Sfruttare la turbidità e la tromboelastografia per la caratterizzazione complementare dei coaguli

Summary

La fibrina è responsabile della formazione di coaguli durante l’emostasi e la trombosi. I saggi di turbidità e il tromboelastograhy (TEG) possono essere utilizzati come strumenti sinergici che forniscono una valutazione complementare di un coagulo. Queste due tecniche insieme possono dare maggiori informazioni su come le condizioni di coagulazione influenzano la formazione di coaguli di fibrina.

Abstract

La trombosi è una delle principali cause di morte in tutto il mondo. La fibrina (ogen) è la proteina principalmente responsabile della formazione di coaguli o trombosi. Pertanto, caratterizzare la formazione di coaguli di fibrina è utile per lo studio della trombosi. Turbidità e tromboelastografia (TEG) sono entrambi ampiamente utilizzati in vitro saggi per monitorare la formazione di coaguli. La turbidità misura dinamicamente la trasmissione della luce attraverso una struttura di coagulo di fibrina attraverso uno spettrometro ed è spesso utilizzata nei laboratori di ricerca. TEG è una tecnica viscoelastica specializzata che misura direttamente la forza del coagulo di sangue ed è utilizzata principalmente in ambienti clinici per valutare l’emostasi dei pazienti. Con l’aiuto di questi due strumenti, questo studio descrive un metodo per caratterizzare un coagulo di fibrina in vitro utilizzando un modello semplificato di coagulo di fibrinogeno/trombina. Le tendenze dei dati in entrambe le tecniche sono state confrontate in varie condizioni di coagulazione. I coaguli di fibrina umana e bovina sono stati formati fianco a fianco in questo studio, poiché i fattori di coagulazione bovina sono spesso utilizzati come sostituti di fattori di coagulazione umana in ambienti clinici e di ricerca. I risultati dimostrano che TEG e la turbidità tracciano la formazione di coaguli attraverso due metodi distinti e, se utilizzati insieme, forniscono informazioni complementari sulla resistenza del coagulo e sulla struttura delle fibre in diverse condizioni di coagulazione.

Introduction

La trombosi è la formazione patologica di un coagulo di sangue nel corpo che blocca la circolazione sanguigna che porta ad alta morbilità e mortalità in tutto il mondo. Ci sono da 1 a 2 casi di tromboembolismo venoso e da 2 a 3 casi di malattie vascolari indotte dalla trombosi ogni 1000 persone^{all’anno 1,2}. Presentato qui è un metodo che sfrutta la tromboelastografia (TEG) e la torbidità per monitorare la formazione di coaguli in varie condizioni di coagulazione. Fibrin(ogen) è la proteina primaria che è responsabile della formazione di coaguli nel corpo. Nelle fasi finali della cascata di coagulazione, i fibrinopeptidi vengono sciolti dal fibrinogeno da thrombin iniziando la polimerizzazione dei monomeri fibrin insolubili man mano che il coagulo si^{sviluppa 3,4}. Per comprendere la formazione di coaguli nella trombosi patologica, è necessario caratterizzare la formazione di fibrina in diverse circostanze di coagulazione. Sono stati utilizzati più saggi di monitoraggio dei coaguli per studiare la formazione di coaguli di fibrina in vitro. Il tempo di prothrombina (PT/INR) e il tempo di tromboplastin parziale attivato (aPTT) sono due saggi clinici comuni che misurano l’integrità di una specifica via di coagulazione. Tuttavia, utilizzano il tempo come unica variabile che non fornisce alcuna indicazione delle proprietà fisiche del coagulo⁵. La microscopia elettronica consente la visualizzazione della microstruttura di un coagulo di fibrina completamente formato, ma non fornisce informazioni sul processo di formazione del coagulo^{stesso 6}. Tra tutti i saggi, i saggi di torbidità e TEG offrono la possibilità di monitorare dinamicamente le caratteristiche dei coaguli nel tempo. Queste tecniche consentono la misura di profili di coagulazione completi e, pertanto, forniscono qualche beneficio rispetto ad altri strumenti di caratterizzazione del coagulo di fibrina.

In particolare, i saggi di torbidità (o torbidimetria del coagulo) sono ampiamente utilizzati per la ricerca e le applicazioni cliniche grazie alla sua implementazione semplicistica e all’ampia accessibilità degli spettrometri nei laboratori di ricerca. Questo saggio permette una misurazione dinamica della trasmissione della luce attraverso un coagulo di formatura prendendo singole letture ripetitive a una lunghezza d’onda definita (più comunemente a una lunghezza d’onda nell’intervallo di 350 – 700 nm)⁷. La temperatura nella camera di lettura può anche essere regolata. Con la forma del gel fibrina, la quantità di luce che viaggia attraverso la rete proteica si riduce causando un aumento dell’assorbimento nel tempo. Allo stesso modo, l’assorbimento diminuisce quando la rete di coaguli si degrada. I saggi di turbidità possono essere facilmente multiplex utilizzando un formato di piastra multi-pozzo per consentire lo screening del campione ad alta velocità effettiva in entrambe le piastre 96 e 384-well. Diverse caratteristiche del coagulo possono essere derivate da una curva di tracciamento della torbidità (assorbimento nel tempo di misurazione) che includono: massima torbidità, tempo alla torbidità massima, tempo per l’insorgenza del coagulo e tasso di formazione dei coaguli (Vmax). Un rapporto massa/lunghezza in fibra di fibrina può anche essere derivato dai dati grezzi di torbidità per stimare lo spessore della fibra di fibrina^8,9,10.

TEG è utilizzato principalmente nell’ambiente clinico per valutare l’emostasi e la lisi coagulata dei pazienti. È anche comunemente usato in applicazioni chirurgiche per determinare quando i farmaci anti-fibrinolitici o prodotti ematici emostatici devono essere somministrati^11,12. La formazione di coaguli avviene all’interno di una tazza TEG con tutti i componenti di coagulazione aggiunti alla coppa prima dell’inizio del saggio. La coppa, con coagulo in evoluzione, ruota fisicamente contro un perno che viene inserito nel suo centro e un sensore di torsione elettromeccanica misura la crescente forza viscoelastica del coagulo. Questo saggio viene in genere effettuato alla temperatura fisiologica di 37 gradi centigradi; tuttavia, la temperatura può essere regolata manualmente sullo strumento. L’ampiezza massima (MA), la velocità di reazione (R), il tempo di cinetica (K), l’angolo di z (Angolo) e il tempo di ampiezza massima (TMA) vengono estratti dal software TEG dal tracciamento DINAMICO TEG. Questi valori vengono in genere confrontati con intervalli normali clinici per valutare lo stato di coagulazione di un paziente. Mentre TEG non è esattamente un viscometro, in quanto misura la forza del coagulo in unità millimetriche, fornisce importanti dati di coaguli viscoelastici e funziona come un prezioso strumento decisionale clinico per i medici per decidere di amministrare specifici prodotti sanguigni e regolare il dosaggio terapeutico¹³. Quando si utilizzano insieme sia i saggi TEG che i saggi di torbidità, forniscono informazioni complementari sulla caratterizzazione dei coaguli, poiché la forza del coagulo e la cinetica sono facilmente estratte dallo spessore della fibra teG e lo spessore della fibra di fibrina è accessibile mediante misurazioni ottiche della torbidità.

Poiché la fibrina è una componente critica di un coagulo di sangue, la caratterizzazione del coagulo di fibrina in diverse condizioni di formazione dei coaguli può fornire preziose informazioni su come una variabile specifica contribuisce al processo di formazione del coagulo e alle proprietà finali del coagulo. Comprendere questo può fornire indicazioni per la diagnosi di trombosi e lo sviluppo di terapie. Per ottenere una caratterizzazione del coagulo di fibrina più rappresentativa, il plasma può essere sostituito per monitorare la formazione di coaguli in quanto assomiglia più da vicino alle condizioni di coagulazione in vivo rispetto a un sistema di modelli fibrinogeni/trombini semplificato. Tuttavia, a causa dell’intricata natura della cascata di coagulazione, la formazione di coaguli utilizzando il plasma aumenta la complessità, rendendo più difficile isolare l’impatto dei singoli fattori. L’utilizzo di un modello semplificato di fibrinogeno/trombo impedisce la necessità di avviare l’intera cascata di coagulazione consentendo l’isolamento della fase finale della formazione della fibrina. Includendo due componenti di formatura di fibrina principali (fibrinogeno e trombano), questa configurazione crea una condizione di formazione del coagulo altamente controllata. È anche importante notare che, mentre qui viene utilizzato il modello di coagulo semplificato, questo protocollo può essere utilizzato anche per caratterizzare coaguli più complessi includendo ulteriori fattori di coagulazione. In questo studio, la caratterizzazione del coagulo di fibrina utilizzando torbidità e TEG viene effettuata variando concentrazioni di fibrinogeno e trombano, forza ionica, pH e concentrazione totale di proteine nella soluzione di coagulazione per imitare diverse circostanze di coagulazione in vivo¹⁴. I dettagli relativi a queste variazioni del protocollo sono stati inclusi nella Sezione 5.

Protocol

1. Preparazione della salina tampone di fosfati (PBS) NOTA: PBS è stato utilizzato in tutto questo studio in quanto gli saggi descritti non richiedevano l’aggiunta di calcio. È importante notare che quando si aggiunge calcio, spesso utilizzato per ri-calcificare i prodotti sanguigni citratti, PBS dovrebbe essere evitato come calcio è noto per precipitare in tamponi di fosfati. Fare un tampone di 0,01 M, pH 7,4 PBS mescolando 137 mM di cloruro di sodio, 1,8 mM di monobasico di fosf…

Representative Results

Gli esperimenti mostrati nella Figura 1 sono curve rappresentative di torbidità che tracciano le curve dei coaguli di fibrina umana e bovina a diversi livelli di fibrinogeno. Nella Figura 2 sono illustrate le curve di tracciamento TEG rappresentative per la formazione di coaguli di fibrina a diversi livelli di fibrinogeno. Entrambe le curve di tracciamento dimostrano che dopo un periodo di ritardo dopo l’iniziazione del coagulo, la torbidità del coagulo o l’am…

Discussion

Questo protocollo dimostra l’utilizzo di due distinti strumenti di caratterizzazione del coagulo che testano un modello semplificato di coagulo fibrinogen/trombo utilizzando componenti disponibili in modo commerciale. Sia TEG e turbidity saggi sono facili da condurre. Non solo forniscono esami del coagulo del punto finale come la formazione di coaguli max (Turb^Max e TEG^Max) e i tempi di formazione dei coaguli (Tempo di^Turb e Tempo^TEG),ma valutano anche il processo di formazione…

Materials

96-Well Clear Flat Bottom UV-Transparent Microplate	Corning	3635	Non-treated acrylic copolymer, non-sterile
Albumin from human serum	Millipore Sigma	A1653	≥96%, lyophilized powder
Arium Mini Plus Ultrapure Water System	Sartorius	NA	DI water source
Bovine serum albumin	Millipore Sigma	A2153	≥96%, lyophilized powder
Disposable Cups and Pins for TEG 5000 (Clear)	Haemonetics	REF 6211
Fibrinogen, Bovine Plasma	Millipore Sigma	341573	contains more than 95% clottable protein
Fibrinogen, Plasmingogen-Depleted, Human Plasma	Millipore Sigma	341578	Contains ≥ 95% clottable proteins.
Phosphate buffered saline	Millipore Sigma	P3813	Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions
Potassium chloride	Millipore Sigma	60130	≥99.5% purity
Potassium phosphate monobasic	Millipore Sigma	P9791	≥98% purity
SevenEasy pH Meter	Mettler Toledo	S20
Sodium chloride	Millipore Sigma	71378	≥99.5% purity
Sodium phosphate dibasic	Millipore Sigma	71636	≥99.5% purity
SpectraMax M5 multi-detection microplate reader system	Molecular Devices	M5
TEG 5000 Thrombelastograph Hemostasis analyzer system	Haemonetics	07-022
Thrombin, Bovine	Millipore Sigma	605157
Thrombin, Human Plasma, High Activity	Millipore Sigma	605195