Planarian Scrunching come una lettura comportamentale quantitativa per il rilevamento di stimoli nocivi
Summary
I planari di acqua dolce presentano tre andatri (gli aliante, peristalsi e scrunching) che sono distinguibili dall’analisi comportamentale quantitativa. Descriviamo un metodo per indurre scrunching utilizzando vari stimoli nocivi, quantificazione della stessa, e distinzione da peristalsis e planata. Usando l’abbattimento genico, dimostriamo la specificità dello scrunching come lettura fenotipico quantitativa.
Abstract
I planari d’acqua dolce normalmente scivolano senza problemi attraverso la propulsione ciliaria sul loro lato ventrale. Alcune condizioni ambientali, tuttavia, possono indurre forme di locomozione guidate dalla muscolatura: peristalsis o scrunching. Mentre la peristalsis deriva da un difetto ciliare, lo scrunching è indipendente dalla funzione delle ciglia ed è una risposta specifica a determinati stimoli, tra cui amputazione, temperatura nociva, pH estremo ed etanolo. Così, queste due andature moscentivamente guidate sono meccanicisticamente distinte. Tuttavia, possono essere difficili da distinguere qualitativamente. Qui, forniamo un protocollo per indurre scrunching utilizzando vari stimoli fisici e chimici. Dettagliamo la caratterizzazione quantitativa dello scrunching, che può essere utilizzata per distinguerlo dalla peristalsi e dal planata, utilizzando un software liberamente disponibile. Poiché lo scrunching è un’andatura planaria universale, anche se con differenze caratteristiche specifiche delle specie, questo protocollo può essere ampiamente applicato a tutte le specie di planari, quando si utilizzano considerazioni appropriate. Per dimostrarlo, confrontiamo la risposta delle due specie planariari più popolari utilizzate nella ricerca comportamentale, Dugesia japonica e Schmidtea mediterraneo,con lo stesso insieme di stimoli fisici e chimici. Inoltre, la specificità dello scrunching consente di utilizzare questo protocollo in combinazione con l’interferenza dell’RNA e/o l’esposizione farmacologica per sezionare gli obiettivi molecolari e i circuiti neuronali coinvolti, fornendo potenzialmente informazioni meccanicistiche su importanti aspetti della nocicezione e della comunicazione neuromuscolare.
Introduction
Oltre alla loro popolarità per le cellule staminali e la ricerca dirigenerazione 1,2,3, planarini d’acqua dolce sono stati a lungo utilizzati negli studi comportamentali4,5, sfruttando le loro dimensioni relativamente grandi (pochi millimetri di lunghezza), facilità e basso costo di manutenzione di laboratorio, e ampio spettro di comportamenti osservabili. L’introduzione della visione artificiale e il monitoraggio automatizzato agli studi sul comportamento planaria6,7,8,9,10,11 hanno permesso la differenziazione quantitativa dei fenotipi comportamentali. Il comportamento animale è una lettura diretta della funzione neuronale. Poiché il sistema nervoso planaria è di medie dimensioni e complessità, ma condivide elementi chiave conservati con il cervello vertebrato12,13,14, studiare il comportamento planaria può fornire informazioni sui meccanismi conservati di azione neuronale che possono essere difficili da sondare direttamente in organismi più complessi. Così, i planari sono un modello prezioso per gli studi comparativi di neurobiologia8,12,15,16,17,18,19,20,21. Inoltre, l’ambiente acquatico consente una rapida e facile esposizione alle sostanze chimiche per studiare il loro effetto sulla funzione cerebrale nella rigenerazione e planari adulti, rendendoli un sistema popolare per la neurotossicologia22,23,24,25,26.
I planariani possiedono tre andatte distinte, denominate planata, peristalsis e scrunching. Ogni andatura è esposta in circostanze specifiche: il volo a volo è l’andatura di default, la peristalsi si verifica quando la funzione ciliaria ècompromessa 7,27, e lo scrunching è un’andatura di fuga – indipendente dalla funzione delle ciglia – in risposta a determinati stimoli nocivi7. Abbiamo dimostrato che lo scrunching è una risposta specifica, suscitata dalla sensazione di alcuni segnali chimici o fisici, tra cui temperature estreme o pH, lesioni meccaniche o induttori chimici specifici, e quindi non è una risposta di stressgenerale 7,28,29.
A causa della sua specificità e dei parametri stereotipati, che possono essere facilmente quantificati utilizzando questo protocollo, lo scrunching è un potente fenotipo comportamentale che consente ai ricercatori di eseguire studi meccanicistici che sezionano le vie sensoriali e il controllo neuronale del comportamento25,28. Inoltre, lo scrunching ha dimostrato di essere un endpoint sensibile al saggio effetti chimici negativi sullo sviluppo del sistema nervoso e la funzione negli studi di neurotossicologia22,24,25,30. Come diversi percorsi sensoriali diversi sembrano convergere per indurre scrunching attraverso vari meccanismi28, scrunching differisce da altri comportamenti planarili perché vari, ma specifici, stimoli possono essere utilizzati per sezionare circuiti neuronali distinti e studiare come diversi segnali sono integrati per produrre il fenotipo scrunching.
È importante sottolineare che esistono differenze di specie, in cui una sostanza chimica può suscitare scrunching in una specie planaria, ma una risposta comportamentale diversa in un’altra. Per esempio, abbiamo scoperto che l’anandamide induce scrunching nella specie planaria Dugesia japonica ma induce peristalsis in Schmidtea mediterraneo28. Questo esempio evidenzia l’importanza di essere in grado di distinguere in modo affidabile tra le diverse andatte, perché sono le manifestazioni fenotipiche di meccanismi molecolari distinti. Tuttavia, la distinzione di scrunching da peristalsis è difficile utilizzando dati osservazionali qualitativi, perché entrambe le andature sono muscolatura-driven e condividono somiglianze qualitative7,28. Così, per distinguere le andatte è necessario eseguire l’imaging delle ciglia o uno studio comportamentale quantitativo, che consente la distinzione in base ai parametricaratteriali 7,28. Poiché l’imaging delle ciglia è sperimentalemente impegnativo e richiede attrezzature specializzate come un microscopio composto ad alto ingrandimento e una telecamera ad altavelocità 7,28, non è così ampiamente accessibile ai ricercatori come l’analisi comportamentale quantitativa.
Qui, presentiamo un protocollo per (1) l’induzione di scrunching utilizzando vari stimoli fisici (temperatura nocica, amputazione, luce quasi UV) e chimici (isothiocyanate allyl (AITC), cinnamaldeidede) e (2) l’analisi quantitativa del comportamento planaria utilizzando software liberamente disponibile. Quantificando quattro parametri (frequenza delle oscillazioni della lunghezza del corpo, velocità relativa, ampiezza massima e asimmetria dell’allungamento e della contrazione del corpo)7, lo scrunching può essere differenziato da planare, peristalsis e altri stati comportamentali riportati nella letteratura, come la locomozione simile a unserpente 15 o le epilessie15. Inoltre, mentre lo scrunching è conservato tra le diverse specie planariari7, ogni specie ha la sua frequenza e velocità caratteristica; pertanto, una volta determinate le velocità di planata e di tascafo di una specie, la velocità da sola può essere utilizzata come mezzo per distinguere lo scarsobo passare dal planilo e dalla peristaalsis29. Il protocollo non presuppone alcuna formazione preventiva nell’analisi computazionale delle immagini o negli studi comportamentali e quindi può essere applicato anche per esperimenti comportamentali planariari in un contesto di laboratorio didattico a livello universitario. I dati di esempio per facilitare l’adattamento del protocollo sono forniti nel materiale supplementare.
Protocol
Representative Results
Discussion
Utilizzando questo protocollo, si possono studiare quantitativamente gli effetti degli stimoli fisici e chimici7,28,29 o manipolazione genetica (RNAi)28,29 sulla locomozione planaria. Per massimizzare la risoluzione spaziale, è meglio spostare la fotocamera il più vicino possibile all’arena, assicurandosi che l’intera arena sia nel campo di vista. Per aumentare la velo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano il signor Tapan Goel per i commenti sul manoscritto. Questo lavoro è stato finanziato da NSF CAREER Grant 1555109.
Materials
| Allyl isothiocyanate, 95% (AITC) | Sigma-Aldrich | 377430-5G | CAUTION: Flammable and acutely toxic; handle in a fume hood with appropriate PPE. |
| Camera lens, 2/3 25mm F/1.4 | Tamron | 23FM25SP | |
| Cell culture plates, 6 well, tissue culture treated | Genesee Scientific | 25-105 | |
| Centrifuge tubes, 50 mL polypropylene, sterile | MedSupply Partners | 62-1019-2 | |
| Cinnamaldehyde, >95% | Sigma-Aldrich | W228613-100G-K | |
| Dimmable A4 LED Tracer Light Box | Amazon | B07HD631RP | |
| Flea3 USB3 camera | FLIR | FL3-U3-13E4M | |
| Heat resistant gloves | Fisher Scientific | 11-394-298 | |
| Hot plate | Fisher Scientific | HP88854200 | |
| Instant Ocean Sea Salt, prepared in deionized water | Instant Ocean | SS15-10 | Prepare in deionized water at 0.5 g/L. |
| Montjüic salts, prepared in Milli-Q water | Sigma-Aldrich | various | Prepare in milli-Q water at 1.6 mM NaCl, 1.0 mM CaCl2, 1.0 mM MgSO4, 0.1 mM MgCl2, 0.1 mM KCl, 1.2 mM NaHCO3; adjust pH to 7.0 with HCl. |
| Petri dishes, 100 mm x 20 mm, sterile polystyrene | Simport | D210-7 | |
| Pipette, 20-200 μL range | Rainin | 17008652 | |
| PYREX 150 mL beaker | Sigma-Aldrich | CLS1000150 | |
| Razor blade, 0.22 mm | VWR | 55411-050 | |
| Roscolux color filter: Golden Amber | Rosco | R21 | Alternatively purchase the Roscolux Designer Color Selector (Musson Theatrical product #SBLUX0306) which includes all 3 color filters together. |
| Roscolux color filter: Medium Red | Rosco | R27 | |
| Roscolux color filter: Storaro Red | Rosco | R2001 | |
| Samco transfer pipette, 62 µL large aperture | Thermo Fisher | 691TS | |
| Support stand | Fisher Scientific | 12-947-976 | |
| Thermometer | VWR | 89095-600 | |
| UV laser pointer | Amazon | B082DGS86R | This is a Class II laser (405nm ±10nm) with output power <5 mW. |
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