעין ולהוסיף 15 μL של 3 M נתרן אצטט. להוסיף 2 כרכים של קר כקרח 100% אתנול לתערובת תגובה זו ולזרז את dsRNA לילה ב -20 מעלות צלזיוס.
הערה: בשלב זה, ניתן לאחסן דגימות בבטחה מבלי להשפיע על התשואה הסופית. - צנטריפוגה המשקעים ב 0 ° C במשך 20 דקות ב 9000 x g ולזרוק את supernatant. שוטפים את המוצר פעם אחת עם קר כקרח 70% אתנול וצנטריפוגה במשך 15 דקות ב 13000 x g.
- הסר את supernatant ויבש את הכדור במשך 5-15 דקות.
- לאחסן את dsRNA מטוהר ב -20 °C עד לשימוש נוסף. השתמש dsRNA מטוהר להזרקה בשלב ההתפתחותי הרצוי.
- לדלל את המוצר שנוצר עם 115 μL של מים ללא גרעין ולהוסיף 15 μL של 3 M נתרן אצטט. להוסיף 2 כרכים של קר כקרח 100% אתנול לתערובת תגובה זו ולזרז את dsRNA לילה ב -20 מעלות צלזיוס.
- ההגדלה וטיהור המוצרים של PCR
3. איסוף והכנה של עוברים בשלב מוקדם T. marmoratus עבור זריקות dsRNA
- הכן צלחת אגרוז לדגירה של עוברי T. marmoratus.
- ראשית, להמיס 20 מ"ג של אבקת agarose נמס נמוך ב 100 מ"ל של מים מזוקקים autoclaved (2% agarose) ולאחר מכן להרתיח את התערובת במיקרוגל עד פתרון ברור מתקבל. לטפל עם הפתרון החם, כמו בועות אוויר יכול לגרום לו להיות מוצף.
- מחלקים את הפתרון הזה לצלחת פטרי קטנה. כדי ליצור חריצים (שיחזיקו את העוברים) על פני השטח של צלחת agarose, מניחים שלושה צינורות פלסטיק ברוחב 1-2 מ"מ (כגון קצות של פיפטות העברת פלסטיק) על פני השטח של agarose נוזלי לפני שהוא מתגבש.
- ברגע שהאגרוז מתגבש, השתמשו בזוג מלקות קהות כדי להסיר את הצינורות האלה. להוסיף 500 μL של מים מזוקקים autoclaved באמצעות micropipette P1000 כדי לכסות את חורצים אלה ב agarose.
- באמצעות מכחול שיער טבעי משובח, לאסוף עוברי T. marmoratus כי הם 5-8 h ישן מאתרי קינון חיפושית בצלחת חלל זכוכית מלא מים מזוקקים autoclaved. לפקח על אתרי הקינון לעתים קרובות כדי להבטיח כי הביצים שהושגו הן בגיל המתאים.
- לרוקן את העוברים תחת סטריאומיקרוסקופ באמצעות מפסי פירוק עדינים. לשם כך, דמיינו את היצור מתחת למיקרוסקופ (בהגדלה הרצויה) על ידי מיקום מקור האור בזווית המתאימה, ואז תפסו את היצור משני הצדדים עם ממחצויות חדות, קרעו אותו לרווחה, והחלקו בעדינות את העובר החוצה. מכיוון שיש שתי שכבות, ודא ששתיהן מוסרות.
- בעזרת מכחול שיער טבעי משובח, מעבירים בזהירות את העוברים מצלחת חלל הזכוכית לצלחת ה-agarose ומסדרים אותם בחריזים מתחת לסטריאומיקרוק. לטפל מאוד במהלך תהליך זה, כמו עוברים מפורקה הם שבריריים מאוד. השתמש בעוברים המוכנים לזריקות DSRNA.
הערה: הקצה מעט עבה יותר הוא הצד של העובר שבו הראש יתפתח.
4. מיקרו-גנים של DSRNA בשלב מוקדם של עוברי מרמורטוס
- כדי להזריק עוברים בשלב מוקדם עם dsRNA ספציפי לגן, להכין מחטים microinjection באמצעות מושך מחט microinjection (ראה טבלת חומרים). תוך כדי הדמיה של קצה המחט מתחת סטריאומיקרוסקופ, להשתמש בזוג מקצות עדינים לשבור את קצה המחט, יצירת קצה חד. באופן אידיאלי, לשבור את קצה המחט באלכסון כך קצה חד נשאר בצד אחד, אשר יאפשר לו להיכנס העובר תוך גרימת פציעה מינימלית.
- להפשיר את תמיסת dsRNA מלאי מטוהר על קרח, להוסיף 1 μL של מאגר הזרקה 10x ועל גבי זה עם מים מזוקקים כפול, כדי להפוך 10 μL של פתרון הזרקה. עבור זריקות, ריכוז dsRNA של 1 μg/μL בדרך כלל מתאים, אבל ניתן להתאים על פי חומרת phenotypic של בעלי החיים וכתוצאה מכך).
הערה: להכין 1 מ"ל של מאגר הזרקה 10x22 על ידי הוספת 10 μL של 0.1 M מאגר נתרן פוספט (נעשה על ידי ערבוב 8.5 מ"ל של 1 M Na2HPO4 ו 1.5 מ"ל של 1 M NaH2PO4 מותאם pH 7.6 ב 25 ° C עם 100 μL של 0.5 M KCl), 100 μL של צבע מזון ו 790 μL של מים מזוקקים כפול.- באמצעות פיפטה P10, מילוי המחט microinjection עם פתרון dsRNA עובד. לאחר שהפתרון מילא את קצה המחט, חבר אותה למחזיק מיקרו-מחט המחובר למערכת מיקרו-הפעלה המשתמשת בטכנולוגיית פליטת לחץ (ראה טבלת חומרים).
- הפעל את מערכת המיקרו-הפעלה ואת אספקת האוויר הלחץ. באמצעות microvalve על מערכת microinjection, להתאים את לחץ ההזרקה ל 15 psi. כוונן את משך ההזרקה באמצעות ידית כוונון הזמן (הגדר אותו כ-"Seconds").
- כמו משך ההזרקה תלוי נפח ההזרקה הנדרש, במידת הצורך, להתאים פרמטר זה על מערכת microinjection לפני כל הזרקה. השתמש בנפח הזרקה של 1-2 nL עבור בשלב מוקדם T. מרמורטוס עוברים.
הערה: נפחי הזרקה גבוהים יותר נוטים להפריע שיעור ההישרדות של העובר.
- כמו משך ההזרקה תלוי נפח ההזרקה הנדרש, במידת הצורך, להתאים פרמטר זה על מערכת microinjection לפני כל הזרקה. השתמש בנפח הזרקה של 1-2 nL עבור בשלב מוקדם T. מרמורטוס עוברים.
- כדי למדוד את נפח נוזל ההזרקה הניתן על ידי מערכת microinjection, לכייל את מחט ההזרקה על ידי הערכת נפח בועת הנוזל שנוצר בקצה המחט בעת הזרקת אוויר. עבור עוברי T. marmoratus, השתמש בגודל בועה אופטימלי של 100-200 μm. מחט ההזרקה היא באיכות טובה אם זה יכול להיות מושגת ב 15 psi עם משך הזרקה של ~ 3 s.
- ליישר את המחט ואת צלחת agarose המכיל את העוברים תחת stereomicroscope, כך המחט מתקרב העוברים בזווית בין 45° ו 60 מעלות.
- באמצעות המיקרו-מאניפולטור, הזז את המיקרו-שתמשל באיטיות תוך ניטור ההתקדמות דרך הסטריאומיקרוסקופ. ברגע קצה המחט נוגע לפני השטח של העובר, בזהירות להזיז את המחט קדימה עד שהוא חודר את פני השטח של העובר. אין למחורר את העובר עמוק עם קצה המחט שכן זה יכול להשפיע על ההישרדות של העובר. כדי להפחית את השונות, לספק את הזריקה באמצע העובר.
- ברגע שהמחט נמצאת בתוך העובר, לחצו בזהירות על כפתור ההזרקה של המזרק הזעיר כדי להעביר את מינון ה-dsRNA לעובר. לאחר הזרקת 1-2 nL של dsRNA, לאט למשוך את המחט מן העובר, כך שזה לא גורם לעובר להיקרע.
- להזריק את העוברים האחרים באופן דומה. אם מחט microinjection נחסם במהלך ההליך, לבטל את החסימה על ידי הגדלת לחץ ההזרקה ומשך. זיהוי חזותי של עוברים שהוזרקו בהצלחה על ידי הנוכחות של נקודה צבעונית באתר ההזרקה (מאז מאגר ההזרקה מכיל צביעת מזון).
- מניחים בזהירות את המנה עם עוברים מוזרקים בתא לחות.
- כדי לבנות תא כזה, לקחת כל קופסת פלסטיק עם מכסה, לחטא אותו עם 70% אתנול, לאפשר לו להתייבש, ולמקם רקמה ספוגה במים autoclaved בתחתית כדי לספק סביבה לחה. מניחים את תא הלחות הזה באינקובטור עם טמפרטורה מתאימה (במקרה זה, 25 °C) ומחזור אור של 14 שעות אור ו-10 שעה כהה.
- לאפשר לעוברים מוזרקים להתפתח לזחלים הראשונים, מה שדורש 4-5 ימים. נטר את התקדמות התפתחות העובר מדי יום באמצעות סטריאומיקרוסקופ כדי לזהות פנוטיפים לנוק-דאון גלויים מבחינה מורפולוגית כמתואר באות 2.
- תעד התקדמות זו על-ידי צילום תמונות דיגיטליות באמצעות מצלמה ברזולוציה גבוהה. הסר עוברים מתים ולחדש את המים על צלחת agarose מדי יום כדי למנוע הייסוס והתפשטות אפשרית של זיהום מיקרוביאלי לעוברים אחרים ששרדו במהלך תקופת הדגירה.
- לבצע פקדים מתאימים עבור זריקות dsRNA, כולל זריקות חוצץ, זריקות של dsRNA מסונתז נגד גדיל התחושה של הגן של עניין, וזריקות של dsRNA מסונתז נגד רצפים שאינם קיימים בתוך אורגניזם היעד. אשר נוקאאוט RNAi באמצעות שיטות מולקולריות נוספות22.
5. הכנת זחלי T. מרמורטוס לזריקות dsRNA
הערה: שלא כמו עוברים בשלב מוקדם, זחלי T. marmoratus הם חסונים יחסית ותו לא ניתן להזריק עם כרכים גדולים יותר. לדוגמה, instars השני ניתן להזריק עם עד 2 μL של פתרון עבודה dsRNA ו כוכבים שלישי עם לפחות 3 μL ללא השפעות שליליות מורגש על שיעור ההישרדות. כדי להזריק dsRNA, זה מועיל לשתק זחלים על ידי הטבעתם באגרוז.
- לפני איסוף הזחלים, להמיס 2% agarose ולשמור אותו באמבט מים ב 60-70 מעלות צלזיוס כדי לשמור אותו בצורה נוזלית. מכינים צלחת השתקה על ידי שפיכת 2% agarose לתוך צלחת פטרי קטנה ולאחר מכן קירור עד להתגבש. השתמש מגרסה בוטה כדי להפוך את גרוב רדוד בצלחת agarose (בערך בגודל של פרוקי רגליים להיות מוטבע) עבור כל בעל חיים כי יהיה מוזרק.
- אסוף זחלים צעירים בשלב ההתפתחותי המתאים (שלב אחד לפני השלב הרצוי לניתוח). כך, רוקנו בזהירות את המים מגביעי התרבות המכילים את הזחלים ובצעו את השלבים המוזכרים להלן.
- הרדמה על קרח (מוציאים בזהירות את הזחלים מספל המים שלה וממקמים אותו בעדינות על קרח) עד שהזחל לא מראה תנועות בולטות. השתמשו במקצות קהים ורכים כדי להרים בזהירות את הזחל מהקרח ולהניח אותו על במת ההתפלה עם צווארו וגופו בחרבוב, אך זנבו ממוקם מעל פני השטח של ה-agarose, כך שלא יהיה מכוסה, מה שמאפשר לזחל להמשיך לנשום דרך זנבו.
- מכסים את הזחל בשכבה עבה של א-גרוז שעדיין נוזלית אך לא חמה באופן מסוכן. אם הוא כוסה בטעות, השתמש במליצות כדי לשחרר את הזנב ואת שני הקטעים שמתחתיו מהאגרוז. ברגע שהאגרוז מתגבש, השתמש בזחלים לזריקות DSRNA.
6. מיקרו-תחכום dsRNA בזחלי מרמורטוס ט.
- להכין ולגבות מחט microinjection עם הכמות הרצויה של פתרון עבודה dsRNA ספציפי לגן (כמתואר בשלבים 4.1–4.2). חבר את המחט למחזיק מחט המחובר למזרק מיקרו-הזנב מבוקר ידנית. לפני חיבור המחט, למשוך את בוכנה מזרק כל הדרך החוצה כדי למנוע אוזל לחץ הזרקה באמצע ההליך.
- מקם את הזחל המותק כך שאתר ההזרקה, הממוקם בזווית בין מקטעי לוח הגוף השלישי והרביעי, מיושר עם המסלול של מחט microinjection בזווית שטוחה יחסית (כמעט במקביל לשלב).
הערה: לתלות את המחט ואת הזחלים בתנוחה זו חשוב, כפי שהוא מספק את הנתיב של התנגדות לפחות עבור קצה המחט כדי לניקוב הזחלים עם נזק מינימלי. - ברגע שהמחט והזחל היו ממוקמים, בזהירות להעביר את קצה המחט לתוך הזחל באמצעות micromanipulator תוך ניטור ההתקדמות באמצעות stereomicroscope.
- לאחר הקצה מנוקב את הרקמה, לאט ובזהירות להפעיל לחץ על המזרק. להתאים את לחץ ההזרקה על ידי התבוננות בתנועה של נוזל הזרקה צבעוני במחט מתחת למיקרוסקופ.
- בזהירות למשוך את המחט לאחר הזריקה. השתמשו במזחלות רכות כדי לקלף ולכן שחררו את הזחל מהאגרוז. להעביר את הזחל בחזרה לתוך מיכל עם מים (בטמפרטורת החדר) ולאפשר לו להתפתח עוד יותר באינקובטור או בחדר תרבות ב 25\u201228 °C ומחזור אור של 14 שעות אור ו 10 שעות כהה.
- השתמש בזריקות בקרה מתאימות וכמות נוק-דאון, כמתואר בשלב 4.10.
Representative Results
באמצעות הפרוטוקול המתואר לעיל, הפלנו שלושה גנים whiteשונים, כלשהם לבנים, laccase2 (lac2), ועדשה3 (שולחן 1), במגוון שלבים התפתחותיים שונים של חיפושית הצלילה Sunburst T. marmoratus. ביצענו RNAi ב T. marmoratus על ידי הזרקת dsRNA בשלב מוקדם מאוד במהלך embryogenesis(איור 1A). מכיוון שחלק מהעוברים אינם שורדים את התהליך ולהפוךלנמק (איור 1B),יש להסירם כדי לשמור על בריאות העוברים הנותרים. מופת כאן זריקות של dsRNA נגד הגן הלבן. גן זה ידוע ב Drosophila כאחד משלושה משגרי קלטת ATP מחייב (ABC) מעורב ספיגה ואחסון של מבשרי פיגמנטהעין 23. בהתאם לכך, אובדן התפקוד שלו תוצאה של פנוטיפ לא מנוון, עין לבנה. התוצאות שלנו מראות כי הזריקות של dsRNA white מיקוד הגן הלבן אורתולוגי בעוברי T. marmoratus מוביל לאובדן פיגמנטציה בעיניים בזחלים חדשים המתעוררים. במקרה זה, זחלי סוג פראי מאופיינים בעיניים פיגמנט כבד, ואת RNAi נוק-דאון של לבן מוביל לרמות שונות של הפחתה ואפילו חיסול מלא של פיגמנט עיניים. בסך הכל, ראינו לפחות ירידה מסוימת בצבע העיניים ב-34% מהעוברים ששרדו (n = 35). איור 2A משווה אדם בשליטה לבין אדם עם צבע עיניים מעט בהיר יותר. איור 2B ממחיש נוק-דאון חמור יותר באדם, שבו העיניים האוורניות יותר (עיניים 2-5) של האשכול אינן מנוקבות לחלוטין, בעוד שעיני הגב עדיין מראות פיגמנטציה מסוימת. הבדלים אלה מדגישים כיצד היעילות של הנוק-דאון יכולה להשתנות באופן אזורי, אשר עשוי להיות קשור להבדלים ביעילות של חדירה dsRNA ברקמה צפופה. אדם אחר מראה למעשה אובדן פיגמנט מוחלט בכל העיניים(איור 2C).
כדי לחקור כמה טוב RNAi עובד בשלב הזחל של T. marmoratus, הזרקנו dsRNA מיקוד lac2 גן tannic לתוך זחלים instar השני כמה ימים לפני שהם היו בשל molt לתוך instars שלישי (איור 3) והעריך את ההשפעה על צבע ציורי של זחלים instar השלישי. Lac2 הוא סוג של פנולוקסידאז המכין חלבונים באופן חמצוני כדי להפוך אותם לבודדים, קשים וכהים יותר. נוק-דאון חיפושית הקמח T. castaneum כבר הראה להוביל אנשים צבעוניים בהירים במינונים נמוכים, אבל נחשב קטלני במינוניםגבוהים 24. איור 4 ממחיש כי טיפול זה מוביל גם זחלי חיפושית Sunburst בצבע בהיר יותר. באופן ספציפי, בניסוי זה, 75% מהזחלים המוזרקים ששרדו (n = 12) הפחיתו פיגמנטציה (לעומת 0% בקבוצת הביקורת). איור 4א מראה אדם עם depigmentation מתון יחסית, בעוד איור 4C ממחיש את הראש של זחל T. marmoratus שבו הצבע הכהה של העורון כמעט נעדר. ההתגה הייתה בולטת במיוחד עבור התבניות הכהות המרכזיות האופייניות לזחלים אלה, בעוד שתבנית זו נותרה גלויה בבירור באדם שהוזרקלבקרה (איור 4B). בנוסף, נצפה הקלות של קנה הנשימה של הזנב, כפי שמתואר בדמות 4D. במקרה שבו lac2 dsRNA הוזרק לתוך זחלים instar השלישי, אנשים מבוגרים קלים יותר הושגו(איור 5). שימו לב כי כנפי החיפושית הנוקאאוט מעוותות במקצת, ככל הנראה בשל רכותה יוצאת הדופן.
בנוסף לשינוי תכונות מורפולוגיות, ניתן להשתמש ב-RNAi כדי למקד גנים המשפיעים על ההתנהגות. כדי להדגים זאת, ביצענו RNAi נגד גן קידוד חלבון עדשת מפתח, Lens318, והזרקנו אותו לתוך זחלים instar השני כדי להשפיע על המאפיינים האופטיים של עיני זחל instar שלישי. כל ההשפעות על העדשה שנצפתה כאן סביר להניח כי העיניים של T. זחלי marmoratus לעבור צמיחת עיניים גדולה במעבר זה, אשר כרוך גם שינויים אופטיים גדולים שלהעדשה 25. RNAi נוקאאוט בניסוי זה היה יעיל מאוד. אימות באמצעות qPCR הראה 100% אחוזי הצלחה; מתוך 13 אנשים שנבדקו, 12 הופלו לפחות מ-10% מרמת הביטוי של אנשים בעלי שליטה, כאשר הפרט הנותר בעל רמת ביטוי של 17% מרמת הבקרה (תצפית שלא פורסם). ברמה הפנוטיפית, רק אנשים מסוימים היו נכים קשות או לא מסוגלים ללכוד טרף, כפי שמוצג בדמות 6 לאדם שהתקרב שוב ושוב לטרפו ממרחק קרוב מאוד אך באופן עקבי התעופף עליו.
טבלה 1: רצפי פריימר ואפליונים לחלבונים לבנים, lac2 ו-Lens3. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
איור 1: איור של זריקות עובר. (א)עוברים מפורקים בשורה על צלחת agarose מוזרק ליד המרכז שלהם באמצעות מחט microinjection מלא dsRNA ומזון המכיל חיץ הזרקה. סרגל קנה המידה מייצג 500 μm. אדםעם נוק-דאון חמור יותר. עוברים מוזרקים נשמרים בתא לחות ומנווטרים מדי יום כדי להבקיע פנוטיפים ולהסיר אנשים מתים (שהפכו לחומים). סרגל קנה המידה מייצג 5 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: דוגמה לעוברים מפותחים שהוזרקו עם dsRNA נגד לבן. (א)השוואה של אדם עם ירידה בפיגמנטציה בעיניים (משמאל) ואדם שהוזרק לבקרה (מימין). E1-E6 מתייחסים לעיניים 1-6. (ב)אדם עם פנוטיפ נוק-דאון חמור יותר, אשר ממחיש כי, לפעמים, חלק מהעיניים בתוך האשכול מושפעים באופן חמור יותר על ידי הנוקאאוט מאחרים. (ג)אדם עם אובדן כמעט מוחלט של פיגמנטציה בעיניים. סרגל קנה המידה מייצג 200 μm; לוחות B ו- C מיוצגים באותו קנה מידה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: איור של זריקות זחל. (א)כמה זחלים משותקים על ידי הטבעה ב 2% agarose עם זנב שלהם spiracles עזב ברור של כל agarose. (ב)Microelectrode המכיל את פתרון ההזרקה ממוקם כך הקצה שלה יכול לחדור את קרום פיין בין שני מקטעים. (ג)צבע הזרקה כחול גלוי באתר ההזרקה לאחר הזריקה. פסים בקנה מידה מייצגים 1 ס"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: RNAi עבור laccase2 מוחל על זחלים instar השני וכתוצאה מכך צבעי ציור מופחת בזחלים instar השלישי. (א)אובדן צבע מתון יחסית באדם lac2 RNAi (למטה) בהשוואה לאדם מוזרק שליטה (למעלה). סרגל קנה המידה מייצג 5מ"מ. (ב)ראש של אדם שליטה המציג את התבנית האופיינית בצבע כהה במרכז הראש. (ג)נוק-דאון חמור יחסית של lac2 המוביל לאובדן כמעט מוחלט של צבע ראש מרכזי. (ד)אובדן צבע בציור הזנב הראשי של אדם lac2 RNAi (למטה) בהשוואה לאדם שהוזרק לבקרה (למעלה). הסתכם מייצגים 1 מ"מ. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: RNAi עבור laccase2 מוחל על זחל instar שלישי וכתוצאה מכך צבעי ציור מופחתבמבוגל. הפרט הנוקאאוט (שמאל) מאופיין גם elytra רך מאוד בהשוואה לפקד (מימין). סרגל קנה המידה מייצג 5 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: נוק-דאון של חלבון עדשה מרכזי המוביל לליקויים בלכידת טרף. אני לאיודע מה זה אומר. שלוש דוגמאות שבהן זחל חיפושית צלילה Sunburst, שבו גירעונות אופטיים היו מושרה באמצעות RNAi, לא הצליח ללכוד טרף (זחלי יתושים). תמונות סטילס מייצגות נבחרו מתוך הקלטת וידאו של לכידת טרף אופיינית. זחלשליטה תופס טרף. כל הסורגים בקנה מידה מייצגים 2 ס"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של דמות זו.
Discussion
המטרה שלנו היא כי אוסף זה של שיטות יהפוך RNAi זמין באופן נרחב, במיוחד כמו כלי זה נשאר טכניקה סינרגטית רבת עוצמה לעריכת גנים מבוססי CRISPR / Cas9, עם היתרון כי ניתן להחיל אותו על השלבים ההתפתחותיים הרצויים של אורגניזמים שנחקרו. כדי להדגים את הכוח הזה, הזרקנו dsRNA לעוברים ולתוך שלבי זחל שונים. זריקות לביצים השפיעו על התפתחות העוברים (איור 2), זריקותלשלב הזחל השני היו השפעות לכאורה על שלב הזחל השלישי (איור 4 ואיור 6),וזריקות לשלב הזחל השלישי הראו השפעות אצל המבוגרים (איור 5). בעוד התזמון המדויק צריך להיות מבוסס באופן ניסיוני, בדרך כלל, זריקות להשפיע בתוך כמה ימים. ההצלחה של תהליך זה יכולה להיות מושפעת מאורך רצף dsRNA. כאן, אנו הציגו דוגמאות באמצעות קצת מעל 200 bp ליותר מ 800 bp. ככלל, רצפים בין 100 ו 600 bp מעדיפים להגביל את ההשפעות מחוץ ליעד, אבל רצפים עד 1000 bp להניב תוצאות טובות22. שאלה אחת לגבי RNAi היא משך הנוקאאוט שניתן להשיג באמצעות טכניקה זו. מכיוון שהפנוטיפים היו סופניים בכל שלב, איננו יכולים להגיב על נושא זה בהתבסס על התוצאות המוצגות שלנו. עם זאת, זה כבר ציין בעבר כי השפעות RNAi הם בדרך כלל חיים ארוכים יחסית, כי ריכוזים גבוהים יותר להוביל נוקאאוטיםלאורך זמן 20.
מגבלה אחת של טכניקה זו היא שזה עובד טוב יותר עבור אורגניזמים מסוימים מאשר לאחרים, ונראה שאין דרך ישירה לחזות כמה טוב זה יעבוד פריורי. אף על פי כן, זה נמצא לעבוד היטב עבור מגוון גדול של אורגניזמים שונים. בתוך פרוקי רגליים, זה כולל עכבישים26,סרטנים 27, ומגוון רחב של חרקים, עם שיעורי הצלחה גבוהים במיוחד בסלקות28. סיבוך נוסף הוא כי הבדלים בחומרת פנוטיפ מתרחשים לעתים קרובות בין אנשים למרות היישום של אותה כמות של dsRNA. כפי שמוצג באות 2B, וריאציה יכולה להתרחש אפילו בתוך אדם. במחקרי RNAi שלנו מיקוד גנים שונים המעורבים T. מרמורטוס זחל העין התפתחות, מצאנו לעתים קרובות כי כמה עיניים מושפעים באופן חמור יותר מאחרים. תופעה זו עשויה להיות קשורה רקמה צפופה יחסית של אשכול העין, עם dsRNA טוב יותר מסוגל להגיע לחלק מהיחידות.
לביצוע מוצלח של ניסויי RNAi, זה קריטי כי מספר פרמטרים ממוטבים עבור גן היעד. לדוגמה, הריכוז של dsRNA ואת אורך הגן המיועד יכול להשפיע מאוד על התוצאה20. פרמטר קריטי נוסף הוא כיצד הזריקות מבוצעות, כמו תהליך זה יכול להשפיע מאוד על שיעור ההישרדות. עבור עוברים, השגנו את התוצאות הטובות ביותר על ידי מיקוד מרכז העובר. צלחת מונחת היטב מאפשרת הזרקה של 100 עוברים או יותר בפגישה אחת. עבור זחלים, זה קריטי להכניס את מחט ההזרקה בין המקטעים. These injections require more dsRNA, and based on larvae availability, our injection sets here typically only consisted of a few animals at a time. עבור כל הזריקות, זה קריטי כדי למנוע אוויר מלהיכנס האורגניזם.
במקרים מסוימים, לולאות המשוב של רשת רגולטורית גנטית ויתירות גנטית יכולות להשפיע על ההתפכחות של פנוטיפים RNAi, למרות נוקאאוטים עקביים. זה נראה המקרה עבור תצפיות התנהגותיות שלנו של זחלים עם נוקאאוטים מוצלחים מאוד של חלבון עדשה בולט, Lens318. למרות שאימתנו את היעילות הגבוהה של נוקאאוטים אלה באמצעות qPCR, וריאציה ניכרת נצפתה פנוטיפים הקשורים. תוצאה זו מדגישה את הצורך לכמת כראוי נוקאאוטים RNAi (לפרטים על אפשרויות ראה22). אם אין ציפייה פריורי ברורה לגבי פנוטיפים וכתוצאה מכך, דרך טובה לשלוט על ההשפעות מחוץ ליעד של RNAi היא למקד את אותו גן עם שני רצפים שאינם חופפים של dsRNA ולהעריך את התוצאות עבור פנוטיפים נפוצים.
בניגוד לטכניקות לעריכת גנים, RNAi הוא גם כלי רב עוצמה לחקר גנים קטלניים, ויש שתי דרכים לעשות זאת. לדוגמה, אם אחד מעוניין בתרומה הפונקציונלית של גן שבו אובדן של תפקוד בשלב מוקדם של הפיתוח ידוע להיות קטלני, חקירה פונקציונלית של גן כזה יכול להיות מושגת על ידי פשוט לאפשר לחיה להתפתח כרגיל ולאחר מכן להפיל את הגן באמצעות RNAi מאוחר יותר בפיתוח (כלומר, במבוגר). לחלופין, גן שבו אובדן מוחלט של תפקוד ידוע להיות קטלני יכול להיחקר באמצעות נוק-דאון חלקי, אשר ניתן להשיג על ידי הזרקת מגוון של ריכוזי dsRNA. חלק מהתוצאות שלנו להראות נוקאאוטים של lac2, אשר ידועים להיות קטלני אם העור בחרקים הופך רך מדי24. אפילו חיפושית RNAi lac2 המתוארת בדמות 5 לא יהיה סביר לשרוד מחוץ לתנאי מעבדה. גן קטלני נוסף נחתך, אשר קודים עבור גורם שעתוק כי הוא בסיסי עבור מפרט גורל התא במערכות איברים שונות פרוקי רגליים, נקשר להתפתחות גליה במערכת הראייה Drosophila 29. בהתבסס על הניסיון שלנו עם RNAi לחתוך בעוברי T. marmoratus, אנחנו יכולים לעורר פנוטיפים אינפורמטיביים בעיניים בעוברים שמסוגלים להשלים את התפתחות העין העוברית שלהם (תצפיות שלא פורסם). כאן, מינונים גבוהים יותר נראים להוביל שיעורי קטלניות גבוהים יותר, בעוד מינונים נמוכים יותר לגרום פנוטיפים נצפים אינפורמטיביים.
הפרוטוקול שלנו לא רק מפרט את הצעדים הדרושים לחוקר להמשיך ניסויים RNAi על T. marmoratus, כפי שתואר, אבל גם ישים בדרך כלל אורגניזמים אחרים, במיוחד אורגניזמים ימיים. בקרב אורגניזמים ימיים, יש כבר כמה דוגמאות בתוך סרטנים כגון פרעושים מים דפניה30 ושרימפס (לסקירה האחרונה,ראה התייחסות 31). ישנן הזדמנויות רבות בקרב חרקים ימיים, כפי שהם העריכו כי הם מהווים כ 6% מכל מגוון החרקים, עם סבירות יותר מ 200,000מינים 32. יתר על כן, RNAi כבר בוצע על מים striders הנוטים לאכלס את פני השטח של סביבות ימיות33. אם לא קיים גנום, אז ניתן להרכיב תעתיק של דה נובו. כל עוד תהליך זה חושף רציפים של כמה מאות נוקלאוטידים, dsRNA נגד גנים ספציפיים ניתן לתווע. הפרוטוקול שלנו לניתיקת חרקים באגרוז יהיה ככל הנראה שימושי גם עבור הליכים אחרים, במיוחד עבור אורגניזמים רכים, גמישים, וים. יחד, RNAi נשאר טכניקה רבת עוצמה למניפולציה ביטוי גנים בקבוצה מגוונת של אורגניזמים, גם כאשר אין כלים מולקולריים וגנטיים אחרים זמינים.
Disclosures
לסופרים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
ברצוננו להודות לד"ר ג'וש בנואה על עזרתו בביואיינפורמטיקה היילי טובלר על עזרתה בהעלאת אנברסט צללית ותמרה פייס לסיוע עריכה. מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדע תחת מענקים IOS-1456757 ו IOS-1856341 כדי EKB ו IOS1557936 ל YT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. RNA isolation and de novo transcriptome assembly | |||
| liquid nitrogen | University Stockroom | Typically locally available at research institutions | |
| pipette tips | Fisher Scientific | size dependent | Products from other vendors would work equally well |
| RNeasy lipid tissue mini kit (RNA isolation kit) | Qiagen | 74804 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| spectrophotometer (NnanoDrop) | Thermo Fisher | 9836674 | Other models would work equally well |
| 1.2. De novo transcriptome assembly. | |||
| BUSCO.v3 | https://busco.ezlab.org/ | Any freely available software for assessing trasncriptome completeness can be used. | |
| CLC Genomics workbench | Qiagen | 832021 | Other equivalent software packages are also available |
| Galaxy workbench | https://usegalaxy.org/ | An open source online transcriptome assembly & annotation pipeline | |
| NCBI BLASTx | https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?LINK_LOC=blasthome&PAGE_TYPE=BlastSearch&PROGRAM=blastx | An open source online alignment and annotation pipeline | |
| 2. cDNA synthesis, Cloning & Miniprep isolation | |||
| ampicillin sodium salt | Gibco | 11593-027 | Products from other vendors would work equally well |
| glycerol | Fisher Scientific | G33-500 | Products from other vendors would work equally well |
| LB broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | Products from other vendors would work equally well |
| Omniscript RT (reverse trasncription) kit | Qiagen | 205111 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| One Shot™ TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404010 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | Products from other vendors would work equally well |
| PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit | ThermoFischer | 771471 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| shaker-incubator | Labnet | 211DS | Other models would work equally well |
| spectrophotometer (NnanoDrop) | Thermo Fisher | 9836674 | Other models would work equally well |
| thermal cycler for PCR | BioRad | T100 | Other models would work equally well |
| TOPO TA Cloning kit | Invitrogen | 1845069 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| X-Gal Solution | Thermo Scientific | R0941 | Products from other vendors would work equally well |
| 2.2 PCR amplification & in vitro dsRNA synthesis | |||
| Centrifuge | Fisher Scientific | accuSpin Micro 17R | Other models would work equally well |
| ethanol | Fisher Scientific | A4094 | Products from other vendors would work equally well |
| FastTaq DNA Polymerase, dNTPack | Roche | 13873432 | This kit contains all the reagents necessary for a PCR |
| MEGAclear Transcriiption clean up kit | ThermoFischer | AM1908 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| MEGAscript T7 Transcription kit | ThermoFischer | AM1334 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| nuclease-free water | Fisher Scientific | AM9932 | Products from other vendors would work equally well |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| sodium acetate | Fisher Scientific | BP333-500 | Make 3M working solution |
| Spectrophotometer (NnanoDrop) | Thermo Fisher | 9836674 | Other models would work equally well |
| 3. Collecting and preparing early stage T. marmoratus embryos for dsRNA injections | |||
| agarose | Fisher Scientific | 9012-36-6 | Products from other vendors would work equally well |
| distilled water | Fisher Scientific | 9180 | Products from other vendors would work equally well |
| forceps (Dumon #4 Biology) | Fine Science Tools | 11242-40 | Products from other vendors would work equally well |
| glass cavity dish (3 well-dish) | Fisher Scientific | 50-243-43 | Products from other vendors would work equally well |
| microwave | Welbilt | turn-table | Other models would work equally well |
| natural hair paintbrush | Amazon | Any fine brush will do | |
| P1000 micro-pipetter | Gilson | F123602 | Other models would work equally well |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | Products from other vendors would work equally well |
| stereomicroscope | Microsocope Central | 10446293 | Any good stereomicroscope will work |
| transfer pipettes | Fisher Scientific | 21-200-109 | Products from other vendors would work equally well |
| 4. dsRNA micro-injections in early stage T. marmoratus embryos | |||
| digital camera | Edmund optics (Qimaging) | Retiga 2000R | Other models would work equally well |
| ethanol | Fisher Scientific | A4094 | Products from other vendors would work equally well |
| food dye | Kroger | Any available food dye should work fine | |
| humidity chamber | take any plastic box with a lid, sterilize it with 70% ethanol and let it dry | ||
| incubator | Labline | 203 | Other models would work equally well |
| injection buffer | Prepared for 1 mL following reference #22 : Mix 10 µL of 0.1 M sodium phosphate buffer, 100 µL of 0.5 M potassium chloride solution, 100 µL of food dye and 790 µL of double-distilled water. Store in 4 °C. | ||
| intracellular Microinjection Systems (Picospritzer) | Parker | 052-0500-900 | Currently the model III is available, but older models work also |
| micro needle holder | A-M Systems | 672441 | Other products would work equally well |
| microinjection needles (1.2 mm x 0.68 mm, 4 inches) | A-M Systems | 603000 | Other models would work equally well |
| micromanipulator | Drummond Scientific Company | 3-000-024-R | Any quality micromanipulator will work |
| monosodium phosphate | Fischer scientific | 7558-80-7 | To make 10 mL of 1 M working solution: Add 1.2 g of monosodium phosphate powder to 10 mL of Double distilled water and mix until clear solution is obtained |
| P-1000 Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-1000 | Puller settings:Heat 575, Pull 60, Velocity 75 Delay 110, Pressure 700. |
| P10 micro-pipetter | Gilson | F144802 | Other models would work equally well |
| P1000 micro-pipetter | Gilson | F123602 | Other models would work equally well |
| potassium chloride | Fischer scientific | 7447-40-7 | To make 100 mL of 0.5 M potassium chloride solution: Add 3.73 g of potassium chloride crystals to 100 mL of double distilled water and mix until clear solution is obtained. |
| sodium phosphate buffer (0.1M) | To make 10 mL of 0.1 M of this buffer: Mix 8.5 mL of 1 M sodium phosphate dibasic solution with 1.5 mL of 1 M monosodium phosphate solution. Check the pH with a pH meter and adjust accordingly to pH 7.6 at room temprature. | ||
| sodium phosphate dibasic | Fischer scientific | 7558-79-4 | To make 10 mL of 1 M working solution: Add 1.42 g of sodium phosphate dibasic powder to 10 mL of Double distilled water and mix until clear solution is obtained |
| stereomicroscope | Microsocope Central | 10446293 | Any good stereomicroscope will work |
| 5. Preparing T. marmoratus larvae for dsRNA injections | |||
| agarose | Fisher Scientific | 9012-36-6 | Products from other vendors would work equally well |
| forceps (Dumon #4 Biology) | Fine Science Tools | 11242-40 | Products from other vendors would work equally well |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | Products from other vendors would work equally well |
| 6. dsRNA micro-injections in T. marmoratus larvae | |||
| injection buffer (10x) | See section 4 | ||
| microinjection needles (1.2 mm x 0.68 mm, 4 inches) | A-M Systems | 603000 | Other models would work equally well |
| microinjection syringe | A-M Systems | 603000 | Other models would work equally well |
| micro needle holder | A-M Systems | 672441 | Other products would work equally well |
| P-1000 Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-1000 | Puller settings:Heat 575, Pull 60, Velocity 75 Delay 110, Pressure 700. |
| stereomicroscope | Microsocope Central | 10446293 | Any good stereomicroscope will work |
References
- Muller, B., Grossniklaus, U. Model organisms - A historical perspective. Journal of Proteomics. 73, 2054-2063 (2010).
- Gilbert, L. A., et al. CRISPR-Mediated Modular RNA-Guided Regulation of Transcription in Eukaryotes. Cell. 154, 442-451 (2013).
- Westerman, E. L., et al. Aristaless Controls Butterfly Wing Color Variation Used in Mimicry and Mate Choice. Current Biology. 28, 3469 (2018).
- Perry, M., et al. Molecular logic behind the three-way stochastic choices that expand butterfly colour vision. Nature. 535, 280 (2016).
- Boettcher, M., McManus, M. T. Choosing the Right Tool for the Job: RNAi, TALEN, or CRISPR. Molecular Cell. 58, 575-585 (2015).
- Meister, G., Tuschl, T. Mechanisms of gene silencing by double-stranded RNA. Nature. 431, 343-349 (2004).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
- Kennerdell, J. R., Carthew, R. W. Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway. Cell. 95, 1017-1026 (1998).
- Mello, C. C., Conte, D.
- Agrawal, N., et al. RNA interference: Biology, mechanism, and applications. Microbiol. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67, 657 (2003).
- Gu, L. Q., Knipple, D. C. Recent advances in RNA interference research in insects: Implications for future insect pest management strategies. Crop Protection. 45, 36-40 (2013).
- Ravisankar, P., Lai, Y. T., Sambrani, N., Tomoyasu, Y. Comparative developmental analysis of Drosophila and Tribolium reveals conserved and diverged roles of abrupt in insect wing evolution. Developmental Biology. 409, 518-529 (2016).
- Tomoyasu, Y., Wheeler, S. R., Denell, R. E. Ultrabithorax is required for membranous wing identity in the beetle Tribolium castaneum. Nature. 433, 643-647 (2005).
- Tomoyasu, Y., Arakane, Y., Kramer, K. J., Denell, R. E. Repeated Co-options of Exoskeleton Formation during Wing-to-Elytron Evolution in Beetles. Current Biology. 19, 2057-2065 (2009).
- Yang, X., et al. Probing the Drosophila retinal determination gene network in Tribolium (II): The Pax6 genes eyeless and twin of eyeless. Developmental Biology. 333, 215-227 (2009).
- ZarinKamar, N., et al. The Pax gene eyegone facilitates repression of eye development in Tribolium. Evodevo. 2, 15 (2011).
- Linz, D. M., Clark-Hachtel, C. M., Borras-Castells, F., Tomoyasu, Y. Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum. Journal of Visualized Experiments. , e52059 (2014).
- Stahl, A., S, B. R., Cook, T. A., Buschbeck, E. K. A complex lens for a complex eye. Integrative and Comparative Biology. 57, 1071-1081 (2017).
- Yeku, O., Frohman, M. A. Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE). RNA, Methods In Molecular Biology. , Springer. 107-122 (2011).
- Miller, S. C., Miyata, K., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. Dissecting Systemic RNA Interference in the Red Flour Beetle Tribolium castaneum: Parameters Affecting the Efficiency of RNAi. Plos One. 7, (2012).
- Tomoyasu, Y., Denell, R. E. Larval RNAi in Tribolium (Coleoptera) for analyzing adult development. Development Genes and Evolution. 214, 575-578 (2004).
- Philip, B. N., Tomoyasu, Y. Molecular Methods for Evolutionary Genetics. Orgogozo, V., Rockman, M. V. , Humana Press. 471-497 (2011).
- Mackenzie, S. M., Howells, A. J., Cox, G. B., Ewart, G. D. Sub-cellular localisation of the White/Scarlet ABC transporter to pigment granule membranes within the compound eye of Drosophila melanogaster. Genetica. 108, 239-252 (2000).
- Arakane, Y., Muthukrishnan, S., Beeman, R. W., Kanost, M. R., Kramer, K. J. Laccase 2 is the phenoloxidase gene required for beetle cuticle tanning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 11337-11342 (2005).
- Werner, S., Buschbeck, E. K. Rapid and step-wise eye growth in molting diving beetle larvae. Journal of Comparative Physiology. 201, 1091-1102 (2015).
- Prpic, N. M., Schoppmeier, M., Damen, W. G. Gene Silencing via Embryonic RNAi in Spider Embryos. Cold Spring Harbor protocols. 3, 1-4 (2008).
- Sagi, A., Manor, R., Ventura, T. Gene Silencing in Crustaceans: From Basic Research to Biotechnologies. Genes. 4, 620-645 (2013).
- Zhu, K. Y., Palli, S. R. Annual Review of Entomology. Douglas, A. E. 65, Annual Reviews. 293-311 (2020).
- Bauke, A. C., Sasse, S., Matzat, T., Klaembt, C. A transcriptional network controlling glial development in the Drosophila visual system. Development. 142, 2184 (2015).
- Lin, C. Y., et al. RNAi analysis of doublesex1 expression in Daphnia pulex Leydig, 1860 (Cladocera). Crustaceana. 92, 137-154 (2019).
- Nguyen, D. V., Christiaens, O., Bossier, P., Smagghe, G. RNA interference in shrimp and potential applications in aquaculture. Reviews in Aquaculture. 10, 573-584 (2018).
- Dijkstra, K. D. B., Monaghan, M. T., Pauls, S. U. Annual Review of Entomology. Berenbaum, M. R. 59, Annual Reviews. 143-163 (2014).
- Crumiere, A. J. J., Khila, A. Hox genes mediate the escalation of sexually antagonistic traits in water striders. Biology. Letters. 15, 5 (2019).
