Scrunching planaire comme une lecture comportementale quantitative pour la détection de stimuli nocifs
Summary
Les planaires d’eau douce présentent trois démarches (glisse, péristalse et scrunching) qui se distinguent par l’analyse comportementale quantitative. Nous décrivons une méthode pour induire le scrunching utilisant divers stimuli nocifs, quantification de celui-ci, et la distinction du péristaltisme et de la glisse. En utilisant le knockdown de gène, nous démontrons la spécificité du scrunching comme lecture phénotypique quantitative.
Abstract
Les planaires d’eau douce glissent normalement en douceur à travers la propulsion ciliaire sur leur côté ventral. Certaines conditions environnementales, cependant, peuvent induire des formes de locomotion axées sur la musculature : péristalse ou scrunching. Tandis que le péristaltisme résulte d’un défaut ciliaire, le scrunching est indépendant de la fonction de cils et est une réponse spécifique à certains stimuli, y compris l’amputation, la température nocive, le pH extrême, et l’éthanol. Ainsi, ces deux démarches musculature-conduites sont mécanistement distinctes. Cependant, ils peuvent être difficiles à distinguer qualitativement. Ici, nous fournissons un protocole pour induire scrunching en utilisant divers stimuli physiques et chimiques. Nous détaillons la caractérisation quantitative du scrunching, qui peut être utilisé pour le distinguer du péristaltisme et du glissement, en utilisant des logiciels librement disponibles. Étant donné que le scrunching est une démarche planaire universelle, bien qu’avec des différences spécifiques aux espèces caractéristiques, ce protocole peut être largement appliqué à toutes les espèces de planaires, lorsqu’il s’agit de prendre des considérations appropriées. Pour le démontrer, nous comparons la réponse des deux espèces planaires les plus populaires utilisées dans la recherche comportementale, Dugesia japonica et Schmidtea mediterranea, au même ensemble de stimuli physiques et chimiques. En outre, la spécificité du scrunching permet à ce protocole d’être utilisé en conjonction avec l’interférence de l’ARN et /ou l’exposition pharmacologique pour disséquer les cibles moléculaires et les circuits neuronaux impliqués, fournissant potentiellement un aperçu mécaniste dans les aspects importants de la nociception et de la communication neuromusculaire.
Introduction
En plus de leur popularité pour les cellules souches et la recherche de régénération1,2,3, planaires d’eau douce ont longtemps été utilisés dans les études comportementales4,5, en profitant de leur taille relativement grande (quelques millimètres de longueur), la facilité et le faible coût de l’entretien de laboratoire, et un large spectre de comportements observables. L’introduction de la vision par ordinateur et du suivi automatisé aux études de comportement planaire6,7,8,9,10,11 ont permis la différenciation quantitative des phénotypes comportementaux. Le comportement animal est une lecture directe de la fonction neuronale. Parce que le système nerveux planaire est de taille moyenne et la complexité, mais partage les éléments clés conservés avec le cerveau vertébré12,13,14, l’étude du comportement planaire peut fournir un aperçu des mécanismes conservés de l’action neuronale qui peut être difficile à sonder directement dans les organismes plus complexes. Ainsi, les planaires sont un modèle précieux pour les études comparatives de neurobiologie8,12,15,16,17,18,19,20,21. En outre, l’environnement aquatique permet une exposition rapide et facile aux produits chimiques pour étudier leur effet sur le fonctionnement du cerveau chez les planaires régénérants et adultes, ce qui en fait un système populaire pour la neurotoxicologie22,23,24,25,26.
Les planaires possèdent trois démarches distinctes, appelées glisse, péristalse et scrunching. Chaque démarche est exposée dans des circonstances spécifiques : le glissement est la démarche par défaut, le péristaltisme se produit lorsque la fonction ciliaire est compromise7,27, et le scrunching est une démarche d’évasion – indépendamment de la fonction de cils – en réponse à certains stimuli nocifs7. Nous avons montré que le scrunching est une réponse spécifique, provoquée par la sensation de certains indices chimiques ou physiques, y compris les températures extrêmes ou le pH, les blessures mécaniques, ou des inducteurs chimiques spécifiques, et n’est donc pas une réponse générale de stress7,28,29.
En raison de sa spécificité et de ses paramètres stéréotypés, qui peuvent facilement être quantifiés à l’aide de ce protocole, le scrunching est un phénotype comportemental puissant qui permet aux chercheurs d’effectuer des études mécanistes disséquant les voies sensorielles et le contrôle neuronal du comportement25,28. En outre, le scrunching s’est avéré être un critère d’évaluation sensible aux effets chimiques indésirables de l’essai sur le développement du système nerveux et la fonction dans les études de neurotoxicologie22,24,25,30. Comme plusieurs voies sensorielles différentes semblent converger pour induire scrunching à travers divers mécanismes28, scrunching diffère des autres comportements planaires parce que divers, mais spécifiques, stimuli peuvent être utilisés pour disséquer des circuits neuronaux distincts et d’étudier comment différents signaux sont intégrés pour produire le phénotype scrunching.
Fait important, il existe des différences d’espèces, dans lesquelles un produit chimique peut provoquer des scrunching dans une espèce planaire, mais une réponse comportementale différente dans une autre. Par exemple, nous avons constaté que l’anandamide induit scrunching dans l’espèce planaire Dugesia japonica mais induit le péristaltisme dans Schmidtea mediterranea28. Cet exemple souligne l’importance de pouvoir distinguer de manière fiable les différentes démarches, parce qu’elles sont les manifestations phénotypiques de mécanismes moléculaires distincts. Cependant, la distinction entre le scrunching du péristaltisme est difficile à l’aide de données d’observation qualitatives, parce que les deux démarches sont axées sur la musculature et partagent des similitudes qualitatives7,28. Ainsi, pour distinguer les démarches, il est nécessaire d’effectuer l’imagerie cilia ou une étude comportementale quantitative, qui permet la distinction basée sur les paramètres caractéristiques7,28. Parce que l’imagerie par cils est expérimentalement difficile et nécessite un équipement spécialisé comme un microscope composé à grossissement élevé et une caméra à grande vitesse7,28, il n’est pas aussi largement accessible aux chercheurs que l’analyse comportementale quantitative.
Ici, nous présentons un protocole pour (1) l’induction de scrunching en utilisant divers stimuli physiques (température nocive, amputation, lumière quasi-UV) et chimiques (allol isothiocyanate (AITC), stimuli cinnamaldéhyde) et (2) l’analyse quantitative du comportement planaire à l’aide de logiciels librement disponibles. En quantifiant quatre paramètres (fréquence des oscillations de longueur du corps, vitesse relative, amplitude maximale, et asymétrie de l’élongation et de la contraction du corps)7,le scrunching peut être différencié de la glisse, du péristaltisme, et d’autres états comportementaux rapportés dans la littérature, tels que la locomotionde serpent-comme 15 ou les épilepsies15. En outre, tandis que le scrunching est conservé entre les différentes espèces planaires7, chaque espèce a sa propre fréquence caractéristique et la vitesse; par conséquent, une fois que les vitesses de glisse et de scrunching d’une espèce ont été déterminées, la vitesse seule peut être utilisée comme un moyen de distinguer le scrunching de la glisse et du péristalse29. Le protocole suppose qu’aucune formation préalable en analyse d’image computationnelle ou en études comportementales et peut donc également être appliqué pour des expériences comportementales planaires dans un contexte de laboratoire d’enseignement au premier cycle. Des exemples de données pour faciliter l’adaptation du protocole sont fournies dans le matériel supplémentaire.
Protocol
Representative Results
Discussion
En utilisant ce protocole, on peut étudier quantitativement les effets des stimuli physiques et chimiques7,28,29 ou manipulation génétique (RNAi)28,29 sur la locomotion planaire. Pour maximiser la résolution spatiale, il est préférable de déplacer la caméra aussi près que possible de l’arène tout en s’assurant que l’ensemble de l’arène est dans le cham…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient M. Tapan Goel pour les commentaires sur le manuscrit. Ce travail a été financé par NSF CAREER Grant 1555109.
Materials
| Allyl isothiocyanate, 95% (AITC) | Sigma-Aldrich | 377430-5G | CAUTION: Flammable and acutely toxic; handle in a fume hood with appropriate PPE. |
| Camera lens, 2/3 25mm F/1.4 | Tamron | 23FM25SP | |
| Cell culture plates, 6 well, tissue culture treated | Genesee Scientific | 25-105 | |
| Centrifuge tubes, 50 mL polypropylene, sterile | MedSupply Partners | 62-1019-2 | |
| Cinnamaldehyde, >95% | Sigma-Aldrich | W228613-100G-K | |
| Dimmable A4 LED Tracer Light Box | Amazon | B07HD631RP | |
| Flea3 USB3 camera | FLIR | FL3-U3-13E4M | |
| Heat resistant gloves | Fisher Scientific | 11-394-298 | |
| Hot plate | Fisher Scientific | HP88854200 | |
| Instant Ocean Sea Salt, prepared in deionized water | Instant Ocean | SS15-10 | Prepare in deionized water at 0.5 g/L. |
| Montjüic salts, prepared in Milli-Q water | Sigma-Aldrich | various | Prepare in milli-Q water at 1.6 mM NaCl, 1.0 mM CaCl2, 1.0 mM MgSO4, 0.1 mM MgCl2, 0.1 mM KCl, 1.2 mM NaHCO3; adjust pH to 7.0 with HCl. |
| Petri dishes, 100 mm x 20 mm, sterile polystyrene | Simport | D210-7 | |
| Pipette, 20-200 μL range | Rainin | 17008652 | |
| PYREX 150 mL beaker | Sigma-Aldrich | CLS1000150 | |
| Razor blade, 0.22 mm | VWR | 55411-050 | |
| Roscolux color filter: Golden Amber | Rosco | R21 | Alternatively purchase the Roscolux Designer Color Selector (Musson Theatrical product #SBLUX0306) which includes all 3 color filters together. |
| Roscolux color filter: Medium Red | Rosco | R27 | |
| Roscolux color filter: Storaro Red | Rosco | R2001 | |
| Samco transfer pipette, 62 µL large aperture | Thermo Fisher | 691TS | |
| Support stand | Fisher Scientific | 12-947-976 | |
| Thermometer | VWR | 89095-600 | |
| UV laser pointer | Amazon | B082DGS86R | This is a Class II laser (405nm ±10nm) with output power <5 mW. |
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