Summary
RNA-interferens er en bredt anvendelig, kraftfuld teknik til at manipulere genekspression på bestemte udviklingsstadier. Her beskriver vi de nødvendige skridt til at gennemføre denne teknik i den akvatiske dykning bille Thermonectus marmoratus, fra erhvervelse af gensekvenser til knockdown af gener, der påvirker struktur eller adfærd.
Abstract
RNA interferens (RNAi) er fortsat en kraftfuld teknik, der giver mulighed for målrettet reduktion af genekspression gennem mRNA nedbrydning. Denne teknik gælder for en bred vifte af organismer og er meget effektiv i den artsrige orden Coleoptera (biller). Her opsummerer vi de nødvendige skridt til at udvikle denne teknik i en ny organisme og illustrerer dens anvendelse på de forskellige udviklingsstadier i den akvatiske dykkerbille Thermonectus marmoratus. Målgensekvenser kan opnås omkostningseffektivt gennem samling af transkriptik mod en nær slægtning med kendt genomik eller de novo. Kandidat gen kloning udnytter en specifik kloning vektor (pCR4-TOPO plasmid), som giver mulighed for syntesen af dobbeltstrenget RNA (dsRNA) for ethvert gen med brug af en enkelt fælles primer. Det syntetiserede dsRNA kan sprøjtes ind i enten embryoner til tidlige udviklingsprocesser eller larver til senere udviklingsprocesser. Vi illustrerer derefter, hvordan RNAi kan injiceres i akvatiske larver ved hjælp af immobilisering i agarose. For at demonstrere teknikken giver vi flere eksempler på RNAi-eksperimenter, der genererer specifikke knockdowns med forudsagte fænotyper. Specifikt, RNAi for garvning gen laccase2 fører til neglebånd afhjævning i både larver og voksne, og RNAi for øjet pigmentering gen hvid producerer en afhænding / manglende pigmentering i øjet rør. Desuden fører knockdown af en vigtig linse protein til larver med optiske mangler og en reduceret evne til at jage bytte. Kombineret, disse resultater eksemplificere magt RNAi som et redskab til at undersøge både morfologiske mønstre og adfærdsmæssige træk i organismer med kun transskriptionomic databaser.
Introduction
Spørgsmålet om, hvordan specifikke gener bidrager til udviklingen af forskellige træk er et spændende emne i biologi. I løbet af de sidste par årtier er der gjort store fremskridt med hensyn til dissekering af de genetiske fundamenter for udviklingsprocesser i nogle få model organismer, såsom nematode Caenorhabditis elegans, frugtfluen Drosophila melanogaster, og huset mus mus musculus1. For nylig har opfindelsen af kraftfulde genredigeringsteknikker såsom grupperet regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentagelser (CRISPR)/Cas92 givet mulighed for at ændre den genetiske kode af ikke-model organismer (for eksempelse 3,4). Som følge heraf har der været en stigning i genetiske undersøgelser af en række forskellige organismer, der ikke tidligere var blevet kontaktet gennem molekylære teknikker. I betragtning af den enorme mangfoldighed af vores dyreriget, med mange interessante træk eller træk varians, der kun er repræsenteret i bestemte arter, har dette fremskridt gjort det til en spændende tid for evolutionær-udviklingsmæssige biologi ("evo-devo") relateret arbejde. Genomredigeringsteknikker, der er tilgængelige for ikke-modelorganismer, er imidlertid relativt begrænsede med hensyn til de udviklingsmæssige tidspunkter, som de kan anvendes på, hvilket gør det udfordrende at skelne de tidsmæssige egenskaber relateret til den rolle, som specifikke gener spiller i ethvert træk. Desuden er transgene teknikker ofte begrænset til gener, der ikke er væsentlige for overlevelse (dvs. hvis knockout ikke resulterer i dødelighed). Selv om genredigeringsteknikker er begyndt at blive populære, er der derfor stadig behov for effektive teknikker, der gælder for en række forskellige organismer på bestemte udviklingstidspunkter og letter delvise knockdowns (snarere end fuldstændig tab af funktion). Her henleder vi opmærksomheden på RNA-interferens (RNAi), en noget dateret, men kraftfuld gen knockdown teknik5, der er særligt værdifuld som en synergistisk tilgang til genredigering. Konkret udviklede vi procedurer, der giver mulighed for anvendelse af RNAi på vanddykning biller som et eksempel, der illustrerer gennemførelsen af denne teknik, fra erhvervelse af de nødvendige molekylære sekvenser til en vellykket injektion af dobbeltstrenget RNA (dsRNA) i æg og larver.
RNAi-baserede gen knockdown udnytter en medfødt forsvarsmekanisme af organismer, hvor dsRNA molekyler lette hæmning af invaderende nukleinsyre sekvenser, såsom vira og transposons6. Kort sagt tages dsRNA op i cellen, hvor det skæres i 20-25 nukleotidstykker af Dicer-enzymet. Disse stykker aktiverer derefter dannelsen af det RNA-inducerede lyddæmningskompleks (RISC), som hæmmer det målrettede mRNA ved at binde sig til det på bestemte steder ved hjælp af styrestrengen. Denne proces fører i sidste ende til mRNA-nedbrydning og forstyrrer dermed oversættelsen af mRNA til det respektive protein6. Den RNAi-baserede gen knockdown teknik præsenteret her derfor er afhængig af injektion af dsRNA. For dyremodeller blev denne teknik oprindeligt udviklet i C. elegans7 og D. melanogaster8, men har siden vist sig som et kraftfuldt funktionelt genetisk værktøj i ikke-model organismer9,10. På grund af sin meget effektive karakter i nogle insekter, RNAi kan endda anvendes i skadedyrsbekæmpelse11.
Som et forskningsværktøj er RNAi blevet brugt til at undersøge, hvordan centrale molekylære udviklingsveje fungerer i utraditionelle insektmodeller. For eksempel har RNAi i melbillen Tribolium castaneum været medvirkende til at bestemme, hvor dybt bevarede gener bidrager til specifikke træk i denne bille, som eksemplificeret for udviklingen af specielt formedevinger 12,,13,14 og øjne15,16. De teknikker, der ligger til grund for manipulationer i T. castaneum er blevet godt beskrevet17 og stole på evnen til at immobilisere relativt tørre æg og larver på en klæbrig overflade. En sådan immobilisering er dog ikke muligt for de våde udviklingsformer af akvatiske organismer såsom Sunburst Diving Beetle Thermonectus marmoratus. Som det er tilfældet for mange utraditionelle modelorganismer, mangler det et kommenteret genom. At manipulere genekspression i enhver organisme uden et genom, en rimelig og omkostningseffektiv første skridt er at generere transkriptoer og identificere de formodede nukleotid sekvenser af de udtrykte gener af interesse baseret på sekvens lighed med beslægtede, men mere etablerede model organismer, i dette tilfælde, primært Tribolium (Coleoptera) og Drosophila gener.
Her, for at vise, hvordan RNAi kan bruges på en akvatisk organisme, diskuterer vi først protokoller og software til RNA-ekstraktion og transskriptionsgenerering og samling, som gør det muligt at identificere specifikke målrettede gensekvenser. Vi opsummerer derefter de nødvendige trin til syntetisering af genspecifik dsRNA. Efterfølgende illustrerer vi, hvordan æg kan injiceres i et vandmiljø og demonstrere inkubationsprotokoller til dyrkning af embryoner. Derudover viser vi, hvordan agarosegel kan bruges til helt at immobilisere larver under injektionsprocessen, en teknik, der generelt er nyttig under forskellige procedurer og kan anvendes på en række leddyr. For at demonstrere, hvordan RNAi kan anvendes på forskellige udviklingsstadier, inkluderer vi et eksempel, hvor vi gjorde øjet pigmenteringsgen hvidt i embryoner. Derudover beskriver vi et eksempel, hvor solariet laccase2(lac2) blev bragt til tavshed under både den anden larveinstjerne (for at påvirke larver af den tredje larve instar) og den tredje larve instar (til at påvirke voksne). Endelig viser vi, at injektionen af en lavere koncentration af dsRNA fører til delvis knockdown, hvilket viser, at denne teknik også kan anvendes på gener, hvor funktionstab vides at være dødelig.
Protocol
1. RNA isolation og de novo transskriptør samling
- Udfør total RNA isolation fra slutningen af tredje fase instar dykning bille larve øjenrør og voksne biller ved hjælp af en RNA isolation kit (se Tabel over materialer),der er designet til lipid-rige væv. Isoler total RNA fra T. marmoratus og sekvens det efter tidligere beskrevne metoder18.
- De novo transcriptome samling
BEMÆRK: For at samle transcriptome de novo kan der anvendes forskellige bioinformatikplatforme (se Materialetabel). Disse platforme er kommercielt tilgængelige og findes i nogle tilfælde som Unix-baserede kommandolinjescripts. Da samlingen er de novo, anbefales det at samle transskriptoerne uafhængigt på to platforme og sammenligne resultaterne for at udelukke falske positiver eller falske negativer.- For at begynde at samle transskriptomer, uploade den rå læser på de respektive bioinformatik platform.
BEMÆRK: Disse filer er normalt komprimeret og i formatet FASTQSANGER. Gz. Der er ingen grund til at dekomprimere filerne, da dette format accepteres i næste trin. - Ved hjælp af trimmomatic kommandolinjen skal du trimme de rå læsninger for at fjerne adaptersekvenser eller korte læsninger, der falder under standardtærsklen. Dekomprimere de trimmede rå læser; filerne vil nu være i FASTQ-format. Sammenkæd FASTQ raw-aflæsningerne for hver prøve for at få filer, der er klar til de novo-samling.
- Saml de sammenkædede rå læser de novo ved hjælp af enhver kommandolinje script, der kan samle transcriptomes de novo. Gem den samlede transcriptome, som nu vil have en liste over contigs med deres respektive sekvenser, som en FASTA fil. For at øge dækningen af samlingen, kombinere og samle flere transcriptomes for de samme arter.
BEMÆRK: Denne proces øger chancerne for at generere mere præcise contigs og er især vigtigt, hvis lav kopi antal gener er af interesse. - Når den er samlet, skal du vurdere transskriptomen for fuldstændighed ved at beregne dækningsresultater (dækningsvurderingssoftware er frit tilgængelig, se Materialetabel).
BEMÆRK: En transskription med en dækningsscore >75% anses for at være god. Relevansen af denne score afhænger imidlertid af årsagen til transcriptome generation. For eksempel, hvis transcriptome bliver brugt til at identificere lav kopi nummer gener, så en score > 85% er bedre, da det betyder større dækning. - Anmærke de novo samlet transskriptom ved hjælp af en grundlæggende lokal justering søgeværktøj (BLAST; se Tabel over materialer).
BEMÆRK: Til dette eksperiment blev transskriptomen primært kommenteret mod en database over kendte Drosophila-proteiner og en database over kendte billeproteiner. Listen over anmærkninger kan downloades som en regnearksfil og contig /contigs, der angiver sekvenslighed til proteiner fra andre organismer kan downloades som en FASTA-fil. - Identificer sammenhængende tal/tal for det protein, der er af interesse, og ekstrakt nukleotidsekvenserne. Brug BLAST til at identificere, om proteinspecifikke bevarede områder (f.eks. homeobox-domæner) er til stede i den kommenterede nukleotidsekvens. Tjek andre contigs med den samme anmærkning for nukleotid sekvens overlapninger til at generere sekvensen af en gen-specifik udskrift.
BEMÆRK: Det er normalt ikke muligt for alle gener at identificere sammenstigere med sekvensoverlapning, især for gener med lavt antal. - Hvis fuld-længde sekvens af genet er nødvendig, skal du starte med den contig, der har den højeste sekvens lighed som et indledning punkt for at identificere nukleotid sekvens af hele modne udskrift ved hjælp af teknikker såsom 3 'og 5 ' hurtig forstærkning af cDNA ender (RACE19).
- Anmærke samlingen fra den anden platform efter trin 1.2.4-1.2.7.
BEMÆRK: Ideelt set bør resultaterne være ens for proteiner af interesse; Dækningen kan dog til en vis grad variere mellem platforme. - Brug den samlede transskription til at syntetisere artsspecifikt dsRNA som beskrevet i afsnit 2.
- For at begynde at samle transskriptomer, uploade den rå læser på de respektive bioinformatik platform.
2. Kloning og genspecifik dsRNA-syntese
BEMÆRK: Genspecifik kloning og dsRNA-syntese er blevet beskrevet i detaljer for T. castaneum20,21,22. Følgende trin er en kort oversigt.
- Kloning, bakterietransformation og plasmidsekventering
- Isoler det samlede RNA fra organismen (som beskrevet i trin 1.1) og opret supplerende DNA (cDNA) ved hjælp af et omvendt transskriptionssæt (se Materialetabel). Identificer en eller to 100-1000 bp nukleotidsekvenser fra contigs, der er specifikke for gener af interesse.
- Design primer par spænder over hele den identificerede strækning af nukleotider og forstærke sekvensen gennem en polymerase kædereaktion (PCR). Tilføj en ekstra 30 min skridt i slutningen at skabe 3 'adenine udhæng i forstærket DNA-produkt. Rens dette produkt ved hjælp af et PCR-rensesæt (se Materialetabel).
- Klon det rensede produkt i en pCR4-TOPO plasmid vektor (se Tabel over materialer)efter sælgerens protokol, der følger med kloningssættet. Brug varmechok behandling omdanne klonede plasmider i kompetente bakterieceller (stamme: E.coli DH10B) efter sælgerens protokol for kompetente celler (se Tabel over materialer), og skærmen for vellykket omdannede celler.
BEMÆRK: Plader med kolonier kan indpakkes i paraffinfilm for at bevare fugt og opbevares ved 4 °C i op til en måned. - Pluk kolonier af transformerede celler ved hjælp af en 10 μL pipettespids og -kultur i lysogen bouillon (LB), der indeholder ampicillin (50 μg/ml) i en ryste-inkubator ved 37 °C og 200 omdr./min. i 24 timer.
BEMÆRK: Til langtidsopbevaring kan dyrkede celler fortyndes 1:1 med 100% glycerol og fryses ved -80 °C som glycerollagre. - Isoler plasmider, der indeholder genet af interesse fra denne kultur ved hjælp af en miniprep isolation kit (se Tabel over materialer). De isolerede plasmider (minipreps) opbevares ved -20 °C efter vurdering af udbyttetspektrofotometrisk. Prøveabsorberingen måles specifikt ved 260 nm, 280 nm og 230 nm. Forholdet A260/A280 for kvantificering af DNA og A260/A230 til kvantificering af DNA-renhed.
BEMÆRK: Et 260/280 forhold på 1,8 er generelt accepteret som tilstrækkeligt ren DNA, nøgletal lavere end 1,5 angiver tilstedeværelsen af resterende ekstraktion reagenser såsom phenol. Forholdet 260/230 skal være større end eller lig med forholdet 260/280. Lavere nøgletal indikerer resterende reagensforurening. Udbyttet varierer typisk fra 100 til 500 ng/μL. - Sekvens de isolerede minipreps at bekræfte, at det gen-specifikke fragment er blevet integreret med succes, flankeret mellem 5 'T7 og 3'T3 promotor regioner i plasmid; dette kan gøres ved hjælp af universelle T7 og T3 sekventering primere22. Brug minipreps med den genspecifikke sekvens af interesse for dsRNA præparat.
- Isoler det samlede RNA fra organismen (som beskrevet i trin 1.1) og opret supplerende DNA (cDNA) ved hjælp af et omvendt transskriptionssæt (se Materialetabel). Identificer en eller to 100-1000 bp nukleotidsekvenser fra contigs, der er specifikke for gener af interesse.
- PCR-forstærkning og in vitro dsRNA-syntese
- PCR-forstærkning og rensning af produkter
- Design plasmid-specifikke eller genspecifikke primere, der har T7-promotorsekvensen på deres 5' sider (se reference22 for detaljer) for at forstærke et lineært fragment af det indsatte gen. Optimer udbyttet ved at opsætte mindst 10 reaktioner på 20 μL hver.
BEMÆRK: Det resulterende produkt er flankeret af to 20 bp T7 polymerase bindingssteder. - Rens PCR-produktet ved hjælp af et PCR-produktrensningssæt (se Materialetabel)efter leverandørens kolonnebaserede elution-protokol. For at øge udbyttet gentages det endelige elution-trin op til 3 gange med samme elueringstrin. Vurder udbyttet spektrofotometrisk.
BEMÆRK: Udbyttet varierer normalt fra 100 til 700 ng/μL. Dette rensede produkt kan opbevares ved -20 °C indtil videre brug.
- Design plasmid-specifikke eller genspecifikke primere, der har T7-promotorsekvensen på deres 5' sider (se reference22 for detaljer) for at forstærke et lineært fragment af det indsatte gen. Optimer udbyttet ved at opsætte mindst 10 reaktioner på 20 μL hver.
- In vitro dsRNA syntese og rensning
- Brug det genspecifikke PCR-rensede produkt til at syntetisere dsRNA in vitro i henhold til protokollen for et dsRNA-syntesesæt af valg. Hvis det er nødvendigt, forlænge inkubationstiden for øget dsRNA-produktion.
- Vurder reaktionens progression baseret på reaktionsblandingens opacitet (jo større dsRNA-produktets mængde er, jo højere turbiditet). Ved inkubationens afslutning skal reaktionen stoppes ved hjælp af en DNase-behandling. For at gøre dette tilsættes 1 μL fra en bestand på 2 U / μL, til reaktionsblandingen. Udvid denne behandling til 1-2 timer for at sikre optimal nedbrydning af skabelon-DNA'et.
- Rens dsRNA med et renselsessæt eller via følgende trin.
- Det resulterende produkt fortyndes med 115 μL nukleasefrit vand og tilsættes 15 μL 3 M natriumacetat. Tilsæt 2 volumener iskold 100% ethanol til denne reaktionsblanding og udfælde dsRNA natten over ved -20 °C.
BEMÆRK: På dette tidspunkt kan prøverne opbevares sikkert uden at påvirke det endelige udbytte. - Centrifuger bundfaldet ved 0 °C i 20 min ved 9000 x g og kassér supernatanten. Produktet vaskes én gang med iskold 70% ethanol og centrifuge i 15 min ved 13000 x g.
- Fjern supernatanten og lufttør pellet i 5-15 min. Opsvar pellet i op til 40 μL nukleosfrit vand (dette volumen kan justeres baseret på den isolerede pelletstørrelse) og vurdere udbyttet og renhedsspektrofotometrisk, som beskrevet i 2.1.4.
- Den rensede dsRNA opbevares ved -20 °C indtil videre brug. Brug det rensede dsRNA til injektion på det ønskede udviklingsstadiet.
- Det resulterende produkt fortyndes med 115 μL nukleasefrit vand og tilsættes 15 μL 3 M natriumacetat. Tilsæt 2 volumener iskold 100% ethanol til denne reaktionsblanding og udfælde dsRNA natten over ved -20 °C.
- PCR-forstærkning og rensning af produkter
3. Indsamling og fremstilling af tidlige fase T. marmoratus embryoner til dsRNA injektioner
- Forbered en agarose plade til inkubation af T. marmoratus embryoner.
- Først opløses 20 mg lavt smeltende agarosepulver i 100 ml autoklaveret destilleret vand (2% agarose), og kog derefter denne blanding i en mikrobølgeovn, indtil der opnås en klar opløsning. Pas på med den varme opløsning, da luftbobler kan få den til at flyde over.
- Denne opløsning dises i en lille petriskål. For at gøre riller (som vil holde embryoner) på overfladen af agarose plade, placere tre 1-2 mm brede plastrør (såsom spidsen af plast overførsel pipetter) på overfladen af væsken agarose før det størkner.
- Når agarose størkner, bruge et par stumpe kraftker til at fjerne disse rør. Der tilsættes 500 μL autoklaveret destilleret vand ved hjælp af en P1000-mikropipette til dækning af disse fordybninger i agarose.
- Ved hjælp af en fin naturlig hår pensel, indsamle T. marmoratus embryoner, der er 5-8 h gamle fra billen redepladser i et glas hulrum fad fyldt med autoklaveret destilleret vand. Overvåg nesting steder ofte for at sikre, at de opnåede æg er af den rette alder.
- Dechorionate embryonerne under et stereomikroskop ved hjælp af fine dissektionsforrævlser. For at gøre dette, visualisere chorion under mikroskopet (ved den ønskede forstørrelse) ved at placere lyskilden i en passende vinkel, derefter få fat i chorion fra to sider med skarpe kraftbecer, rip det åbne, og forsigtigt skubbe fosteret ud. Da der er to lag, skal du sørge for, at begge er fjernet.
- Ved hjælp af en fin naturlig hår pensel, omhyggeligt overføre embryoner fra glas hulrum parabol til agarose plade og arrangere dem i rillerne under et stereomikroskop. Vær meget forsigtig under denne proces, da dechorionerede embryoner er meget skrøbelige. Brug de forberedte embryoner til dsRNA-injektioner.
BEMÆRK: Den lidt tykkere ende er den side af fosteret, hvor hovedet vil udvikle sig.
4. dsRNA mikroinjektioner i tidlige stadier T. marmoratus embryoner
- For at indsprøjte tidlige embryoner med genspecifik dsRNA skal mikroinfektionnåle klargøres med en mikroinjektionsnål puller (se Tabel over Materialer). Mens visualisere nålen spidsen under et stereomikroskop, bruge et par fine kraftforkrop til at bryde nålen spidsen, hvilket skaber en skarp kant. Ideelt set bryde nålen spidsen diagonalt, så en skarpere kant forbliver på den ene side, som vil gøre det muligt at komme ind i fosteret og samtidig forårsage minimal skade.
- Tø den rensede æd-dsRNA-opløsning op på is, tilsæt 1 μL af 10x injektionsbufferen, og top det af med dobbelt destilleret vand for at lave 10 μL injektionsopløsning. Til injektioner er en dsRNA-koncentration på 1 μg/μL normalt egnet, men kan justeres i henhold til de resulterende dyrs fænotopiske sværhedsgrad).
BEMÆRK: Der klargørs 1 ml 10x injektionsbuffer22 ved tilsætning af 10 μL 0,1 M natriumphosphatbuffer (fremstillet ved blanding af 8,5 ml 1 M Na2HPO4 og 1,5 ml1 M NaH2PO4 justeret til en pH 7,6 ved 25 °C med 100 μL på 0,5 M KCl), 100 μL fødevarefarvestof og 790 μL dobbeltdestilleret vand.- Ved hjælp af en P10-pipette fyldes mikroinfektionsnålen op med den fungerende dsRNA-opløsning. Når opløsningen har fyldt spidsen af nålen, fastgøres den til en mikroneedleholder, der er tilsluttet et mikroinjektionssystem, der anvender trykudslyngningsteknologi (se Tabel over materialer).
- Tænd for mikroinjektionssystemet og den trykregulerede lufttilførsel. Ved hjælp af mikrovalven på mikroinjektionssystemet justeres injektionstrykket til 15 psi. Juster injektionens varighed ved hjælp af tidsjusteringsknappen (indstil den til "Sekunder").
- Da injektionens varighed afhænger af det ønskede injektionsvolumen, skal du om nødvendigt justere denne parameter på mikroinjektionssystemet før hver injektion. Brug en injektion volumen på 1-2 nL for tidlige fase T. marmoratus embryoner.
BEMÆRK: Højere injektionsmængder har en tendens til at forstyrre embryonets overlevelsesrate.
- Da injektionens varighed afhænger af det ønskede injektionsvolumen, skal du om nødvendigt justere denne parameter på mikroinjektionssystemet før hver injektion. Brug en injektion volumen på 1-2 nL for tidlige fase T. marmoratus embryoner.
- For at måle mængden af injektionsvæske, der dispenseres af mikroinfektionssystemet, skal du kalibrere injektionsnålen ved at vurdere mængden af den væskeboble, der dannes på spidsen af nålen, når den injiceres i luften. For T. marmoratus embryoner, bruge en optimal boble størrelse på 100-200 μm. Injektionsnålen er af god kvalitet, hvis dette kan opnås ved 15 psi med en injektionsvarighed på ~3 s.
- Juster nålen og agarosepladen, der indeholder embryonerne under et stereomikroskop, således at nålen nærmer sig embryonerne i en vinkel mellem 45° og 60°.
- Brug mikromanipulatoren til at flytte mikronålen langsomt, mens du overvåger fremskridtene gennem stereomikroskopet. Når spidsen af nålen rører overfladen af et foster, forsigtigt flytte nålen fremad, indtil det gennemborer overfladen af fosteret. Embryoet må ikke perforeres dybt med nålespidsen, da dette kan påvirke embryonets overlevelse. For at reducere variabiliteten skal du aflevere injektionen midt i fosteret.
- Når nålen er inde i fosteret, skal du trykke på mikroinjektorens injektionsknap for at levere dsRNA-dosis til embryonet. Efter injektion 1-2 nL dsRNA, langsomt trække nålen fra fosteret, således at det ikke forårsager fosteret til at briste.
- Injicer de andre embryoner på samme måde. Hvis mikroinjektionsnålen bliver blokeret under proceduren, skal du fjerne blokeringen ved at øge injektionstrykket og varigheden. Identificerer med held injicerede embryoner ved tilstedeværelsen af et farvet punkt på injektionsstedet (da injektionsbufferen indeholder farvelægning af fødevarer).
- Anvend forsigtigt skålen med indsprøjtede embryoner i et fugtighedskammer.
- At konstruere et sådant kammer, tage en plastikkasse med et låg, sterilisere det med 70% ethanol, gør det muligt at tørre, og placere væv dyppet i autoklaveret vand i bunden for at give et fugtigt miljø. Dette fugtighedskammer hældes i en inkubator med en passende temperatur (i dette tilfælde 25 °C) og en lyscyklus på 14 timer og 10 timer mørk.
- Lad indsprøjtede embryoner udvikle sig til første instar larver, som kræver 4-5 dage. Overvåg dagligt udviklingen af embryonudvikling ved hjælp af et stereomikroskop for at identificere morfologisk synlige knockdown-fænotyper som afbildet i figur 2.
- Dokumenter disse fremskridt ved at tage digitale billeder ved hjælp af et kamera i høj opløsning. Affjedræns og genopfyld vandet på agarosepladen dagligt for at undgå udsætning og mulig spredning af mikrobiel forurening til andre overlevende embryoner i inkubationstiden.
- Udfør passende kontroller for dsRNA-injektioner, herunder bufferinjekt injektioner, injektioner af dsRNA syntetiseret mod følelsesdelen af det relevante gen, og injektioner af dsRNA syntetiseret mod sekvenser, der ikke findes i målorganismen. Bekræft RNAi knockdown ved hjælp af yderligere molekylæremetoder 22.
5. Præparat af T. marmoratus larver til dsRNA injektioner
BEMÆRK: I modsætning til tidlige embryoner er T. marmoratus larver relativt robuste og kan injiceres med større mængder. For eksempel kan andet instars injiceres med op til 2 μL dsRNA-arbejdsopløsning og tredje stjerner med mindst 3 μL uden mærkbare negative virkninger på overlevelsesraten. At injicere dsRNA, er det nyttigt at immobilisere larver ved at indlejre dem i agarose.
- Før du opsamler larverne, smeltes 2% agarose og opbevares i et vandbad ved 60-70 °C for at holde det i flydende form. Forbered en immobilisering fad ved at hælde smeltet 2% agarose i en lille petriskål og derefter køling indtil størknet. Brug stumpe kraftforhænder til at lave en lavvandet rille i agarosepladen (omtrent på størrelse med den leddyr, der skal indlejres) for hvert dyr, der vil blive injiceret.
- Indsamle unge larver på det relevante udviklingsstadiet (et trin før den ønskede fase til analyse). For at gøre dette skal du forsigtigt dræne vandet fra de kulturkopper, der indeholder larverne, og følg nedenstående trin.
- Anæstesi på is (pluk forsigtigt larven ud fra sin vandkop og læg den forsigtigt på is), indtil larven ikke viser nogen bemærkelsesværdige bevægelser. Brug stumpe, bløde kraftbefængte til forsigtigt at løfte larven fra isen og placere den på immobiliseringsfasen med halsen og kroppen i rillen, men dens hale placeret over agaroseoverfladen, så den ikke vil blive dækket, hvilket gør det muligt for larverne at fortsætte vejrtrækningen gennem halen spiracles.
- Dæk larven med et tykt lag af agarose, der stadig er flydende, men ikke faretruende varmt. Hvis det ved et uheld er dækket, skal du bruge hænden til at frigøre halen og de to segmenter under den fra agarose. Når agarose størkner, skal du bruge larverne til dsRNA-injektioner.
6. dsRNA mikroinjektioner i T. marmoratus larver
- Der klargør og opfyldes en mikroinfektionsnål med den ønskede mængde genspecifik dsRNA-arbejdsløsning (som beskrevet i trin 4.1-4.2). Fastgør nålen til en kanyleholder, der er tilsluttet en manuelt styret mikroinjektionssprøjte. Før du monterer nålen, trækkes sprøjtestemplen helt ud for at undgå at løbe tør for injektionstryk midt i proceduren.
- Den immobiliserede larver placeres således, at injektionsstedet, som er placeret dorsalt mellem det tredje og fjerde karrosseripladesegment, flugter med mikroinfektionnålens bane i en forholdsvis flad vinkel (næsten parallelt med scenen).
BEMÆRK: Det er vigtigt at fiske nålen og larven i denne position, da det giver den mindste modstand, så nålespidsen kan gennemtrænge larverne med mindst mulig skade. - Når nålen og larven er placeret, skal nålespidsen forsigtigt flyttes ind i larven ved hjælp af mikromanipulatoren, mens du overvåger fremskridtene gennem et stereomikroskop.
- Efter spidsen perforerer vævet, langsomt og forsigtigt lægge pres på sprøjten. Juster injektionstrykket ved at observere bevægelsen af den farvede injektionsvæske i nålen under mikroskopet.
- Træk forsigtigt nålen tilbage efter injektionen. Brug bløde kraftaffakt til at skrælle væk og dermed befri larverne fra agarose. Overfør larven tilbage til en beholder med vand (ved stuetemperatur) og lad den udvikle sig yderligere i en rugemaskine eller kulturrum ved 25\u201228 °C og en lyscyklus på 14 timer lys og 10 h mørk.
- Anvende passende kontrol injektioner og knockdown kvantificeringer, som skitseret i trin 4.10.
Representative Results
Ved hjælp af protokollen beskrevet ovenfor, vi bankede ned tre forskellige gener, nemlig hvid, laccase2 (lac2), og Lens3 (Tabel 1), på en række forskellige udviklingsstadier af Sunburst Dykning Beetle T. marmoratus. Vi udførte RNAi i T. marmoratus ved at injicere dsRNA på et meget tidligt tidspunkt under embryogenese (Figur 1A). Da nogle af embryonerne ikke overlever processen og bliver nekrotiske (figur 1B),skal de fjernes for at holde de resterende embryoner sunde. Eksemplificeret her er injektioner af dsRNA mod det hvide gen. Dette gen er velkendt i Drosophila som en af tre ATP-bindende kassette (ABC) transportører involveret i optagelse og opbevaring af prækursorer af øjet pigment23. Derfor, dens tab-of-funktion resulterer i en unpigmented, hvid-øje fænotype. Vores resultater viser, at injektioner af dsRNA rettet mod det orthologous hvide gen i T. marmoratus embryoner fører til tab af øjenpigmentering i nye larver. I dette tilfælde er vilde type larver karakteriseret ved stærkt pigmenterede øjne, og RNAi knockdown af hvide fører til forskellige niveauer af reduktion og endda fuldstændig eliminering af øjet pigment. Samlet set observerede vi i det mindste en vis reduktion i øjenfarve i 34% af overlevende embryoner (n = 35). Figur 2A sammenligner en kontrolperson og en person med let lysere øjenfarve. Figur 2B illustrerer en mere alvorlig knockdown i en person, hvor de mere ventrale øjne (Eyes 2-5) af klyngen er helt unpigmented, mens de dorsale øjne stadig viser nogle pigmentering. Disse forskelle fremhæver, hvordan effektiviteten af knockdown kan variere regionalt, hvilket muligvis er relateret til forskelle i effekten af dsRNA penetration i tæt væv. En anden person viser stort set komplet pigment tab i alle øjne( Figur 2C).
For at undersøge, hvor godt RNAi arbejder på larvestadiet af T. marmoratus, injiceredevi dsRNA rettet mod det garvede gen lac2 i anden instar larver et par dage før de skyldtes molt i tredje stjerner (Figur 3) og evaluerede effekten på cuticular farvning af tredje instar larver. Lac2 er en type phenoloxidase, der oxidativt konjugerer proteiner for at gøre dem uopløselige, hårdere og mørkere. Knockdown i melbillen T. castaneum har vist sig at føre til lysere farvede individer i lave doser, men anses for dødelig i høje doser24. Figur 4 illustrerer, at denne behandling også fører til lysere farvede Sunburst Diving Beetle larver. I dette eksperiment havde 75 % af de overlevende injicerede larver (n = 12) reduceret pigmentering (sammenlignet med 0 % i kontrolgruppen). Figur 4A viser en person med relativt mild depigmentering, mens figur 4C illustrerer hovedet af en T. marmoratus larver, hvor den mørke farve af neglebånd er næsten fraværende. Depigmentering var særlig tydelig for det centrale mørke mønster, der er typisk for disse larver, mens dette mønster forblev klart synligt i en kontrolint injiceret person (figur 4B). Desuden blev der observeret en afgrænsning af halrøret, som vist i figur 4D. I tilfælde, hvor lac2 dsRNA blev injiceret i tredje instar larver, lettere voksne personer blev opnået (Figur 5). Bemærk, at vingerne af knockdown billen er noget deforme, sandsynligvis på grund af sin usædvanlige blødhed.
Ud over at ændre morfologiske træk, er det muligt at bruge RNAi til at målrette gener, der påvirker adfærd. For at demonstrere dette, vi udførte RNAi mod en nøgle linse protein kodning gen, Lens318, og injiceres det i anden instar larver til at påvirke de optiske egenskaber af tredje instar larve øjne. Eventuelle virkninger på linsen observeret her er sandsynligt, fordi øjnene af T. marmoratus larver gennemgå store øjenvækst på denne overgang, som også indebærer store optiske ændringer af linsen25. RNAi knockdown i dette eksperiment var meget effektiv. Verifikation gennem qPCR viste en 100% succesrate; ud af de 13 testede personer blev 12 slået ned til mindre end 10 % af ekspressionsniveauet for kontrolpersoner, mens den resterende person havde et udtryksniveau på 17 % af kontrolniveauet (ikke-offentliggjort observation). På fæotypisk niveau var kun nogle personer alvorligt handicappede eller ude af stand til at fange byttedyr, som det er illustreret i figur 6 for en person, der gentagne gange nærmede sig sit bytte fra en meget tæt afstand, men konsekvent overhalede det.
Tabel 1: Primer sekvenser og ampliconer til hvide, lac2 og Lens3 proteiner. Klik her for at downloade denne tabel.
Figur 1: Illustration af embryoninjektninger. a) Dechorionerede embryoner linet op på en agaroseplade og injiceres i nærheden af deres centrum ved hjælp af en mikroinjektionsnål fyldt med dsRNA og fødevarefarveholdig injektionsbuffer. Skalalinjen repræsenterer 500 μm. (B)En person med en mere alvorlig knockdown. Indsprøjtede embryoner holdes i et fugtighedskammer og overvåges dagligt for at score fænotyper og fjerne døde individer (som bliver brune). Skalalinjen repræsenterer 5 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Eksempel på fuldt udviklede embryoner, der blev injiceret med dsRNA mod hvid. (A)Sammenligning af en person med en reduktion i øjet pigmentering (venstre) og en kontrol-injiceret person (højre). E1-E6 henviser til Øjne 1-6. (B) En person med en mere alvorlig knockdown fænotype, som illustrerer, at nogle af øjnene i klyngen er mere alvorligt ramt af knockdown end andre. (C)Person med et næsten fuldstændigt tab af øjenpigmentering. Skalalinjen repræsenterer 200 μm; Paneler B og C er repræsenteret i samme skala. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Illustration af larveinjekt injektioner. (A) Flere larver immobiliseret ved indlejring i 2% agarose med deres hale spiracles venstre fri af enhver agarose. (B) Mikroelektrode, der indeholder injektionsopløsningen, der er anbragt således, at dens spids kan trænge ind i den fine membran mellem to segmenter. (C) Blåt injektionsfarvestof synligt på injektionsstedet efter injektionen. Skalabarer repræsenterer 1 cm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: RNAi for laccase2 påføres anden instar larver resulterer i reduceret neglebånd farve i tredje instar larver. (A)Relativt mildt tab af farve i en lac2 RNAi person (nederst) sammenlignet med en kontrol-injiceret person (top). Skalaen repræsenterer 5 mm.(B)Leder af en kontrolperson, der viser det karakteristiske mørke mønster i midten af hovedet. (C)Relativt alvorlig knockdown af lac2 fører til en næsten fuldstændig tab af centrale hoved farve. (D)Tab af farve i den store hale neglebånd af en lac2 RNAi person (nederst) sammenlignet med en kontrol-injiceret person (top). Skalerbarer i B\u2012D repræsenterer 1 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: RNAi for laccase2 påføres en tredje instar larver, hvilket resulterer i reduceret neglebåndsfarve hos en voksen. Den knockdown enkelte (venstre) er også kendetegnet ved meget blød elytra sammenlignet med kontrol (højre). Skalalinjen repræsenterer 5 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Knockdown af en større linse protein, der fører til mangler i bytte fange. (A-C). Tre eksempler, hvor en Sunburst Diving Beetle larver, hvor optiske underskud blev induceret gennem RNAi, var ude af stand til at fange bytte (myg larver). Repræsentative stillbilleder blev udvalgt fra en videooptagelse af karakteristiske byttefangst. D) Kontrol larver fange bytte. Alle skalabarer repræsenterer 2 cm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Vores mål er, at denne samling af metoder vil gøre RNAi bredt tilgængelig, især da dette værktøj fortsat er en kraftfuld synergistisk teknik til CRISPR/Cas9-baseret genredigering, med den fordel, at det kan anvendes på de ønskede udviklingsstadier af undersøgte organismer. For at eksemplificere denne styrke injicerede vi dsRNA i embryoner og i forskellige larvestadier. Injektioner i æg påvirkede udviklingen af embryoner (figur 2), injektioner i anden larvefase havde tilsyneladende virkninger på den tredje larvefase(figur 4 og figur 6),og injektioner i tredje larvefase viste virkninger hos voksne (figur 5). Mens den nøjagtige timing skal fastlægges eksperimentelt, generelt, injektioner træder i kraft inden for et par dage. Succesen af denne proces kan påvirkes af længden af dsRNA-sekvensen. Her præsenterede vi eksempler ved hjælp af lidt over 200 bp til mere end 800 bp. Som hovedregel foretrækkes sekvenser mellem 100 og 600 bp for at begrænse off-target effekter, men sekvenser op til 1000 bp giver gode resultater22. Et spørgsmål med hensyn til RNAi er varigheden af knockdown, der kan opnås gennem denne teknik. Da fænotyperne var terminale på hvert trin, kan vi ikke kommentere dette spørgsmål baseret på vores præsenterede resultater. Det er dog tidligere blevet bemærket, at RNAi-effekter generelt er relativt lange, og at højere koncentrationer fører til længerevarende knockdowns20.
En begrænsning af denne teknik er, at det virker bedre for nogle organismer end for andre, og der synes at være nogen direkte måde at forudsige, hvor godt det vil arbejde a priori. Ikke desto mindre har det vist sig at fungere godt for en lang række forskellige organismer. Inden for leddyr, dette omfatter arachnids26, krebsdyr27, og en række insekter, med særligt høje succesrater i biller28. En yderligere komplikation er, at forskelle i fænotype sværhedsgrad ofte forekommer mellem enkeltpersoner på trods af anvendelsen af den samme mængde dsRNA. Som illustreret i figur 2Bkan variation endda forekomme inden for en person. I vores RNAi undersøgelser rettet mod forskellige gener, der er involveret i T. marmoratus larve øjenudvikling, har vi ofte konstateret, at nogle øjne er påvirket mere alvorligt end andre. Dette fænomen kan være relateret til det relativt tætte væv i øjenklyngen, med dsRNA bedre i stand til at nå nogle af enhederne.
For en vellykket udførelse af RNAi eksperimenter, er det afgørende, at flere parametre er optimeret til målet genet. For eksempel kan koncentrationen af dsRNA og længden af det målrettede gen i høj grad påvirke resultatet20. En anden kritisk parameter er, hvordan injektionerne udføres, da denne proces i høj grad kan påvirke overlevelsesraten. For embryoner opnåede vi de bedste resultater ved at målrette embryonets centrum. En velindlagt plade giver mulighed for injektion af 100 eller flere embryoner i en enkelt session. For larver er det vigtigt at indsætte injektionsnålen mellem segmenterne. Disse injektioner kræver mere dsRNA, og baseret på larver tilgængelighed, vores injektion sæt her typisk kun bestod af et par dyr ad gangen. For alle injektioner er det afgørende at forhindre luft i at trænge ind i organismen.
I nogle tilfælde kan feedback loops af et genregulerende netværk og genetisk redundans påvirke penerance af RNAi fænotyper, på trods af konsekvent knockdowns. Dette synes at være tilfældet for vores adfærdsmæssige observationer af larver med meget vellykket knockdowns af en fremtrædende linse protein, Lens318. Selv om vi verificerede den høje effektivitet af disse knockdowns gennem qPCR, blev der observeret betydelige variationer i de tilknyttede fænotyper. Dette resultat understreger nødvendigheden af korrekt kvantificering af RNAi knockdowns (for nærmere oplysninger om muligheder se22). Hvis der ikke er nogen klar a priori forventning med hensyn til de resulterende fænotyper, en god måde at kontrollere for off-target effekter af RNAi er at målrette det samme gen med to ikke-overlappende sekvenser af dsRNA og til at evaluere resultaterne for fælles fænotyper.
I modsætning til genredigeringsteknikker er RNAi også et effektivt værktøj til at studere dødelige gener, og der er to måder at gøre det på. For eksempel, hvis man er interesseret i det funktionelle bidrag fra et gen, hvor tab af funktion tidligt i udviklingen er kendt for at være dødelig, kan en funktionel undersøgelse af et sådant gen opnås ved blot at lade dyret udvikle sig normalt og derefter vælte genet via RNAi senere i udvikling (dvs. i den voksne). Alternativt kan et gen, hvor fuldstændig funktionstab er kendt for at være dødeligt, undersøges gennem en delvis knockdown, hvilket kan opnås ved at indsprøjte en række dsRNA-koncentrationer. Nogle af vores resultater viser knockdowns af lac2, som er kendt for at være dødelig, hvis neglebånd i insekter bliver alt for blød24. Selv lac2 RNAi billen afbildet i figur 5 ville være usandsynligt, at overleve uden for laboratorieforholdene. Et andet dødeligt gen er skåret, hvilke koder for en transskription faktor , der er afgørende for celle-skæbne specifikation i forskellige organsystemer i leddyr og har været knyttet til glia udvikling i Drosophila visuelle system29. Baseret på vores erfaring med cut RNAi i T. marmoratus embryoner, kan vi fremkalde informative øje fænotyper i embryoner, der er i stand til at fuldføre deres embryonale øje udvikling (ikke-offentliggjorte observationer). Her, højere doser synes at føre til højere dødelighed satser, mens lavere doser resultere i observerbare og informative fænotyper.
Vores protokol ikke kun lister de nødvendige skridt for en forsker til at forfølge RNAi eksperimenter på T. marmoratus, som illustreret, men også er generelt gælder for andre organismer, især vandorganismer. Blandt vandorganismer er der allerede flere eksempler inden for krebsdyr såsom vandloppe Dafnierne30 og rejer (se reference31for nylig). Der er rigelige muligheder blandt vandinsekter, da de er blevet anslået til at omfatte omkring 6% af alle insekt mangfoldighed, med sandsynligvis mere end 200.000 arter32. Desuden er RNAi allerede blevet udført på vand striders, der har tendens til at bebo overfladen af vandmiljøer33. Hvis der ikke er noget genom til stede, kan der samles en transskription de novo. Så længe denne proces afslører contigs af et par hundrede nukleotider, dsRNA mod specifikke gener kan designes. Vores protokol for immobilisering af insekter i agarose vil sandsynligvis også være nyttig for andre procedurer, især for bløde, formbare og akvatiske organismer. Tilsammen er RNAi stadig en kraftfuld teknik til at manipulere genekspression i en forskelligartet gruppe af organismer, selv når der ikke findes andre molekylære og genetiske værktøjer.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Dr. Josh Benoit for hans hjælp med bioinformatik Hailey Tobler for hendes hjælp til at hæve Sunburst Dykning Biller og Tamara Pace for redaktionel bistand. Denne forskning blev støttet af National Science Foundation under tilskud IOS-1456757 og IOS-1856341 til EKB og IOS1557936 til YT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. RNA isolation and de novo transcriptome assembly | |||
| liquid nitrogen | University Stockroom | Typically locally available at research institutions | |
| pipette tips | Fisher Scientific | size dependent | Products from other vendors would work equally well |
| RNeasy lipid tissue mini kit (RNA isolation kit) | Qiagen | 74804 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| spectrophotometer (NnanoDrop) | Thermo Fisher | 9836674 | Other models would work equally well |
| 1.2. De novo transcriptome assembly. | |||
| BUSCO.v3 | https://busco.ezlab.org/ | Any freely available software for assessing trasncriptome completeness can be used. | |
| CLC Genomics workbench | Qiagen | 832021 | Other equivalent software packages are also available |
| Galaxy workbench | https://usegalaxy.org/ | An open source online transcriptome assembly & annotation pipeline | |
| NCBI BLASTx | https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?LINK_LOC=blasthome&PAGE_TYPE=BlastSearch&PROGRAM=blastx | An open source online alignment and annotation pipeline | |
| 2. cDNA synthesis, Cloning & Miniprep isolation | |||
| ampicillin sodium salt | Gibco | 11593-027 | Products from other vendors would work equally well |
| glycerol | Fisher Scientific | G33-500 | Products from other vendors would work equally well |
| LB broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | Products from other vendors would work equally well |
| Omniscript RT (reverse trasncription) kit | Qiagen | 205111 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| One Shot™ TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404010 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | Products from other vendors would work equally well |
| PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit | ThermoFischer | 771471 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| shaker-incubator | Labnet | 211DS | Other models would work equally well |
| spectrophotometer (NnanoDrop) | Thermo Fisher | 9836674 | Other models would work equally well |
| thermal cycler for PCR | BioRad | T100 | Other models would work equally well |
| TOPO TA Cloning kit | Invitrogen | 1845069 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| X-Gal Solution | Thermo Scientific | R0941 | Products from other vendors would work equally well |
| 2.2 PCR amplification & in vitro dsRNA synthesis | |||
| Centrifuge | Fisher Scientific | accuSpin Micro 17R | Other models would work equally well |
| ethanol | Fisher Scientific | A4094 | Products from other vendors would work equally well |
| FastTaq DNA Polymerase, dNTPack | Roche | 13873432 | This kit contains all the reagents necessary for a PCR |
| MEGAclear Transcriiption clean up kit | ThermoFischer | AM1908 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| MEGAscript T7 Transcription kit | ThermoFischer | AM1334 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| nuclease-free water | Fisher Scientific | AM9932 | Products from other vendors would work equally well |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| sodium acetate | Fisher Scientific | BP333-500 | Make 3M working solution |
| Spectrophotometer (NnanoDrop) | Thermo Fisher | 9836674 | Other models would work equally well |
| 3. Collecting and preparing early stage T. marmoratus embryos for dsRNA injections | |||
| agarose | Fisher Scientific | 9012-36-6 | Products from other vendors would work equally well |
| distilled water | Fisher Scientific | 9180 | Products from other vendors would work equally well |
| forceps (Dumon #4 Biology) | Fine Science Tools | 11242-40 | Products from other vendors would work equally well |
| glass cavity dish (3 well-dish) | Fisher Scientific | 50-243-43 | Products from other vendors would work equally well |
| microwave | Welbilt | turn-table | Other models would work equally well |
| natural hair paintbrush | Amazon | Any fine brush will do | |
| P1000 micro-pipetter | Gilson | F123602 | Other models would work equally well |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | Products from other vendors would work equally well |
| stereomicroscope | Microsocope Central | 10446293 | Any good stereomicroscope will work |
| transfer pipettes | Fisher Scientific | 21-200-109 | Products from other vendors would work equally well |
| 4. dsRNA micro-injections in early stage T. marmoratus embryos | |||
| digital camera | Edmund optics (Qimaging) | Retiga 2000R | Other models would work equally well |
| ethanol | Fisher Scientific | A4094 | Products from other vendors would work equally well |
| food dye | Kroger | Any available food dye should work fine | |
| humidity chamber | take any plastic box with a lid, sterilize it with 70% ethanol and let it dry | ||
| incubator | Labline | 203 | Other models would work equally well |
| injection buffer | Prepared for 1 mL following reference #22 : Mix 10 µL of 0.1 M sodium phosphate buffer, 100 µL of 0.5 M potassium chloride solution, 100 µL of food dye and 790 µL of double-distilled water. Store in 4 °C. | ||
| intracellular Microinjection Systems (Picospritzer) | Parker | 052-0500-900 | Currently the model III is available, but older models work also |
| micro needle holder | A-M Systems | 672441 | Other products would work equally well |
| microinjection needles (1.2 mm x 0.68 mm, 4 inches) | A-M Systems | 603000 | Other models would work equally well |
| micromanipulator | Drummond Scientific Company | 3-000-024-R | Any quality micromanipulator will work |
| monosodium phosphate | Fischer scientific | 7558-80-7 | To make 10 mL of 1 M working solution: Add 1.2 g of monosodium phosphate powder to 10 mL of Double distilled water and mix until clear solution is obtained |
| P-1000 Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-1000 | Puller settings:Heat 575, Pull 60, Velocity 75 Delay 110, Pressure 700. |
| P10 micro-pipetter | Gilson | F144802 | Other models would work equally well |
| P1000 micro-pipetter | Gilson | F123602 | Other models would work equally well |
| potassium chloride | Fischer scientific | 7447-40-7 | To make 100 mL of 0.5 M potassium chloride solution: Add 3.73 g of potassium chloride crystals to 100 mL of double distilled water and mix until clear solution is obtained. |
| sodium phosphate buffer (0.1M) | To make 10 mL of 0.1 M of this buffer: Mix 8.5 mL of 1 M sodium phosphate dibasic solution with 1.5 mL of 1 M monosodium phosphate solution. Check the pH with a pH meter and adjust accordingly to pH 7.6 at room temprature. | ||
| sodium phosphate dibasic | Fischer scientific | 7558-79-4 | To make 10 mL of 1 M working solution: Add 1.42 g of sodium phosphate dibasic powder to 10 mL of Double distilled water and mix until clear solution is obtained |
| stereomicroscope | Microsocope Central | 10446293 | Any good stereomicroscope will work |
| 5. Preparing T. marmoratus larvae for dsRNA injections | |||
| agarose | Fisher Scientific | 9012-36-6 | Products from other vendors would work equally well |
| forceps (Dumon #4 Biology) | Fine Science Tools | 11242-40 | Products from other vendors would work equally well |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | Products from other vendors would work equally well |
| 6. dsRNA micro-injections in T. marmoratus larvae | |||
| injection buffer (10x) | See section 4 | ||
| microinjection needles (1.2 mm x 0.68 mm, 4 inches) | A-M Systems | 603000 | Other models would work equally well |
| microinjection syringe | A-M Systems | 603000 | Other models would work equally well |
| micro needle holder | A-M Systems | 672441 | Other products would work equally well |
| P-1000 Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-1000 | Puller settings:Heat 575, Pull 60, Velocity 75 Delay 110, Pressure 700. |
| stereomicroscope | Microsocope Central | 10446293 | Any good stereomicroscope will work |
References
- Muller, B., Grossniklaus, U. Model organisms - A historical perspective. Journal of Proteomics. 73, 2054-2063 (2010).
- Gilbert, L. A., et al. CRISPR-Mediated Modular RNA-Guided Regulation of Transcription in Eukaryotes. Cell. 154, 442-451 (2013).
- Westerman, E. L., et al. Aristaless Controls Butterfly Wing Color Variation Used in Mimicry and Mate Choice. Current Biology. 28, 3469 (2018).
- Perry, M., et al. Molecular logic behind the three-way stochastic choices that expand butterfly colour vision. Nature. 535, 280 (2016).
- Boettcher, M., McManus, M. T. Choosing the Right Tool for the Job: RNAi, TALEN, or CRISPR. Molecular Cell. 58, 575-585 (2015).
- Meister, G., Tuschl, T. Mechanisms of gene silencing by double-stranded RNA. Nature. 431, 343-349 (2004).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
- Kennerdell, J. R., Carthew, R. W. Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway. Cell. 95, 1017-1026 (1998).
- Mello, C. C., Conte, D.
- Agrawal, N., et al. RNA interference: Biology, mechanism, and applications. Microbiol. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67, 657 (2003).
- Gu, L. Q., Knipple, D. C. Recent advances in RNA interference research in insects: Implications for future insect pest management strategies. Crop Protection. 45, 36-40 (2013).
- Ravisankar, P., Lai, Y. T., Sambrani, N., Tomoyasu, Y. Comparative developmental analysis of Drosophila and Tribolium reveals conserved and diverged roles of abrupt in insect wing evolution. Developmental Biology. 409, 518-529 (2016).
- Tomoyasu, Y., Wheeler, S. R., Denell, R. E. Ultrabithorax is required for membranous wing identity in the beetle Tribolium castaneum. Nature. 433, 643-647 (2005).
- Tomoyasu, Y., Arakane, Y., Kramer, K. J., Denell, R. E. Repeated Co-options of Exoskeleton Formation during Wing-to-Elytron Evolution in Beetles. Current Biology. 19, 2057-2065 (2009).
- Yang, X., et al. Probing the Drosophila retinal determination gene network in Tribolium (II): The Pax6 genes eyeless and twin of eyeless. Developmental Biology. 333, 215-227 (2009).
- ZarinKamar, N., et al. The Pax gene eyegone facilitates repression of eye development in Tribolium. Evodevo. 2, 15 (2011).
- Linz, D. M., Clark-Hachtel, C. M., Borras-Castells, F., Tomoyasu, Y. Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum. Journal of Visualized Experiments. , e52059 (2014).
- Stahl, A., S, B. R., Cook, T. A., Buschbeck, E. K. A complex lens for a complex eye. Integrative and Comparative Biology. 57, 1071-1081 (2017).
- Yeku, O., Frohman, M. A. Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE). RNA, Methods In Molecular Biology. , Springer. 107-122 (2011).
- Miller, S. C., Miyata, K., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. Dissecting Systemic RNA Interference in the Red Flour Beetle Tribolium castaneum: Parameters Affecting the Efficiency of RNAi. Plos One. 7, (2012).
- Tomoyasu, Y., Denell, R. E. Larval RNAi in Tribolium (Coleoptera) for analyzing adult development. Development Genes and Evolution. 214, 575-578 (2004).
- Philip, B. N., Tomoyasu, Y. Molecular Methods for Evolutionary Genetics. Orgogozo, V., Rockman, M. V. , Humana Press. 471-497 (2011).
- Mackenzie, S. M., Howells, A. J., Cox, G. B., Ewart, G. D. Sub-cellular localisation of the White/Scarlet ABC transporter to pigment granule membranes within the compound eye of Drosophila melanogaster. Genetica. 108, 239-252 (2000).
- Arakane, Y., Muthukrishnan, S., Beeman, R. W., Kanost, M. R., Kramer, K. J. Laccase 2 is the phenoloxidase gene required for beetle cuticle tanning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 11337-11342 (2005).
- Werner, S., Buschbeck, E. K. Rapid and step-wise eye growth in molting diving beetle larvae. Journal of Comparative Physiology. 201, 1091-1102 (2015).
- Prpic, N. M., Schoppmeier, M., Damen, W. G. Gene Silencing via Embryonic RNAi in Spider Embryos. Cold Spring Harbor protocols. 3, 1-4 (2008).
- Sagi, A., Manor, R., Ventura, T. Gene Silencing in Crustaceans: From Basic Research to Biotechnologies. Genes. 4, 620-645 (2013).
- Zhu, K. Y., Palli, S. R. Annual Review of Entomology. Douglas, A. E. 65, Annual Reviews. 293-311 (2020).
- Bauke, A. C., Sasse, S., Matzat, T., Klaembt, C. A transcriptional network controlling glial development in the Drosophila visual system. Development. 142, 2184 (2015).
- Lin, C. Y., et al. RNAi analysis of doublesex1 expression in Daphnia pulex Leydig, 1860 (Cladocera). Crustaceana. 92, 137-154 (2019).
- Nguyen, D. V., Christiaens, O., Bossier, P., Smagghe, G. RNA interference in shrimp and potential applications in aquaculture. Reviews in Aquaculture. 10, 573-584 (2018).
- Dijkstra, K. D. B., Monaghan, M. T., Pauls, S. U. Annual Review of Entomology. Berenbaum, M. R. 59, Annual Reviews. 143-163 (2014).
- Crumiere, A. J. J., Khila, A. Hox genes mediate the escalation of sexually antagonistic traits in water striders. Biology. Letters. 15, 5 (2019).
