相補的な血栓特性解析のための濁度と血栓芽細胞学の活用
Summary
フィブリンは、止血症および血栓症の間に血栓形成を担当する。濁度アッセイおよびトロンボエラストグラヒ(TEG)は、血栓の相補的評価を提供する相乗的なツールとして利用することができる。これらの2つの技術を組み合わせることで、凝固条件がフィブリン血栓形成にどのような影響を与えるかについてのより多くの洞察を与えることができる。
Abstract
血栓症は世界的に主要な死因である。フィブリン(オーゲン)は、主に血栓形成または血栓症の原因となるタンパク質です。したがって、フィブリン血栓形成の特徴付けは、血栓症の研究に有益である。濁度および血栓芽細胞検査(TEG)は、血栓形成を監視するためのインビトロアッセイで広く利用されている。濁度は、分光計を介してフィブリン血栓構造を通して光透過率を動的に測定し、しばしば研究室で使用されます。TEGは、血液凝固強度を直接測定する特殊な粘弾性技術であり、主に患者の止血を評価するために臨床現場で利用されています。これら2つのツールの助けを借りて、この研究は、単純化されたフィブリノーゲン/トロンビン血栓モデルを使用してインビトロフィブリン血栓を特徴付けるための方法を説明する。両方の技術のデータ傾向は、様々な凝固条件下で比較された。牛凝固因子は、臨床および研究現場におけるヒト凝固因子の代替としてしばしば使用されるため、この研究ではヒトおよびウシのフィブリン血栓が並んで形成された。結果は、TEGと濁度トラック血栓形成が2つの異なる方法を介して、かつ一緒に利用される場合、多様な凝固条件にわたって相補的な血栓強度および繊維構造情報を提供することを示す。
Introduction
血栓症は、世界中の高い罹患率と死亡率につながる血液循環を遮断する体内の血栓の病理学的形成である。静脈血栓塞栓症の1〜2例と、年間1000人当たりの血栓症誘発血管疾患の2〜3例1,がある。血栓芽細胞検査(TEG)と濁度を利用して、様々な凝固条件下で血栓形成を監視する方法を紹介します。フィブリン(オーゲン)は、体内の血栓形成を担う一次タンパク質です。凝固カスケードの最終段階では、血栓が発達するに従って不溶性フィブリンモノマーの重合を開始するトロンビンによってフィブリノーゲンからフィブリノペプチドが切断される3,4。4病理的血栓症における血栓形成を理解するには、多様な凝固状況下でフィブリン形成を特徴付ける必要がある。複数の血栓モニタリングアッセイは、インビトロでのフィブリン血栓形成を研究するために利用されてきた。プロトロンビン時間(PT/INR)および活性化部分トロンボプラスチン時間(aPTT)は、特定の凝固経路の完全性を測定する2つの一般的な臨床アッセイである。しかし、それらは、物理血栓プロパティ5を示さない唯一の変数として時間を使用します。電子顕微鏡法は、完全に形成されたフィブリン血栓の微細構造の可視化を可能にするが、血栓形成プロセス自体に関する情報を提供しない6。すべてのアッセイの中で、濁度アッセイおよびTEGは、時間の経過とともに血栓特性を動的に追跡する能力を提供する。これらの技術は、包括的な凝固プロファイルの測定を可能にし、したがって、他のフィブリン凝固特性測定ツールよりもいくつかの利点を提供する。
具体的には、濁度アッセイ(または血栓タービディメトリー)は、その単純な実装と研究室での分光計の広いアクセシビリティのために研究と臨床用途に広く使用されています。このアッセイは、定義された波長(最も一般的には350-700 nmの範囲の波長で)で個々の反復測定値を取ることによって形成血栓を通して光透過率の動的測定を可能にする7。読書室の温度はまた調節することができる。フィブリンゲルが形成されるに伴い、タンパク質ネットワークを通過する光量が減少し、時間の経過とともに吸光度が増加します。同様に、血栓ネットワークが劣化すると吸光度が低下する。濁度アッセイは、マルチウェルプレート形式を使用して簡単に多重化することができ、96ウェルプレートと384ウェルプレートの両方で高スループットのサンプルスクリーニングが可能です。いくつかの血栓特性は、最大濁度、最大濁度までの時間、凝固する時間、および血栓形成速度(Vmax)を含む濁度トレーシング曲線(経時の吸光度)から導き出すことができます。フィブリン繊維質量/長さ比は、フィブリン繊維の,厚さ8、9、109を推定するために生8の濁度データからも導き出すことができます。10
TEGは、主に患者の止血症および血栓のリシスを評価するために臨床現場で利用される。また、抗線維化分解薬や止血性血液製剤をいつ投与すべきかを決定するために、外科用途で一般的に使用されます11,,12.血栓形成は、アッセイ開始前にカップに全ての凝固成分が加えられるTEGカップの内部で起こる。カップは、進化する血栓で、その中心に挿入されたピンに対して物理的に回転し、電気機械トーションセンサーは血栓の粘弾性強度の増加を測定する。このアッセイは、典型的には37°Cの生理学的温度で行われる。ただし、温度は、機器上で手動で調整することができます。最大振幅(MA)、反応速度(R)、運動時間(K)、α角(角度)、および最大振幅(TMA)までの時間は、動的TEGトレーシングからTEGソフトウェアによって抽出される。これらの値は、典型的には、患者の凝固状態を評価するために臨床正常範囲と比較される。TEGは正確には粘度計ではありませんが、ミリ単位の血栓強度を測定するため、医師が特定の血液製剤を投与し、治療的投与を調整することを決定するための貴重な臨床意思決定ツールとして重要な粘弾性血栓データおよび機能を提供します。TEGと濁度アッセイの両方を併用すると、凝固強度とキネティクスがTEGから容易に抽出され、フィブリン繊維厚が光学的濁度測定によってアクセスできるため、相補的な血栓特性評価情報を提供します。
フィブリンは血栓の重要な成分であるため、多様な血栓形成条件下でのフィブリン血栓特徴付けは、特定の変数が血栓形成プロセスおよび最終的な血栓特性にどのように寄与するかについての貴重な洞察を提供することができる。これを理解することは、血栓症診断と治療薬の開発のためのガイダンスを提供することができます。より代表的なフィブリン血栓の特徴を得るために、プラズマは、単純化されたフィブリノーゲン/トロンビンモデルシステムよりも密接に生体内凝固条件に似ているため、血栓形成を監視するために置き換えることができます。しかし、凝固カスケードの複雑な性質により、プラズマを用いた血栓形成は複雑さを増し、個々の因子の影響を分離することがより困難になります。単純化フィブリノーゲン/トロンビンモデルを利用することで、凝固カスケード全体を開始する必要がなくなり、最終的なフィブリン形成ステップの分離が可能になります。2つの主要なフィブリン形成成分(フィブリノーゲンおよびトロンビン)を含めることによって、このセットアップは高度に制御された血栓形成条件を作成する。また、ここでは簡略化された血栓モデルを使用する一方で、このプロトコルを利用して、追加の凝固因子を含めることによってより複雑な血栓を特徴付けることもできます。本研究では、濁度およびTEGを用いたフィブリン血栓特性解析は、フィブリノーゲンおよびトロンビン濃度、イオン強度、pH、および全タンパク質濃度を生体内凝固環境において異なることを模倣する凝固液中での異なる濃度によって行われる。プロトコルに対するこれらのバリエーションに関する詳細は、セクション5に含まれています。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、市販のコンポーネントを使用して単純化されたフィブリノーゲン/トロンビン血栓モデルをテストする2つの異なる血栓特徴付けツールの利用を実証する。TEGおよび濁度アッセイは、いずれも容易に実施できます。それらは、最大血栓形成(ターブマックス およびTEGマックス)および血栓形成時間(ターブ時間 およびTEG時間)のような終点血栓検…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
なし。
Materials
| 96-Well Clear Flat Bottom UV-Transparent Microplate | Corning | 3635 | Non-treated acrylic copolymer, non-sterile |
| Albumin from human serum | Millipore Sigma | A1653 | ≥96%, lyophilized powder |
| Arium Mini Plus Ultrapure Water System | Sartorius | NA | DI water source |
| Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A2153 | ≥96%, lyophilized powder |
| Disposable Cups and Pins for TEG 5000 (Clear) | Haemonetics | REF 6211 | |
| Fibrinogen, Bovine Plasma | Millipore Sigma | 341573 | contains more than 95% clottable protein |
| Fibrinogen, Plasmingogen-Depleted, Human Plasma | Millipore Sigma | 341578 | Contains ≥ 95% clottable proteins. |
| Phosphate buffered saline | Millipore Sigma | P3813 | Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions |
| Potassium chloride | Millipore Sigma | 60130 | ≥99.5% purity |
| Potassium phosphate monobasic | Millipore Sigma | P9791 | ≥98% purity |
| SevenEasy pH Meter | Mettler Toledo | S20 | |
| Sodium chloride | Millipore Sigma | 71378 | ≥99.5% purity |
| Sodium phosphate dibasic | Millipore Sigma | 71636 | ≥99.5% purity |
| SpectraMax M5 multi-detection microplate reader system | Molecular Devices | M5 | |
| TEG 5000 Thrombelastograph Hemostasis analyzer system | Haemonetics | 07-022 | |
| Thrombin, Bovine | Millipore Sigma | 605157 | |
| Thrombin, Human Plasma, High Activity | Millipore Sigma | 605195 |
References
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