Aislamiento de células CD8 + T residentes en el riñón delratón para el análisis de citometría de flujo
Summary
Después de la infección viral, el riñón alberga un número relativamente grande de células CD8+ T y ofrece la oportunidad de estudiar las células TRM no mucosas. Aquí, describimos un protocolo para aislar linfocitos renales de ratón para el análisis de citometría de flujo.
Abstract
La célula T de memoria residente en el tejido (TRM)es un campo de investigación inmunológica en rápida expansión. Aislar las células T de varios tejidos no linfoides es uno de los pasos clave para investigar TRM. Hay ligeras variaciones en los protocolos de aislamiento de linfocitos para diferentes órganos. El riñón es un órgano no linfoide esencial con numerosas infiltraciones de células inmunitarias, especialmente después de la exposición al patógeno o la activación autoinmune. En los últimos años, múltiples laboratorios incluyendo el nuestro han comenzado a caracterizar células CD8+ T residentes en riñón en varios entornos fisiológicos y patológicos tanto en ratones como en humanos. Debido a la abundancia de linfocitos T, el riñón representa un órgano modelo atractivo para estudiar TRMen tejidos no-mucosas o no barreras. Aquí, describiremos un protocolo comúnmente utilizado en laboratorios centrados en TRMpara aislar células CD8+ T de los riñones del ratón después de una infección viral sistémica. Brevemente, utilizando un modelo de infección por el virus de la coriomeningitis linfocítica aguda (LCMV) en ratones C57BL/6, demostramos el etiquetado intravascular de células CD8+ T, la digestión enzimática y la centrifugación de gradiente de densidad para aislar y enriquecer linfocitos de los riñones de ratón para hacer muestras listas para el análisis posterior de citometría de flujo.
Introduction
Los células T de memoria residente en tejidos (TRM)representan una de las poblaciones de células T más abundantes en ratones humanos e infectados adultos. Las células TRM proporcionan la primera línea de defensa inmune y están implicadas críticamente en diversos procesos fisiológicos y patológicos1,2,3,4,5. En comparación con las células T circulantes, las células TRM llevan marcadores de superficie distintos con programas de transcripción únicos6,7,8. Ampliar nuestro conocimiento de la biología TRM es la clave para entender las respuestas de los células T, que es esencial para el desarrollo futuro de vacunas basadas en células T e inmunoterapias.
Además de los marcadores moleculares comúnmente compartidos de TRMen todos los tejidos no linfoides, la acumulación de evidencia sugiere que las características específicas del tejido son un componente central de la biología TRM 9. El riñón alberga muchas células inmunitarias, incluidas las células TRM después de la infección, y ofrece una gran oportunidad para estudiar la biología de las células TRM en un tejido no mucoso. La infección por LCMV aguda (virus de la coriomeningitis linfocítica) a través de la vía intraperitoneal es un modelo de infección sistémica bien establecido para estudiar las respuestas de células T específicas del antígeno en ratones. La infección generalmente se resuelve en 7-10 días en ratones de tipo salvaje y dejar un gran número de células T de memoria específicas de LCMV en una variedad de tejidos, incluyendo el riñón10. Los ratones transgénicos P14 TCR (receptor de células T) llevan células CD8+ T que reconocen uno de los epítopos inmuno-dominantes de LCMV presentado por MHC-I (complejo de histocompatibilidad mayor clase I) molécula H2-Db en ratones C57BL/6. Se realiza un seguimiento de la combinación de la transferencia adoptiva de células T P14 marcadas congenicalmente e infección por LCMV en ratones, efector CD8+ y células T de memoria, incluyendo la diferenciación TRM y homeostasis.
En algunos tejidos de barrera, como los linfocitos intraepiteliales intestinales (IEL) compartimento y las glándulas salivales, el procedimiento de aislamiento de linfocitos establecido produce un alto porcentaje de células TRM con contaminación mínima de los linfocitos T de carga sanguínea en el lcMV de ratón modelo11. Sin embargo, en los tejidos no barrera, como el riñón, la red vascular densa contiene un gran número de células CD8+ T circulantes. Se ha documentado bien que incluso la perfusión exitosa no puede eliminar eficientemente todas las células CD8+ T circulantes. Para superar este obstáculo técnico, la tinción de anticuerpos intravasculares se ha establecido como una de las técnicas más utilizadas en los laboratorios TRM 12. En resumen, 3-5 minutos antes de la eutanasia, 3 g/ratón anticuerpo anti-CD8 (para etiquetar CD8+ células T) se administra por vía intravenosa. La pared intacta de los vasos sanguíneos evita la rápida difusión del anticuerpo en este corto período de tiempo (es decir, 3-5 minutos) y solo se etiquetan las células intravasculares. Siguiendo el protocolo de aislamiento de linfocitos estándar, las células intravasculares versus extravasculares se pueden distinguir fácilmente mediante citometría de flujo.
Aquí, describiremos un protocolo estándar comúnmente utilizado en los laboratorios TRM para realizar el etiquetado intravascular, el aislamiento de linfocitos y el análisis de citometría de flujo de células renales CD8+ T utilizando un ratón C57BL/6 que ha recibido células CD45.1+ P14 T e infección de LCMV 30 días antesde 13. El mismo protocolo se puede utilizar para estudiar las células T de efector y memoria en el riñón.
Protocol
Representative Results
Discussion
Como la inmunidad específica del tejido es un área de investigación en rápida expansión, la acumulación de evidencia sugiere que las células inmunitarias, especialmente la población de linfocitos, se pueden identificar en casi todos los órganos en ratones humanos adultos o infectados o inmunizados. LcMV modelo de infección de ratón es un modelo bien establecido para estudiar la respuesta de células T específicas del antígeno, efector y la diferenciación de células T de memoria incluyendo la biología T<su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo es apoyado por las subvenciones de LOS NIH AI125701 y AI139721, el programa CLIP del Instituto de Investigación del Cáncer y la Sociedad Americana del Cáncer otorgan RSG-18-222-01-LIB a N.Z. Agradecemos a Karla Gorena y Sebastian Montagnino de Flow Cytometry Facility. Los datos generados en el Centro de Recursos Compartidos de Citometría de Flujo fueron apoyados por el Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Texas en San Antonio (UTHSCSA), la subvención NIH/NCI P30 CA054174-20 (Centro de Investigación Clínica y Traslacional [CTRC] en UTHSCSA), y UL1 TR001120 (Premio de Ciencias Clínicas y Traslacionales).
Materials
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisherbrand | 05-408-130 | |
| 15 ml Conical Tubes | Corning | 431470 | |
| 3 ml syringe | BD | 309657 | |
| 37C incubator | VWR | ||
| Biotin a-CD8a antibody(Clone 53-6.7) | Tonbo Biosciences | 30-0081-U025 | |
| Calf Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30073.03 | |
| Collegenase B | Millipore Sigma | 11088807001 | |
| Disposable Graduated Transfer Pipettes | Fisherbrand | 13-711-9AM | |
| Insulin Syringe | BD | 329424 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz Surgical | RS 5692 | |
| Mojosort Mouse CD8 Naïve T Cells Isolation Kit | Biolegend | 480043 | |
| overhead heat lamp | Amazon | B00333PZZG | |
| PBS | |||
| Percoll | GE Healthcare Life Sciences | 17089101 | |
| rocker | VWR | ||
| RPMI | GE Healthcare Life Sciences | SH30096.01 | |
| Solid Brass Mouse Restrainer | Braintree Scientific, Inc | SAI-MBR | |
| Swing Bucket Centrifuge with refrigerator | Thermofisher | ||
| Tissue Culture 6-well plate | Corning | 3516 |
References
- Mueller, S. N., Gebhardt, T., Carbone, F. R., Heath, W. R. Memory T cell subsets, migration patterns, and tissue residence. Annual Review of Immunology. 31, 137-161 (2013).
- Mueller, S. N., Mackay, L. K. Tissue-resident memory T cells: local specialists in immune defence. Nature Reviews: Immunology. 16, 79-89 (2016).
- Park, C. O., Kupper, T. S. The emerging role of resident memory T cells in protective immunity and inflammatory disease. Nature Medicine. 21, 688-697 (2015).
- Schenkel, J. M., et al. T cell memory. Resident memory CD8 T cells trigger protective innate and adaptive immune responses. Science. 346, 98-101 (2014).
- Thome, J. J., Farber, D. L. Emerging concepts in tissue-resident T cells: lessons from humans. Trends in Immunology. 36, 428-435 (2015).
- Mackay, L. K., et al. Hobit and Blimp1 instruct a universal transcriptional program of tissue residency in lymphocytes. Science. 352, 459-463 (2016).
- Mackay, L. K., et al. T-box Transcription Factors Combine with the Cytokines TGF-beta and IL-15 to Control Tissue-Resident Memory T Cell Fate. Immunity. 43, 1101-1111 (2015).
- Milner, J. J., et al. Runx3 programs CD8(+) T cell residency in non-lymphoid tissues and tumours. Nature. 552, 253-257 (2017).
- Liu, Y., Ma, C., Zhang, N. Tissue-Specific Control of Tissue-Resident Memory T Cells. Critical Reviews in Immunology. 38, 79-103 (2018).
- Steinert, E. M., et al. Quantifying Memory CD8 T Cells Reveals Regionalization of Immunosurveillance. Cell. 161, 737-749 (2015).
- Qiu, Z., Sheridan, B. S. Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System. Journal of Visualized Experiments. (132), e57281 (2018).
- Anderson, K. G., et al. Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes. Nature Protocols. 9, 209-222 (2014).
- Ma, C., Mishra, S., Demel, E. L., Liu, Y., Zhang, N. TGF-beta Controls the Formation of Kidney-Resident T Cells via Promoting Effector T Cell Extravasation. Journal of Immunology. 198, 749-756 (2017).
- Gebhardt, T., et al. Different patterns of peripheral migration by memory CD4+ and CD8+ T cells. Nature. 477, 216-219 (2011).
- Borges da Silva, H., Wang, H., Qian, L. J., Hogquist, K. A., Jameson, S. C. ARTC2.2/P2RX7 Signaling during Cell Isolation Distorts Function and Quantification of Tissue-Resident CD8(+) T Cell and Invariant NKT Subsets. Journal of Immunology. 202, 2153-2163 (2019).
- Fernandez-Ruiz, D., et al. Liver-Resident Memory CD8(+) T Cells Form a Front-Line Defense against Malaria Liver-Stage Infection. Immunity. 45, 889-902 (2016).
- Beura, L. K., et al. Normalizing the environment recapitulates adult human immune traits in laboratory mice. Nature. 532, 512-516 (2016).
