Isolement des cellules CD8+ T résidentes du rein de souris pour l’analyse de cytométrie de flux

Summary

Suite à une infection virale, le rein abrite un nombre relativement important de cellules CD8⁺ T et offre la possibilité d’étudier les lymphocytes T_RM non muqueux. Ici, nous décrivons un protocole pour isoler les lymphocytes rénaux de souris pour l’analyse de cytométrie de flux.

Abstract

La cellule T de mémoire de tissu-résident_(RMT)est un domaine rapidement croissant de recherche d’immunologie. Isoler les lymphocytes T de divers tissus non lymphoïdes est l’une des étapes clés pour étudier les_RMT. Il existe de légères variations dans les protocoles d’isolement des lymphocytes pour différents organes. Le rein est un organe non lymphoïde essentiel avec de nombreuses infiltrations de cellules immunitaires, surtout après l’exposition aux pathogènes ou l’activation auto-immune. Ces dernières années, plusieurs laboratoires, y compris le nôtre ont commencé à caractériser les cellules CD8 + T^{résidentes rénales} dans divers milieux physiologiques et pathologiques chez la souris et chez l’homme. En raison de l’abondance des lymphocytes T, le rein représente un organe modèle attrayant pour étudier_{les RMT}dans les tissus non muqueux ou non-barrière. Ici, nous allons décrire un protocole couramment utilisé dans les laboratoires axés_surla RM T pour isoler les cellules CD8⁺ T des reins de souris à la suite d’une infection virale systémique. En bref, à l’aide d’un modèle aigu d’infection par le virus de la chorioméningite lymphocytique (LCMV) chez les souris C57BL/6, nous démontrons l’étiquetage intravasculaire des lymphocytes CD8⁺ T, la digestion enzymatique et la centrifugation du gradient de densité pour isoler et enrichir les lymphocytes des reins de souris afin de préparer les échantillons à l’analyse subséquente de la cytométrie du débit.

Introduction

Les cellules T de mémoire tissulaire_(RMT)représentent l’une des populations de cellules T les plus abondantes chez les souris humaines adultes et infectées. Les_{cellules T RM} fournissent la première ligne de défense immunitaire et sont impliquées de façon critique dans divers processus physiologiques et pathologiques^1,2,3,4,5. En comparaison avec les cellules T circulant, les cellules T_RM portent des marqueurs de surface distincts avec des programmes de transcription uniques^6,7,8. L’élargissement de nos connaissances_{en biologie de la} RMT est la clé pour comprendre les réponses des cellules T, ce qui est essentiel au développement futur de vaccins et d’immunothérapies à base de cellules T.

En plus des marqueurs moléculaires couramment partagés de T_RMdans tous les tissus non lymphoïdes, l’accumulation de preuves suggère que les dispositifs tissulaires spécifiques sont un composant central de la_{biologie de} RM⁹de T. Rein abrite de nombreuses cellules immunitaires, y compris_{les cellules} RM T après l’infection et offre une excellente occasion d’étudier la biologie_{des cellules} RM T dans un tissu non muqueux. L’infection aiguë de LCMV (virus lymphocytique de choriomeningitis) par voie intraperitoneal est un modèle systémique bien établi d’infection pour étudier des réponses antigène-spécifiques de cellule T chez les souris. L’infection est généralement résolue en 7-10 jours chez les souris de type sauvage et laisser un grand nombre de cellules T mémoire spécifiques au LCMV dans une variété de tissus, y compris le rein¹⁰. Les souris transgéniques P14 TCR (récepteur des lymphocytes T) portent des lymphocytes CD8⁺ T reconnaissent l’un des épitopes immuno-dominants du LCMV présentés par la molécule H2-D B de la molécule H2-D^de classe I (complexe d’histocompatibilité majeure de classe I) chez les souris C57BL/6. Combinant le transfert adoptif de cellule T de P14 agréablement marqué et l’infection de LCMV chez les souris, CD8 + effecteur^et cellules de T de mémoire sont suivis, y compris la différenciation et l’homéostasie de RM de T.

Dans certains tissus de barrière, tels que le compartiment intraepithelial intestinal de lymphocytes (IEL) et les glandes salivaires, la procédure établie d’isolement de lymphocyte donne le pourcentage élevé des_{cellules de} RM de T avec la contamination minimale de cellule T par sang dans le modèle¹¹de souris de LCMV. Cependant, dans les tissus non barrière, tels que le rein, le réseau vasculaire dense contient un grand nombre de cellules CD8⁺ T circulant. Il a été bien documenté que même la perfusion réussie ne peut pas supprimer efficacement toutes les cellules CD8⁺ T en circulation. Pour surmonter cet obstacle technique, la coloration intravasculaire d’anticorps a été établie comme l’une des techniques les plus couramment employées dans les_{laboratoires de} RM de T^12. En bref, 3-5 minutes avant l’euthanasie, 3 anticorps anti-CD8 μg/souris (pour étiqueter les lymphocytes CD8⁺ T) sont livrés par voie intraveineuse. La paroi intacte des vaisseaux sanguins empêche la diffusion rapide de l’anticorps dans ce court laps de temps (c.-à-d. 3-5 minutes) et seules les cellules intravasculaires sont étiquetées. Suivant le protocole standard d’isolement de lymphocyte, les cellules intravasculaires contre extravascular peuvent être facilement distinguées utilisant la cytométrie de flux.

Ici, nous allons décrire un protocole standard couramment utilisé dans les laboratoires T_RM pour effectuer l’étiquetage intravasculaire, l’isolement des lymphocytes et l’analyse de cytométrie du flux des cellules rénales CD8⁺ T à l’aide d’une souris C57BL/6 qui a reçu des lymphocytes T CD45.1⁺ P14 et l’infection par le LCMV 30 jours^{avant 13}. Le même protocole peut être utilisé pour étudier à la fois les cellules T effectrices et de mémoire dans le rein.

Protocol

Toutes les expériences sur les animaux réalisées à la suite de ce protocole doivent être approuvées par le Comité institutionnel respectif de soins et d’utilisation des animaux (IACUC). Toutes les procédures décrites ici ont été approuvées par IACUC UT Health San Antonio. 1. Transfert adoptif des cellules T P14 dans les receveurs de C57BL/6 et infection par le LCMV Utilisez des souris P14 à l’âge de 6 à 12 semaines. Assurez-vous que le sexe de la souris transgéniq…

Representative Results

Le protocole décrit ici est résumé dans un diagramme de flux (Figure 1A). Au jour 30 infection de poteau de LCMV, nous avons exécuté l’étiquetage intravasculaire des cellules CD8+ T. 5 minutes plus tard, les deux reins de l’animal ont été disséqués, hachés finement et soumis à la digestion des collagènes. Les lymphocytes ont été purifiés à partir des échantillons digérés par centrifugation percoll et analysés par cytométrie d’écoulement. Comme le montr…

Discussion

Comme l’immunité spécifique aux tissus est un domaine de recherche en expansion rapide, l’accumulation de preuves suggère que les cellules immunitaires, en particulier la population de lymphocytes peuvent être identifiés dans presque tous les organes chez les souris adultes humaines ou infectées ou immunisées. Le modèle d’infection de souris de LCMV est un modèle bien établi pour étudier la réponse de cellule T antigène-spécifique, l’effecteur et la différenciation de cellule T de mémoire comprena…

Materials

1.5 ml microcentrifuge tubes	Fisherbrand	05-408-130
15 ml Conical Tubes	Corning	431470
3 ml syringe	BD	309657
37C incubator	VWR
Biotin a-CD8a antibody(Clone 53-6.7)	Tonbo Biosciences	30-0081-U025
Calf Serum	GE Healthcare Life Sciences	SH30073.03
Collegenase B	Millipore Sigma	11088807001
Disposable Graduated Transfer Pipettes	Fisherbrand	13-711-9AM
Insulin Syringe	BD	329424
Micro Dissecting Spring Scissors	Roboz Surgical	RS 5692
Mojosort Mouse CD8 Naïve T Cells Isolation Kit	Biolegend	480043
overhead heat lamp	Amazon	B00333PZZG
PBS
Percoll	GE Healthcare Life Sciences	17089101
rocker	VWR
RPMI	GE Healthcare Life Sciences	SH30096.01
Solid Brass Mouse Restrainer	Braintree Scientific, Inc	SAI-MBR
Swing Bucket Centrifuge with refrigerator	Thermofisher
Tissue Culture 6-well plate	Corning	3516