Alavancando a Turbidez e a Tromboelastografia para Caracterização Complementar do Coágulo

Summary

A fibrina é responsável pela formação de coágulos durante a hemostasia e trombose. Ensaios de turbidez e tromboelastograhy (TEG) podem ser utilizados como ferramentas sinérgicas que fornecem avaliação complementar de um coágulo. Essas duas técnicas juntas podem dar mais informações sobre como as condições de coagulação afetam a formação de coágulos fibrinas.

Abstract

A trombose é a principal causa de morte em todo o mundo. Fibrin(ogen) é a proteína principal responsável pela formação de coágulos ou trombose. Portanto, caracterizar a formação de coágulos fibrinas é benéfico para o estudo da trombose. A turbidez e a tromboelastografia (TEG) são ambos ensaios in vitro amplamente utilizados para monitorar a formação de coágulos. A turbidez mede dinamicamente a transmissão da luz através de uma estrutura de coágulos de fibrina através de um espectrômetro e é frequentemente usada em laboratórios de pesquisa. O TEG é uma técnica viscoelástica especializada que mede diretamente a força do coágulo sanguíneo e é utilizada principalmente em ambientes clínicos para avaliar a hemostasia dos pacientes. Com a ajuda dessas duas ferramentas, este estudo descreve um método para caracterizar um coágulo de fibrina in vitro usando um modelo simplificado de coágulo fibrinogênio/trombina. As tendências de dados em ambas as técnicas foram comparadas em várias condições de coagulação. Os coágulos de fibrina humana e bovina foram formados lado a lado neste estudo, pois os fatores de coagulação bovina são frequentemente usados como substitutos de fatores de coagulação humana em ambientes clínicos e de pesquisa. Os resultados demonstram que o TEG e a turbidez acompanham a formação do coágulo por meio de dois métodos distintos e, quando utilizados em conjunto, fornecem informações estruturais complementares de resistência ao coágulo e fibras em diversas condições de coagulação.

Introduction

Trombose é a formação patológica de um coágulo sanguíneo no corpo que bloqueia a circulação sanguínea levando à alta morbidade e mortalidade em todo o mundo. Há 1 a 2 casos de tromboembolismo venoso e 2 a 3 casos de doenças vasculares induzidas por trombose por 1000 pessoas anualmente^1,,2. Apresentado aqui é um método que aproveita a tromboelastografia (TEG) e a turbidez para monitorar a formação de coágulos em várias condições de coagulação. Fibrin(ogen) é a proteína primária responsável pela formação de coágulos no corpo. Nas etapas finais da cascata de coagulação, as fibrinopeptídeos são cortadas do fibrinogênio por trombina iniciando a polimerização de monômeros fibrinos insolúveis à medida que o coágulo se desenvolve^3,,4. Para compreender a formação de coágulos em trombose patológica, é necessário caracterizar a formação de fibrinas em diversas circunstâncias de coagulação. Vários ensaios de monitoramento de coágulos foram utilizados para estudar a formação de coágulos de fibrina in vitro. Tempo de protrombina (PT/INR) e tempo de tromboplastina parcial ativado (aPTT) são dois ensaios clínicos comuns que medem a integridade de uma via específica de coagulação. No entanto, eles usam o tempo como a única variável que não dá nenhuma indicação de propriedades de coágulo físico⁵. A microscopia eletrônica permite a visualização da microestruturn de um coágulo fibrina completamente formado, mas não fornece informações sobre o processo de formação de coágulos em si⁶. Entre todos os ensaios, ensaios de turbidez e TEG oferecem a capacidade de rastrear as características do coágulo dinamicamente ao longo do tempo. Essas técnicas permitem a medida de perfis abrangentes de coagulação e, portanto, proporcionam algum benefício sobre outras ferramentas de caracterização de coágulos fibrinos.

Especificamente, ensaios de turbidez (ou turbidimetria de coágulo) são amplamente utilizados para pesquisas e aplicações clínicas devido à sua implementação simplista e à ampla acessibilidade de espectrômetros em laboratórios de pesquisa. Este ensaio permite uma medição dinâmica da transmissão de luz através de um coágulo formador, fazendo leituras repetitivas individuais em um comprimento de onda definido (mais comumente em um comprimento de onda na faixa de 350 – 700 nm)⁷. A temperatura na câmara de leitura também pode ser ajustada. À medida que o gel fibrin se forma, a quantidade de luz que viaja através da rede proteica é reduzida causando um aumento na absorção ao longo do tempo. Da mesma forma, a absorvância diminui quando a rede de coágulos se degrada. Ensaios de turbidez podem ser facilmente multiplexados usando um formato de placa multi-poço para permitir uma triagem de amostra de alto rendimento em placas de 96 e 384 poços. Várias características do coágulo podem ser derivadas de uma curva de rastreamento de turbidez (absorvância ao longo do tempo) que incluem: turbidez máxima, tempo para turbidez máxima, tempo para início do coágulo e taxa de formação de coágulos (Vmax). Uma relação de massa/comprimento de fibra fibrina também pode ser derivada de dados de turbidez bruta para estimar a espessura da fibra fibrina^8,,9,,10.

O TEG é utilizado principalmente no cenário clínico para avaliar a hemostasia e a lise do coágulo dos pacientes. Também é comumente usado em aplicações cirúrgicas para determinar quando drogas anti-fibriníticas ou produtos sanguíneos hemostáticos devem ser administrados^11,12. A formação de coágulos ocorre dentro de um copo TEG com todos os componentes de coagulação sendo adicionados ao copo antes do início do ensaio. O copo, com coágulo em evolução, gira fisicamente contra um pino que é inserido em seu centro e um sensor de torção eletromecânica mede a crescente força viscoelástica do coágulo. Este ensaio é normalmente realizado a temperatura fisiológica de 37 °C; no entanto, a temperatura pode ser ajustada manualmente no instrumento. A amplitude máxima (MA), a taxa de reação (R), o tempo cinético (K), o ângulo α (Ângulo) e o tempo de amplitude máxima (TMA) são extraídos pelo software TEG a partir do rastreamento DINÂMICO TEG. Esses valores são tipicamente comparados com faixas normais clínicas para avaliar o estado de coagulação do paciente. Embora o TEG não seja precisamente um viscométrico, pois mede a força do coágulo em unidades milimétricas, ele fornece dados importantes de coágulos viscoelásticos e funciona como uma valiosa ferramenta de tomada de decisão clínica para que os médicos decidam administrar produtos sanguíneos específicos e ajustar a dosagem terapêutica¹³. Quando os ensaios teg e turbidez são utilizados em conjunto, eles fornecem informações complementares de caracterização de coágulos, pois a força do coágulo e a cinética são facilmente extraídas do TEG e a espessura da fibra fibrina pode ser acessada por medições ópticas de turbidez.

Como a fibrina é um componente crítico de um coágulo sanguíneo, a caracterização do coágulo fibrina em diversas condições de formação de coágulos pode fornecer uma visão valiosa de como uma variável específica contribui para o processo de formação de coágulos e propriedades finais do coágulo. Entender isso pode fornecer orientação para o diagnóstico de trombose e o desenvolvimento da terapêutica. Para obter uma caracterização mais representativa do coágulo fibrina, o plasma pode ser substituído para monitorar a formação de coágulos, pois se assemelha a condições de coagulação in vivo mais de perto do que um sistema simplificado de modelo fibrinogênio/trombina. No entanto, devido à natureza intrincada da cascata de coagulação, a formação de coágulos usando plasma aumenta a complexidade, tornando mais difícil isolar o impacto de fatores individuais. A utilização de um modelo simplificado de fibrinogen/trombina impede a necessidade de iniciar toda a cascata de coagulação permitindo o isolamento da etapa final de formação de fibrinas. Ao incluir dois componentes principais de formação de fibrinas (fibrinogênio e trombina), esta configuração cria uma condição de formação de coágulos altamente controlada. Também é importante notar que, embora o modelo de coágulo simplificado seja utilizado aqui, este protocolo também pode ser utilizado para caracterizar coágulos mais complexos, incluindo fatores adicionais de coagulação. Neste estudo, a caracterização do coágulo fibrina utilizando turbidez e TEG é realizada por diferentes concentrações de fibrinogênio e trombina, força iônica, pH e concentração total de proteínas na solução de coagulação para imitar diferentes circunstâncias de coagulação ao vivo¹⁴. Os detalhes sobre essas variações ao protocolo foram incluídos na Seção 5.

Protocol

1. Preparação de soro fisiológico tampão fosfato (PBS) NOTA: A PBS foi utilizada ao longo deste estudo, pois os ensaios descritos não necessitaram da adição de cálcio. É importante notar que ao adicionar cálcio, muitas vezes utilizado para recalcar produtos sanguíneos avaliados, a PBS deve ser evitada, pois o cálcio é conhecido por precipitar em tampões fosfatos. Faça um tampão de 0,01 M, pH 7.4 PBS misturando cloreto de sódio de 137 mM, 1,8 mM de fosfato de potássi…

Representative Results

Os experimentos mostrados na Figura 1 são curvas representativas de rastreamento de turbidez de coágulos fibrinas humanos e bovinos em diferentes níveis de fibrinogênio. As curvas de rastreamento TEG representativas para formação de coágulos de fibrina em diferentes níveis de fibrinogênio são mostradas na Figura 2. Ambas as curvas de rastreamento demonstram que após um período de atraso após a iniciação do coágulo, a turbidez do coágulo ou a amp…

Discussion

Este protocolo demonstra a utilização de duas ferramentas distintas de caracterização de coágulos testando um modelo simplificado de coágulo fibrinogênio/trombina usando componentes disponíveis comercialmente. Tanto os ensaios teg quanto de turbidez são fáceis de conduzir. Eles não só fornecem exames de coágulos de ponto final, como a formação de coágulos max (Turb^Max e TEG^Max) e os tempos de formação de coágulos (Turb^Time e TEG^Time), mas também avaliam o pr…

Materials

96-Well Clear Flat Bottom UV-Transparent Microplate	Corning	3635	Non-treated acrylic copolymer, non-sterile
Albumin from human serum	Millipore Sigma	A1653	≥96%, lyophilized powder
Arium Mini Plus Ultrapure Water System	Sartorius	NA	DI water source
Bovine serum albumin	Millipore Sigma	A2153	≥96%, lyophilized powder
Disposable Cups and Pins for TEG 5000 (Clear)	Haemonetics	REF 6211
Fibrinogen, Bovine Plasma	Millipore Sigma	341573	contains more than 95% clottable protein
Fibrinogen, Plasmingogen-Depleted, Human Plasma	Millipore Sigma	341578	Contains ≥ 95% clottable proteins.
Phosphate buffered saline	Millipore Sigma	P3813	Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions
Potassium chloride	Millipore Sigma	60130	≥99.5% purity
Potassium phosphate monobasic	Millipore Sigma	P9791	≥98% purity
SevenEasy pH Meter	Mettler Toledo	S20
Sodium chloride	Millipore Sigma	71378	≥99.5% purity
Sodium phosphate dibasic	Millipore Sigma	71636	≥99.5% purity
SpectraMax M5 multi-detection microplate reader system	Molecular Devices	M5
TEG 5000 Thrombelastograph Hemostasis analyzer system	Haemonetics	07-022
Thrombin, Bovine	Millipore Sigma	605157
Thrombin, Human Plasma, High Activity	Millipore Sigma	605195