Planarian Scrunching als een kwantitatieve gedragsuitlezing voor schadelijke stimuli sensing
Summary
Zoetwaterplanariërs vertonen drie gangen (glijden, peristaltiek en scrunching) die te onderscheiden zijn door kwantitatieve gedragsanalyse. We beschrijven een methode om scrunching te induceren met behulp van verschillende schadelijke stimuli, kwantificering daarvan, en onderscheid van peristaltiek en glijden. Met behulp van gen knockdown, tonen we de specificiteit van scrunching als een kwantitatieve fenotypische uitlezing.
Abstract
Zoetwaterplanarianen glijden normaal gesproken soepel door ciliary voortstuwing aan hun ventrale kant. Bepaalde omgevingsomstandigheden kunnen echter spiergestuurde vormen van beweging veroorzaken: peristaltiek of scrunching. Terwijl peristalse het gevolg is van een ciliary defect, scrunching is onafhankelijk van cilia functie en is een specifieke reactie op bepaalde stimuli, met inbegrip van amputatie, schadelijke temperatuur, extreme pH, en ethanol. Dus, deze twee spieren-gedreven gangen zijn mechanistisch verschillend. Ze kunnen echter moeilijk kwalitatief te onderscheiden zijn. Hier bieden we een protocol voor het induceren van scrunching met behulp van verschillende fysieke en chemische stimuli. We beschrijven de kwantitatieve karakterisering van scrunching, die kan worden gebruikt om het te onderscheiden van peristaltiek en glijden, met behulp van vrij beschikbare software. Aangezien scrunching een universele planaire gang is, zij het met kenmerkende soortenspecifieke verschillen, kan dit protocol in grote lijnen worden toegepast op alle soorten planarianen, wanneer u passende overwegingen gebruikt. Om dit aan te tonen, vergelijken we de reactie van de twee meest populaire planaire soorten die worden gebruikt in gedragsonderzoek, Dugesia japonica en Schmidtea mediterranea, met dezelfde set van fysieke en chemische stimuli. Bovendien maakt de specificiteit van scrunching het mogelijk om dit protocol te gebruiken in combinatie met RNA-interferentie en/of farmacologische blootstelling om de betrokken moleculaire doelen en neuronale circuits te ontleden, waardoor mogelijk mechanistisch inzicht kan worden verschaft in belangrijke aspecten van nociception en neuromusculaire communicatie.
Introduction
Naast hun populariteit voor stamcel- en regeneratieonderzoek1,2,,3, zoetwaterplanarianen zijn al lang gebruikt in gedragsstudies4,5, profiterend van hun relatief grote omvang (een paar millimeter in lengte), gemak en lage kosten van laboratoriumonderhoud, en breed spectrum van waarneembaar gedrag. De introductie van computer visie en geautomatiseerde tracking om planaire gedragsstudies6,7,8,9,10,11 hebben kwantitatieve differentiatie van gedragsfenotypen mogelijk gemaakt. Dierlijk gedrag is een directe uitlezing van de neuronale functie. Omdat het vaatstelsel van gemiddelde grootte en complexiteit is, maar geconserveerde sleutelelementen deelt met het gewervelde brein12,13,14,kan het bestuderen van planarian gedrag inzicht geven in geconserveerde mechanismen van neuronale werking die moeilijk direct kunnen worden onderzocht in complexere organismen. Planarianen zijn dus een waardevol model voor vergelijkende neurobiologiestudies8,12,15,16,17,18,19,20,21. Bovendien zorgt het aquatisch milieu voor snelle en facile blootstelling aan chemische stoffen om hun effect op de hersenfunctie te bestuderen bij het regenereren en volwassen planarianen, waardoor ze een populair systeem voor neurotoxicologie22,23,24,25,26.
Planarianen bezitten drie verschillende gangen, aangeduid als zweefvliegen, peristaltiek, en scrunching. Elke gang wordt tentoongesteld onder specifieke omstandigheden: glijden is de standaard gang, peristaltiek treedt op wanneer ciliary functie wordt aangetast7,27, en scrunching is een ontsnapping gang – onafhankelijk van trilharen functie – in reactie op bepaalde schadelijke stimuli7. We hebben aangetoond dat scrunching een specifieke reactie is, opgewekt door het gevoel van bepaalde chemische of fysieke signalen, waaronder extreme temperaturen of pH, mechanisch letsel of specifieke chemische inductoren, en dus geen algemene stressrespons is7,28,29.
Vanwege de specificiteit en stereotiepe parameters, die gemakkelijk kunnen worden gekwantificeerd met behulp van dit protocol, scrunching is een krachtige gedragsfenotype dat onderzoekers in staat stelt om mechanistische studies ontleden zintuiglijke trajecten en neuronale controle van gedrag25,28uit te voeren. Bovendien is aangetoond dat scrunching een gevoelig eindpunt is om nadelige chemische effecten op de ontwikkeling van het zenuwstelsel en de functie in neurotoxicologiestudies 22,,24,25,30te testen .24 Zoals verschillende zintuiglijke paden lijken te convergeren om scrunching induceren door middel van verschillende mechanismen28, scrunching verschilt van andere planarian gedrag, omdat verschillende, maar specifieke, stimuli kunnen worden gebruikt om aparte neuronale circuits ontleden en bestuderen hoe verschillende signalen zijn geïntegreerd om de singcrunch fenotype te produceren.
Belangrijk is dat er soortenverschillen bestaan, waarbij de ene chemische stof scrunching kan uitlokken bij de ene planaire soort, maar een andere gedragsreactie in een andere. We hebben bijvoorbeeld ontdekt dat anandamide scrunching induceert bij de planaire soorten Dugesia japonica, maar peristaltiek induceert in Schmidtea mediterranea28. Dit voorbeeld benadrukt het belang van het betrouwbaar kunnen onderscheiden van de verschillende gangen, omdat ze de fenotypische manifestaties zijn van verschillende moleculaire mechanismen. Het onderscheid tussen scrunching en peristaltiek is echter moeilijk met behulp van kwalitatieve observationele gegevens, omdat beide gangen op spierstelsels zijn gericht en kwalitatieve gelijkenissen hebben7,28. Om de gangen te onderscheiden is het dus noodzakelijk om cilia imaging of een kwantitatieve gedragsstudie uit te voeren, die onderscheid mogelijk maakt op basis van karakteristieke parameters7,28. Omdat cilia imaging is experimenteel uitdagend en vereist gespecialiseerde apparatuur, zoals een high-vergroting samengestelde microscoop en een high-speed camera7,28, het is niet zo breed toegankelijk voor onderzoekers als kwantitatieve gedragsanalyse.
Hier presenteren we een protocol voor (1) de inductie van scrunching met behulp van verschillende fysieke (schadelijke temperatuur, amputatie, bijna-UV-licht) en chemische (allyl isothiocyanaat (AITC), cinnamaldehyde) stimuli en (2) de kwantitatieve analyse van planair gedrag met behulp van vrij beschikbare software. Door vier parameters te kwantificeren (frequentie van lichaamslengteschommelingen, relatieve snelheid, maximale amplitude en asymmetrie van lichaamsverlenging en samentrekking)7, kan scrunching worden onderscheiden van zweefvliegen, peristaltiek en andere gedragstoestanden die in de literatuur worden gemeld, zoals slangachtige voortbeweging15 of epilepsies15. Bovendien, terwijl scrunching wordt bewaard onder verschillende planaire soorten7, elke soort heeft zijn eigen karakteristieke frequentie en snelheid; daarom, zodra de glijdende en knarsende snelheden van een soort zijn bepaald, kan de snelheid alleen worden gebruikt als een middel om scrunching van glijden en peristaltiek29te onderscheiden. Het protocol gaat uit van een voorafgaande opleiding in computationele beeldanalyse of gedragsstudies en kan dus ook worden toegepast voor planaire gedragsexperimenten in een onderwijslaboratoriumcontext op bachelorniveau. Voorbeeldgegevens om protocolaanpassing te vergemakkelijken worden verstrekt in het supplementaire materiaal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Met behulp van dit protocol kan men kwantitatief de effecten van fysische en chemische stimuli7,28,,29 of genetische manipulatie (RNAi)28,29 op planaire bewegingsvrijheid bestuderen. Om de ruimtelijke resolutie te maximaliseren, is het het beste om de camera zo dicht mogelijk bij de arena te verplaatsen, terwijl de hele arena zich in het gezichtsveld bevindt. Om de doorv…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken de heer Tapan Goel voor commentaar op het manuscript. Dit werk werd gefinancierd door NSF CAREER Grant 1555109.
Materials
| Allyl isothiocyanate, 95% (AITC) | Sigma-Aldrich | 377430-5G | CAUTION: Flammable and acutely toxic; handle in a fume hood with appropriate PPE. |
| Camera lens, 2/3 25mm F/1.4 | Tamron | 23FM25SP | |
| Cell culture plates, 6 well, tissue culture treated | Genesee Scientific | 25-105 | |
| Centrifuge tubes, 50 mL polypropylene, sterile | MedSupply Partners | 62-1019-2 | |
| Cinnamaldehyde, >95% | Sigma-Aldrich | W228613-100G-K | |
| Dimmable A4 LED Tracer Light Box | Amazon | B07HD631RP | |
| Flea3 USB3 camera | FLIR | FL3-U3-13E4M | |
| Heat resistant gloves | Fisher Scientific | 11-394-298 | |
| Hot plate | Fisher Scientific | HP88854200 | |
| Instant Ocean Sea Salt, prepared in deionized water | Instant Ocean | SS15-10 | Prepare in deionized water at 0.5 g/L. |
| Montjüic salts, prepared in Milli-Q water | Sigma-Aldrich | various | Prepare in milli-Q water at 1.6 mM NaCl, 1.0 mM CaCl2, 1.0 mM MgSO4, 0.1 mM MgCl2, 0.1 mM KCl, 1.2 mM NaHCO3; adjust pH to 7.0 with HCl. |
| Petri dishes, 100 mm x 20 mm, sterile polystyrene | Simport | D210-7 | |
| Pipette, 20-200 μL range | Rainin | 17008652 | |
| PYREX 150 mL beaker | Sigma-Aldrich | CLS1000150 | |
| Razor blade, 0.22 mm | VWR | 55411-050 | |
| Roscolux color filter: Golden Amber | Rosco | R21 | Alternatively purchase the Roscolux Designer Color Selector (Musson Theatrical product #SBLUX0306) which includes all 3 color filters together. |
| Roscolux color filter: Medium Red | Rosco | R27 | |
| Roscolux color filter: Storaro Red | Rosco | R2001 | |
| Samco transfer pipette, 62 µL large aperture | Thermo Fisher | 691TS | |
| Support stand | Fisher Scientific | 12-947-976 | |
| Thermometer | VWR | 89095-600 | |
| UV laser pointer | Amazon | B082DGS86R | This is a Class II laser (405nm ±10nm) with output power <5 mW. |
References
- Rink, J. C. Stem cell systems and regeneration in planaria. Development Genes and Evolution. 223, 67-84 (2013).
- Reddien, P. W., Alvarado, A. S. Fundamentals of Planarian Regeneration. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 20, 725-757 (2004).
- Cebrià, F. Regenerating the central nervous system: how easy for planarians. Development Genes and Evolution. 217, 733-748 (2007).
- Pearl, R. Memoirs: The Movements and Reactions of Fresh-Water Planarians: A Study in Animal Behaviour. Journal of Cell Science. , 2-46 (1903).
- Mc Connell, J. . A Manual of Psychological Experimentation on Planarians. , (1967).
- Talbot, J., Schötz, E. M. Quantitative characterization of planarian wild-type behavior as a platform for screening locomotion phenotypes. Journal of Experimental Biology. 214, 1063-1067 (2011).
- Cochet-Escartin, O., Mickolajczk, K. J., Collins, E. M. S. Scrunching: a novel escape gait in planarians. Physical Biology. 12, 055001 (2015).
- Inoue, T., et al. Planarian shows decision-making behavior in response to multiple stimuli by integrative brain function. Zoological Letters. 1, 1-15 (2015).
- Arenas, O. M., et al. Activation of planarian TRPA1 by reactive oxygen species reveals a conserved mechanism for animal nociception. Nature Neuroscience. 20, 1686-1693 (2017).
- Shomrat, T., Levin, M. An automated training paradigm reveals long-term memory in planarians and its persistence through head regeneration. Journal of Experimental Biology. 216, 3799-3810 (2013).
- Blackiston, D., Shomrat, T., Nicolas, C. L., Granata, C., Levin, M. A Second-Generation device for automated training and quantitative behavior analyses of Molecularly-Tractable model organisms. PLoS One. 5, 1-20 (2010).
- Ross, K. G., Currie, K. W., Pearson, B. J., Zayas, R. M. Nervous system development and regeneration in freshwater planarians. Wiley Interdisciplinary Reviews-Developmental Biology. 6, 266 (2017).
- Cebrià, F., et al. The expression of neural-specific genes reveals the structural and molecular complexity of the planarian central nervous system. Mechanisms of Development. , 116-204 (2002).
- Mineta, K., et al. Origin and evolutionary process of the CNS elucidated by comparative genomics analysis of planarian ESTs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 7666-7671 (2003).
- Ross, K. G., et al. SoxB1 Activity Regulates Sensory Neuron Regeneration, Maintenance, and Function in Planarians. Developmental Cell. 47, 331-347 (2018).
- Nishimura, K., et al. Reconstruction of Dopaminergic Neural Network and Locomotion Function in Planarian Regenerates. Developmental Neurobiology. 67, 1059-1078 (2007).
- Birkholz, T. R., Beane, W. S. The planarian TRPA1 homolog mediates extraocular behavioral responses to near-ultraviolet light. Journal of Experimental Biology. 220, 2616-2625 (2017).
- Currie, K. W., Molinaro, A. M., Pearson, B. J. Neuronal sources of hedgehog modulate neurogenesis in the adult planarian brain. Elife. 5, (2016).
- Talbot, J. A., Currie, K. W., Pearson, B. J., Collins, E. M. S. Smed-dynA-1 is a planarian nervous system specific dynamin 1 homolog required for normal locomotion. Biology Open. , 1-8 (2014).
- Currie, K. W., Pearson, B. J. Transcription factors lhx1/5-1 and pitx are required for the maintenance and regeneration of serotonergic neurons in planarians. Development. 140, 3577-3588 (2013).
- Hagstrom, D., et al. Planarian cholinesterase: molecular and functional characterization of an evolutionarily ancient enzyme to study organophosphorus pesticide toxicity. Archives of Toxicology. 92, 1161-1176 (2018).
- Hagstrom, D., Cochet-Escartin, O., Collins, E. M. S. Planarian brain regeneration as a model system for developmental neurotoxicology. Regeneration. 3, 65-77 (2016).
- Hagstrom, D., Cochet-Escartin, O., Zhang, S., Khuu, C., Collins, E. M. S. Freshwater planarians as an alternative animal model for neurotoxicology. Toxicological Sciences. 147, 270-285 (2015).
- Zhang, S., Hagstrom, D., Hayes, P., Graham, A., Collins, E. M. S. Multi-behavioral endpoint testing of an 87-chemical compound library in freshwater planarians. Toxicological Sciences. , 26-44 (2019).
- Zhang, S., Hagstrom, D., Siper, N., Behl, M., Collins, E. M. S. Screening for neurotoxic potential of 15 flame retardants using freshwater planarians. Neurotoxicology and Teratology. 73, 54-66 (2019).
- Wu, J. P., Li, M. H. The use of freshwater planarians in environmental toxicology studies: Advantages and potential. Ecotoxicology and Environmental Safety. 161, 45-56 (2018).
- Rompolas, P., Azimzadeh, J., Marshall, W. F., King, S. M. Analysis of ciliary assembly and function in planaria. Methods in Enzymology. 525, 245-264 (2013).
- Sabry, Z., et al. Pharmacological or genetic targeting of Transient Receptor Potential (TRP) channels can disrupt the planarian escape response. PLoS One. , 753244 (2019).
- Cochet-Escartin, O., Carter, J. A., Chakraverti-Wuerthwein, M., Sinha, J., Collins, E. M. S. Slo1 regulates ethanol-induced scrunching in freshwater planarians. Physical Biology. 13, 1-12 (2016).
- Hagstrom, D., Truong, L., Zhang, S., Tanguay, R. L., Collins, E. M. S., et al. Comparative analysis of zebrafish and planarian model systems for developmental neurotoxicity screens using an 87-compound library. Toxicological Sciences. , (2019).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Akiyama, Y., Agata, K., Inoue, T. Spontaneous Behaviors and Wall-Curvature Lead to Apparent Wall Preference in Planarian. PLoS One. 10, 0142214 (2015).
- Paskin, T. R., Jellies, J., Bacher, J., Beane, W. S. Planarian Phototactic Assay Reveals Differential Behavioral Responses Based on Wavelength. PLoS One. 9, 114708 (2014).
- Petrus, M., et al. A role of TRPA1 in mechanical hyperalgesia is revealed by pharmacological inhibition. Molecular Pain. 3, 40 (2007).
- Takano, T., et al. Regeneration-dependent conditional gene knockdown (Readyknock) in planarian: Demonstration of requirement for Djsnap-25 expression in the brain for negative phototactic behavior. Development, Growth & Differentiation. 49, 383-394 (2007).
- Nishimura, K., et al. Identification of glutamic acid decarboxylase gene and distribution of GABAergic nervous system in the planarian Dugesia japonica. 신경과학. 153, 1103-1114 (2008).
- Inoue, T., Yamashita, T., Agata, K. Thermosensory signaling by TRPM is processed by brain serotonergic neurons to produce planarian thermotaxis. Journal of Neuroscience. 34, 15701-15714 (2014).
