تدفق توصيف القياسات الخلوية من مورين B تطوير الخلية
Summary
نحن نصف هنا تحليلا بسيطا تجانس مقصورة الخلية B المناعية مورين في أنسجة الصفاق والطحال ونخاع العظام عن طريق قياس التدفق الخلوي. يمكن تكييف البروتوكول وتوسيعه ليشمل أنسجة الماوس الأخرى.
Abstract
وقد ميزت دراسات مستفيضة تطور وتمايز خلايا مورين B في الأعضاء اللمفاوية الثانوية. تم عزل الأجسام المضادة التي تفرزها الخلايا B وتطويرها إلى علاجات راسخة. التحقق من صحة تطور خلايا مورين B ، في سياق الفئران المعرضة للمناعة الذاتية ، أو في الفئران ذات الجهاز المناعي المعدل ، هو عنصر حاسم في تطوير أو اختبار العوامل العلاجية في الفئران وهو استخدام مناسب لقياس التدفق الخلوي. يمكن استخدام المعلمات الخلوية الراسخة لتدفق الخلايا B لتقييم تطور الخلية B في الصفاق المورين ونخاع العظام والطحال ، ولكن يجب الالتزام بعدد من أفضل الممارسات. بالإضافة إلى ذلك، ينبغي أن يكمل التحليل الخلوي التدفقي لمقصورات الخلية B قراءات إضافية لتطوير الخلية B. البيانات التي تم إنشاؤها باستخدام هذه التقنية يمكن أن تعزز فهمنا للنوع البري ، ونماذج الماوس المعرضة لل المناعة الذاتية وكذلك الفئران المؤنسة التي يمكن استخدامها لتوليد الأجسام المضادة أو الجزيئات الشبيهة بالأجسام المضادة كعلاجات.
Introduction
أصبحت الأجسام المضادة أحادية النسيلة على نحو متزايد العلاج الاختياري للعديد من الأمراض البشرية لأنها تصبح جزءا من الطب السائد1،2. لقد سبق لنا أن وصف الفئران المعدلة وراثيا التي تنتج بكفاءة الأجسام المضادة التي تؤوي مناطق متغيرة بشرية بالكامل مع ثوابت IgH الماوس3،4. في الآونة الأخيرة ، وصفنا الفئران المعدلة وراثيا التي تنتج جزيئات تشبه الأجسام المضادة التي لها مستضد ملزم متميز5. وتفرز الأجسام المضادة من قبل الخلايا B وتشكل أساس الحصانة الفكاهية التكيفية. هناك نوعان متميزان من الخلايا B، B-1 و B-2. في الثدييات ، تنشأ خلايا B-1 في كبد الجنين وتثري في الأنسجة المخاطية والتجاويف الجنبية والبريتونية بعد الولادة ، في حين تنشأ خلايا B-2 في كبد الجنين قبل الولادة وبعد ذلك في نخاع العظام (BM). يتم إثراء خلايا B-2 في الأعضاء اللمفاوية الثانوية بما في ذلك الطحال والدم6,7,8. في BM، يبدأ السلف الدموي B-2 في التفريق إلى الخلايا الموالية ل B عند بدء إعادة ترتيب سلسلة Ig mu الثقيلة9,10. إعادة ترتيب ناجحة من سلسلة Ig الثقيلة وتجميعها في مستقبلات الخلية ما قبل B (قبل BCR)، جنبا إلى جنب مع الإشارات والتوسع التكاثري، يؤدي إلى التمايز إلى خلايا ما قبل B. بعد خلايا ما قبل B إعادة ترتيب كابا Ig (Igκ)، أو إذا كانت غير منتجة، Ig lambda (Igλ) سلاسل الضوء، فإنها زوج مع μ سلسلة ثقيلة، مما أدى إلى التعبير السطحي IgM BCR. من المهم الإشارة إلى أن التعبير السطحي IgM معروف بأنه ينخفض في ظل ظروف النشاط التلقائي ، مما يساهم في تحمل الذات في الخلايا B غير المستجيبة وظيفيا أو التحسسية 11،12. ثم تدخل الخلايا B غير الناضجة مرحلة انتقالية ، حيث تبدأ في التعبير المشترك عن IgD والهجرة من BM إلى الطحال. في الطحال ، يزيد تعبير IgD أكثر وتنضج الخلايا إلى مرحلة ثانية من الخلايا B الانتقالية ، يليها الانتهاء من حالة نضجها وتطورها إلى إما منطقة هامشية (MZ) أو خلايا الجريبية (Fol) 13،14،15. في الفئران البالغة ، في بيئة غير مريضة ، لا يزال عدد الخلايا B الناضجة ثابتا على الرغم من توليد 10-20 مليون خلية B غير ناضجة يوميا في BM. من هذه، ثلاثة في المئة فقط تدخل بركة من الخلايا B ناضجة. حجم مقصورة الخلية الطرفية B مقيد بموت الخلية، ويرجع ذلك جزئيا إلى عدة عوامل بما في ذلك التفاعل الذاتي والنضج غير المكتمل16,17,18. وقد استخدم تحليل التدفق الخلوي على نطاق واسع لتوصيف وعدد العديد من المقصورات الفرعية للخلايا المناعية في البشر والفئران. في حين أن هناك بعض أوجه التشابه بين الإنسان ومقصورات الخلية B مورين، ينطبق هذا البروتوكول فقط على تحليل خلايا مورين B. تم تطوير هذا البروتوكول بهدف كتابة الفئران المعدلة وراثيا ، لتحديد ما إذا كان التلاعب الجيني سيغير تطور الخلية B. كما كان قياس التدفق الخلوي شائعا بشكل كبير في العديد من التطبيقات الإضافية ، بما في ذلك في قياس تنشيط الخلية ، والوظيفة ، والانتشار ، وتحليل الدورة ، وتحليل محتوى الحمض النووي ، وموت الخلايا المبرمج وفرز الخلايا 1920.
قياس التدفق الخلوي هو الأداة المفضلة لتوصيف مختلف مقصورات الخلايا الليمفاوية في الفئران والبشر ، بما في ذلك في الأعضاء المعقدة مثل الطحال ، BM والدم. نظرا لواشف الأجسام المضادة الخاصة بالماوس المتاحة على نطاق واسع لقياس التدفق الخلوي ، يمكن استخدام هذه التقنية للتحقيق ليس فقط في البروتينات السطحية للخلايا ولكن أيضا البروتينات الدهنية داخل الخلايا والسيتوكينات ، وكذلك readouts21 الوظيفية. هنا نحن نبين كيف يمكن استخدام كاشفات قياس التدفق الخلوي لتحديد المجموعات الفرعية للخلايا B عند نضجها والتمييز في الأعضاء اللمفاوية الثانوية. بعد التحسين الأمثل لظروف تلطيخ، والتعامل مع العينات، وإعداد الصك الصحيح والحصول على البيانات، وأخيرا تحليل البيانات، يمكن استخدام بروتوكول لتحليل التدفق الخلوي الشامل لمقصورة الخلية B في الفئران. ويستند هذا التحليل الشامل على تسمية عقود من العمر وضعت من قبل هاردي وزملاؤه، حيث يمكن تقسيم تطوير خلايا BM B-2 إلى كسور مختلفة (كسر) اعتمادا على تعبيرهم عن B220، CD43، BP-1، CD24، IgM وIgD22. هاردي وآخرون، أظهرت أن B220 + CD43 BM B الخلايا يمكن تقسيمها إلى أربع مجموعات فرعية (كسر A-C’) على أساس BP-1 و CD24 (30F1) التعبير، في حين B220+ CD43-(dim to neg) BM B الخلايا يمكن حلها في ثلاث مجموعات فرعية (كسر D-F) على أساس التعبير التفاضلي من IgD وسطح IgM23. يتم تعريف الكسر A (خلايا ما قبل pro-B) على أنه BP-1– CD24 (30F1)–، يتم تعريف الكسر B (الخلايا المؤيدة ل B المبكرة) على أنه BP-1– CD24 (30F1)+، ويتم تعريف الكسر C (الخلايا المتأخرة المؤيدة ل B) على أنه BP-1+ CD24 (30F1)+، ويتم تعريف الكسر C (خلايا ما قبل B المبكرة) على أنه BP-1+ وCD24high. وعلاوة على ذلك، يتم تعريف الكسر D (خلايا ما قبل B) على أنه خلايا B220+ CD43– IgM-B، ويتم تعريف الكسر E (الخلايا B التي تم إنشاؤها حديثا، والجمع بين الخلايا غير الناضجة والانتقالية) على أنه خلايا B220+ CD43– IgM+ B والكسر F (الخلايا B الناضجة المعاد تدويرها) على أنها خلايا B220high CD43– IgM+ B. في المقابل، يمكن تقسيم غالبية الخلايا B السذاجة الموجودة في الطحال إلى خلايا B ناضجة (B220+ CD93–) وخلايا انتقالية (T1، T2، T3) اعتمادا على التعبير عن CD93 و CD23 و IgM. يمكن حل الخلايا B الناضجة إلى مناطق هامشية ومجموعات فرعية جريبية استنادا إلى التعبير عن IgM و CD21/CD35 ، ويمكن تقسيم المجموعات الفرعية الجريبية إلى نوع جريبي ناضج I ومجموعات فرعية من النوع B الجريبي اعتمادا على مستوى التعبير السطحي IgM و IgD24. هذه المجموعات الخلية B splenic التعبير عن سلسلة الضوء في الغالب Igκ. وأخيرا، تم وصف مجموعات خلايا B-1 B، التي تنشأ في كبد الجنين وتوجد بشكل رئيسي في التجاويف الصفاقية والجنبية للفئران البالغة، في الأدبيات. يمكن تمييز هذه الخلايا البريتونية B من الخلايا B-2 B الموصوفة سابقا بسبب افتقارها إلى تعبير CD23. ثم يتم تقسيمها إلى مجموعات B-1a أو B-1b ، مع تعريف الأول بوجود CD5 والثاني بغيابه25. سلفات الخلايا B-1 وفيرة في كبد الجنين، ولكن لا توجد في BM الكبار. في حين أن خلايا B-1a و B-1b تنشأ من أسلاف مختلفين ، إلا أنهما تزرعان التسوس البريتوني والبليبي24. وعلى النقيض من خلايا B-2، فإن خلايا B-1 قادرة بشكل فريد على التجديد الذاتي ومسؤولة عن إنتاج الأجسام المضادة الطبيعية IgM.
يمكن أن تنشأ عيوب في تطور الخلية B في كثير من الحالات، بما في ذلك أوجه القصور في مكونات BCR26،27، اضطرابات جزيئات الإشارات التي تؤثر على BCR قوة الإشارة14،28،29، أو تعطيل السيتوكينات التي تعدل بقاء الخلية B30،31 . وقد ساهم تحليل تدفق قياس الخلايا من مقصورات اللمفاوية في توصيف كتل تطوير الخلية B في هذه الفئران وغيرها الكثير. ميزة واحدة من تحليل تدفق الخلايا من مقصورات اللمفاوية هو أنه يوفر القدرة على إجراء قياسات على الخلايا الفردية التي تم الحصول عليها من الأنسجة الحية منفصلة. ويتيح توافر الكواشف في نطاق متوسع من الفلوروفوريس إجراء تحليل متزامن لمعلمات متعددة ويمكن من تقييم عدم تجانس الخلايا باء. وعلاوة على ذلك، فإن تعداد الخلايا B عن طريق تحليل التدفق الخلوي يكمل المقايسات المناعية الأخرى مثل أساليب الكيمياء المناعية التي تصور توطين الخلايا داخل الأعضاء اللمفاوية، والكشف عن مستويات الأجسام المضادة المتداولة كمقياس للمناعة الفكاهية، فضلا عن اثنين من المجهر الفوتون لقياس استجابات الخلية B في المكان الحقيقي والوقت32.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد مكن تحليل التدفق الخلوي للأنسجة اللمفاوية وغير اللمفاوية من تحديد تعداد الخلايا B الفرعية في الفئران والبشر في وقت واحد منذ ثمانينيات القرن العشرين. وقد استخدم كمقياس للحصانة الفكاهية ويمكن تطبيقه كذلك لتقييم وظائف الخلية B. تستفيد هذه الطريقة من توافر الكاشف لتقييم المراحل المختلفة …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر ماثيو سليمان على قراءته النقدية للمخطوطة. كما نشكر أقسام عمليات Vivarium و Flow Cytometry Core في ريجينرون لدعمها هذا البحث.
Materials
| 0.5 mL safe-lock Eppendorf tubes | Eppendorf | 22363611 | 0.5 mL microcentrifuge tube |
| 1.5mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 22364111 | 1.5 mL microcentrifuge tube |
| 15 mL Falcon tubes | Corning | 352097 | 15 mL conical tube |
| 18 gauge needle | BD | 305196 | |
| 25 gauge needle | BD | 305124 | |
| 3 mL syringe | BD | 309657 | |
| 70 mM MACS SmartStrainer | Miltenyi Biotec | 130-110-916 | 70 mM cell strainer |
| 96 well U bottom plate | VWR | 10861-564 | |
| ACK lysis buffer | GIBCO | A1049201 | red blood cell lysis buffer |
| Acroprep Advance 96 Well Filter Plate | Pall Corporation | 8027 | filter plate |
| B220 | eBiosciences | 17-0452-82 | |
| BD CompBead Anti-Mouse Ig/κ | BD | 552843 | compensation beads |
| BD CompBead Anti-Rat Ig/κ | BD | 552844 | compensation beads |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A8577 | BSA |
| BP-1 | BD | 740882 | |
| Brilliant Stain Buffer | BD | 566349 | brilliant stain buffer |
| C-Kit | BD | 564011 | |
| CD11b | BD | 563168 | |
| CD11b | BioLegend | 101222 | |
| CD19 | BD | 560143 | |
| CD21/35 | BD | 562756 | |
| CD23 | BD | 740216 | |
| CD24 (HSA) | BioLegend | 138504 | |
| CD3 | BD | 561388 | |
| CD3 | BioLegend | 100214 | |
| CD43 | BD | 553270 | |
| CD43 | BioLegend | 121206 | |
| CD5 | BD | 563194 | |
| CD93 | BD | 740750 | |
| CD93 | BioLegend | 136504 | |
| DPBS (1x) | ThermoFisher | 14190-144 | DPBS |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 506 | ThermoFisher | 65-0866-14 | viability dye |
| Extended Fine Tip Transfer Pipette | Samco | 233 | disposable transfer pipette |
| FACSymphony A3 flow cytometer | BD | custom order | flow cytometer |
| Fc Block, CD16/CD32 (2.4G2) | BD | 553142 | Fc block |
| FlowJo | Flowjo | flow cytometer analysis software | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | automated dissociation tube |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-095-937 | tissue dissociator instrument |
| GR1 (Ly6C/6G) | BioLegend | 108422 | |
| IgD | BioLegend | 405710 | |
| IgM | eBiosciences | 25-5790-82 | |
| Kappa | BD | 550003 | |
| Lambda | BioLegend | 407308 | |
| paraformaldehyde, 32% Solution | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| Ter119 | BioLegend | 116220 | |
| True-Stain Monocyte Blocker | BioLegend | 426103 | monocyte blocker |
| UltraPure EDTA, pH 8.0 | ThermoFisher | 15575038 | EDTA |
| Vi-CELL XR | Beckman Coulter | 731050 | cell counter instrument |
References
- Shepard, H. M., Philips, G. L., Thanos, D., Feldman, M. Developments in therapy with monoclonal antibodies and related proteins. Clinical Medicine. 17 (3), 220 (2017).
- Ecker, D. M., Jones, S. D., Levine, H. L. The therapeutic monoclonal antibody market. MAbs. 7 (1), 9-14 (2015).
- Macdonald, L. E., et al. Precise and in situ genetic humanization of 6 Mb of mouse immunoglobulin genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (14), 5147-5152 (2014).
- Murphy, A. J., et al. Mice with megabase humanization of their immunoglobulin genes generate antibodies as efficiently as normal mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (14), 5153-5158 (2014).
- Macdonald, L. E., et al. Kappa-on-Heavy (KoH) bodies are a distinct class of fully-human antibody-like therapeutic agents with antigen-binding properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 292-299 (2020).
- Pieper, K., Grimbacher, B., Eibel, H. B-cell biology and development. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 131 (4), 959-971 (2013).
- Nagasawa, T. Microenvironmental niches in the bone marrow required for B-cell development. Nature Reviews: Immunology. 6 (2), 107-116 (2006).
- Lund, F. E. Cytokine-producing B lymphocytes-key regulators of immunity. Current Opinion in Immunology. 20 (3), 332-338 (2008).
- Martensson, I. L., Keenan, R. A., Licence, S. The pre-B-cell receptor. Current Opinion in Immunology. 19 (2), 137-142 (2007).
- von Boehmer, H., Melchers, F. Checkpoints in lymphocyte development and autoimmune disease. Nature Immunology. 11 (1), 14-20 (2010).
- Goodnow, C. C., et al. Altered immunoglobulin expression and functional silencing of self-reactive B lymphocytes in transgenic mice. Nature. 334 (6184), 676-682 (1988).
- Zikherman, J., Parameswaran, R., Weiss, A. Endogenous antigen tunes the responsiveness of naive B cells but not T cells. Nature. 489 (7414), 160-164 (2012).
- Melchers, F. Checkpoints that control B cell development. Journal of Clinical Investigation. 125 (6), 2203-2210 (2015).
- Henderson, R. B., et al. A novel Rac-dependent checkpoint in B cell development controls entry into the splenic white pulp and cell survival. Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 837-853 (2010).
- Pillai, S., Cariappa, A. The follicular versus marginal zone B lymphocyte cell fate decision. Nature Reviews: Immunology. 9 (11), 767-777 (2009).
- Shahaf, G., Zisman-Rozen, S., Benhamou, D., Melamed, D., Mehr, R. B. Cell Development in the Bone Marrow Is Regulated by Homeostatic Feedback Exerted by Mature B Cells. Frontiers in Immunology. 7, 77 (2016).
- Nemazee, D. Mechanisms of central tolerance for B cells. Nature Reviews: Immunology. 17 (5), 281-294 (2017).
- Petkau, G., Turner, M. Signalling circuits that direct early B-cell development. Biochemical Journal. 476 (5), 769-778 (2019).
- McKinnon, K. M. Flow Cytometry: An Overview. Current Protocols in Immunology. 120, 1-5 (2018).
- Betters, D. M. Use of Flow Cytometry in Clinical Practice. Journal of the Advanced Practioner in Oncology. 6 (5), 435-440 (2015).
- Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project. Nature Reviews: Immunology. 12 (3), 191-200 (2012).
- Van Epps, H. L. Bringing order to early B cell chaos. Journal of Experimental Medicine. 203 (6), 1389 (2006).
- Hardy, R. R., Carmack, C. E., Shinton, S. A., Kemp, J. D., Hayakawa, K. Resolution and characterization of pro-B and pre-pro-B cell stages in normal mouse bone marrow. Journal of Experimental Medicine. 173 (5), 1213-1225 (1991).
- Allman, D., Pillai, S. Peripheral B cell subsets. Current Opinion in Immunology. 20 (2), 149-157 (2008).
- Shapiro-Shelef, M., Calame, K. Regulation of plasma-cell development. Nature Reviews: Immunology. 5 (3), 230-242 (2005).
- Kitamura, D., Roes, J., Kuhn, R., Rajewsky, K. A B cell-deficient mouse by targeted disruption of the membrane exon of the immunoglobulin mu chain gene. Nature. 350 (6317), 423-426 (1991).
- Keenan, R. A., et al. Censoring of autoreactive B cell development by the pre-B cell receptor. Science. 321 (5889), 696-699 (2008).
- Chan, V. W., Meng, F., Soriano, P., DeFranco, A. L., Lowell, C. A. Characterization of the B lymphocyte populations in Lyn-deficient mice and the role of Lyn in signal initiation and down-regulation. Immunity. 7 (1), 69-81 (1997).
- Zikherman, J., Doan, K., Parameswaran, R., Raschke, W., Weiss, A. Quantitative differences in CD45 expression unmask functions for CD45 in B-cell development, tolerance, and survival. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (1), 3-12 (2012).
- Miyamoto, A., et al. Increased proliferation of B cells and auto-immunity in mice lacking protein kinase Cdelta. Nature. 416 (6883), 865-869 (2002).
- Mecklenbrauker, I., Kalled, S. L., Leitges, M., Mackay, F., Tarakhovsky, A. Regulation of B-cell survival by BAFF-dependent PKCdelta-mediated nuclear signalling. Nature. 431 (7007), 456-461 (2004).
- Okada, T., et al. Antigen-engaged B cells undergo chemotaxis toward the T zone and form motile conjugates with helper T cells. PLoS Biology. 3 (6), 150 (2005).
- Robinson, J. P. Flow Cytometry. Encyclopedia of Biomaterials and Biomedical Engineering. , 630-640 (2004).
- Lugli, E., Roederer, M., Cossarizza, A. Data analysis in flow cytometry: the future just started. Cytometry A. 77 (7), 705-713 (2010).
- Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies. European Journal of Immunology. 47 (10), 1584 (2017).
- Bigos, M. Separation index: an easy-to-use metric for evaluation of different configurations on the same flow cytometer. Current Protocols in Cytometry. , 21 (2007).
- Pillai, S., Mattoo, H., Cariappa, A. B. B cells and autoimmunity. Current Opinion in Immunology. 23 (6), 721-731 (2011).
