유동 세포 분석용 마우스 신장 거주자 CD8+ T 세포의 격리
Summary
바이러스 감염에 이어 신장은 비교적 많은 수의 CD8+ T 세포를 수용하고 비 점막 TRM 세포를 연구할 기회를 제공합니다. 여기서는 유동 세포측정 분석을 위해 마우스 신장 림프구를 분리하는 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
조직-주민 기억 T 세포 (TRM)는면역학 연구의 급속하게 확장 분야입니다. 다양한 비 림프구 조직에서 T 세포를 격리하는 것은 TRMs를 조사하는 주요 단계 중 하나입니다. 다른 장기에 대한 림프구 절연 프로토콜에는 약간의 변화가 있습니다. 신장은 병원체 노출 또는 자가 면역 활성화 후에 특히 수많은 면역 세포 침투를 가진 필수적인 비 림프구 기관입니다. 최근 몇 년 동안, 우리 자신의 여러 실험실은 마우스와 인간 모두에서 다양한 생리 및 병리학 적 설정에서 신장 거주자 CD8+ T 세포를 특성화하기 시작했다. T 림프구의 풍부로 인해 신장은 비 점막 또는 비 장벽 조직에서 TRMs를 연구하는 매력적인 모델 기관을 나타냅니다. 여기에서, 우리는 전신 바이러스성 감염 다음 마우스 신장에서 CD8+ T 세포를 격리하기 위하여 TRM집중한 실험실에서 일반적으로 이용되는 프로토콜을 설명할 것입니다. 간략하게, C57BL/6 마우스에서 급성 림프구성 초리오메닌염 바이러스(LCMV) 감염 모델을 사용하여, 마우스 신장에서 림프구를 분리하고 농축하기 위해 마우스 신장에서 림프구를 분리하고 농축하는 진래성 CD8+ T 세포 라벨링, 밀도 그라데이션 원심을 시연하여 후속 사이클분석을 위한 시료를 준비하고 있다.
Introduction
조직-상주 기억(TRM)T 세포는 성인 인간 및 감염된 마우스에서 가장 풍부한 T 세포 집단 중 하나를 나타낸다. TRM 세포는 면역 방어의 첫 번째 라인을 제공하고 다양한 생리학적 및 병리학적과정에 비판적으로관여1,2,3,4,5. 순환 T 세포와 비교하여 TRM 세포는 고유한 전사 프로그램6,7,8을가진 뚜렷한 표면마커를운반한다. TRM 생물학에 대한 지식을 확장하는 것은 T 세포 기반 백신 및 면역 요법의 미래 발달에 필수적인 T 세포 반응을 이해하는 열쇠입니다.
모든 비 림프구 조직에 걸쳐 TRMs의일반적으로 공유 분자 마커 이외에, 축적 증거는 조직 특정 특징이 TRM 생물학9의중앙 구성 요소임을 시사한다. 신장은 감염 후에 TRM 세포를 포함하여 많은 면역 세포를 항구하고 비 점막 조직에서 TRM 세포 생물학을 공부하는 좋은 기회를 제공합니다. 급성 LCMV(림프구성 초뇌염 바이러스) 감염은 관면 경로를 통한 잘 확립된 조직 감염 모델로 마우스에서 항원 특이적 T 세포 반응을 연구한다. 감염은 일반적으로 야생 형 마우스에서 7-10 일 이내에 해결되고 신장10을포함한 다양한 조직에서 많은 수의 LCMV 특이적 메모리 T 세포를 남깁니다. P14 TCR(T 세포 수용체) 형질전환 마우스는 C57BL/6 마우스에서 MHC-I(클래스 I 주요 조직적합성 복합체) 분자 H2-Db에 의해 제시된 LCMV의 면역 지배적 인 에피토프 중 하나를 인식CD8+ T 세포를 운반한다. 쥐에서 친자적으로 표시된 P14 T 세포 입양 전달 및 LCMV 감염을 결합하면 CD8+ 이펙터 및 메모리 T 세포가 TRM 분화 및 항상성을 포함하여 추적됩니다.
장 내 상피 림프구(IEL) 구획 및 침샘과 같은 일부 장벽 조직에서는, 확립된 림프구 절연 절차는 마우스 LCMV모델(11)에서혈액 매개 T 세포 오염을 최소화한 TRM 세포의 높은 비율을 산출한다. 그러나 신장과 같은 비장벽 조직에서 조밀한 혈관 망에는 많은 수의 순환 CD8+ T 세포가 포함되어 있습니다. 성공적인 관류조차도 모든 순환 CD8+ T 세포를 효율적으로 제거할 수 없다는 것이 잘 문서화되어 있습니다. 이러한 기술적 장애물을 극복하기 위해, 내트라바스 항체 염색은 TRM 실험실(12)에서가장 일반적으로 사용되는 기술 중 하나로 확립되었다. 잠시, 안락사 전에 3-5 분, 3 μg /마우스 안티 CD8 항체 (CD8+ T 세포를 레이블) 정맥으로 전달된다. 그대로 혈관 벽은 시간의 이 짧은 기간 (즉, 3-5 분) 안에 항체의 급속한 확산을 방지하고 단지 내트라바스 내 세포가 표지됩니다. 표준 림프구 절연 프로토콜에 따라, 비대 혈관 세포대 는 유동 세포 세포를 사용하여 쉽게 구별될 수 있다.
여기서, 우리는13일전에 CD45.1+ P14 T 세포 및 LCMV 감염을 받은 C57BL/6 마우스를 사용하여 신장 CD8+ T 세포의 신장CD8+ T 세포의 내트라바스 내 라벨링, 림프구 절연 및 유동 세포 측정 분석을 수행하기 위해 TRM 실험실에서 일반적으로 사용되는 표준 프로토콜을 설명할 것이다. 동일한 프로토콜은 신장에 있는 이펙터 및 메모리 T 세포를 둘 다 연구하기 위하여 이용될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
조직 특정 면역은 연구의 급속한 확장 영역으로, 축적 증거는 면역 세포, 특히 림프구 인구성인 인간 또는 감염 또는 예방 접종 마우스에 거의 모든 기관에서 식별 될 수 있음을 시사한다. LCMV 마우스 감염 모델은 여러 조직에 걸쳐 TRM 생물학을 포함하는 항원 특이적 T 세포 반응, 이펙터 및 메모리 T 세포 분화를 연구하는 잘 확립된 모델이다. 여기서, 우리는 신장에 있는 CD8+ T 세포?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NIH 보조금 AI125701 및 AI139721, 암 연구소 클립 프로그램 및 미국 암 학회는 N.Z에 RSG-18-222-01-LIB를 부여하여 지원됩니다. 플로우 세포측정 시설에서 카를라 고레나와 세바스찬 몬타그니노에게 감사드립니다. 플로우 세포측정 공유 자원 시설에서 생성된 데이터는 샌안토니오 텍사스 대학교 건강 과학 센터(UTHSCSA), NIH/NCI 보조금 P30 CA054174-20(UTHSCSA의 임상 및 번역 연구 센터 [CTRC] 및 UL1 TR001120(임상 및 번역 과학 상)에 의해 지원되었습니다.
Materials
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisherbrand | 05-408-130 | |
| 15 ml Conical Tubes | Corning | 431470 | |
| 3 ml syringe | BD | 309657 | |
| 37C incubator | VWR | ||
| Biotin a-CD8a antibody(Clone 53-6.7) | Tonbo Biosciences | 30-0081-U025 | |
| Calf Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30073.03 | |
| Collegenase B | Millipore Sigma | 11088807001 | |
| Disposable Graduated Transfer Pipettes | Fisherbrand | 13-711-9AM | |
| Insulin Syringe | BD | 329424 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz Surgical | RS 5692 | |
| Mojosort Mouse CD8 Naïve T Cells Isolation Kit | Biolegend | 480043 | |
| overhead heat lamp | Amazon | B00333PZZG | |
| PBS | |||
| Percoll | GE Healthcare Life Sciences | 17089101 | |
| rocker | VWR | ||
| RPMI | GE Healthcare Life Sciences | SH30096.01 | |
| Solid Brass Mouse Restrainer | Braintree Scientific, Inc | SAI-MBR | |
| Swing Bucket Centrifuge with refrigerator | Thermofisher | ||
| Tissue Culture 6-well plate | Corning | 3516 |
References
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