뮤린 B 세포 발달의 유동 세포 측정 특성화
Summary
본 명세서에 의한 복막, 비장 및 골수 조직에서 뮤린 면역 B 세포 구획의 이질성에 대한 간단한 분석을 설명한다. 프로토콜을 다른 마우스 조직으로 조정하고 확장할 수 있습니다.
Abstract
광범위한 연구는 이차 림프구 기관에서 뮤린 B 세포의 개발 및 분화를 특징으로합니다. B 세포에 의해 분비된 항체는 고립되고 잘 확립된 치료제로 개발되었습니다. murine B 세포 발달의 검증은 자가 면역 경향이 마우스의 맥락에서, 또는 수정된 면역 계통을 가진 마우스에서, 마우스에 있는 치료에이전트를 개발하거나 시험하는 중요한 분대이고 유동 세포측정의 적당한 사용입니다. 잘 확립된 B 세포 흐름 세포 계발성 파라미터는 뮤린 복막, 골수 및 비장의 B 세포 발달을 평가하는 데 사용될 수 있지만, 다수의 모범 사례를 준수해야 한다. 또한, B 세포 구획의 유동 세포 측정 분석은 또한 B 세포 발달의 추가 판독을 보완해야 한다. 이 기술을 사용하여 생성된 데이터는 항체 또는 항체 와 같은 분자를 치료제로 생성하는 데 사용할 수 있는 인간화된 마우스뿐만 아니라 야생 유형, 자가 면역 경향이 마우스 모델뿐만 아니라 인간화된 마우스에 대한 우리의 이해를 더욱 발전시킬 수 있습니다.
Introduction
단일 클론 항체는 주류 의학의 일부가됨에 따라 점점 많은 인간 질환에 대한 선택 요법이되고있다1,2. 우리는 이전에 마우스 IgH constants3,4를 가진 완전히 인간 변수 지역을 항구하는 항체를 능동하게 생성하는 유전자 조작 마우스를 기술했습니다 3,4. 가장 최근에, 우리는 뚜렷한 항원 결합5가 있는 항체 같이 분자를 생성하는 유전자 조작한 마우스를 기술했습니다5. 항체는 B 세포에 의해 분비되고 적응성 유머 면역의 기초를 형성합니다. B 세포, B-1 및 B-2의 2개의 명백한 모형이 있습니다. 포유동물에서 B-1 세포는 태아 간에서 유래하고 출생 후 점막 조직및 흉막 및 복막 구멍에서 풍부하게 되며, B-2 세포는 출생 전 과 그 이후 골수 (BM)에서 태아 간에서 유래한다. B-2 세포는 비장 과 혈액6,7,8을 포함하여 이차 림프성 기관에서 농축된다. BM에서, B-2 조혈 선조는 Ig mu 무거운 사슬 재배열9,10의 개시에 프로 B 세포를 분화하기 시작합니다. Ig 중형 사슬과 조립을 사전 B세포 수용체(pre-BCR)로 성공적으로 재배열하여 시그널링 및 증식 확장과 함께 사전 B 세포로 분화합니다. 사전 B 세포가 Ig kappa(Igθ)를 재배열하거나 비생산적인 경우 Ig lambda(Igλ) 광 사슬을 재배열한 후 μ 무거운 사슬과 결합하여 표면 IgM BCR 발현이 발생합니다. IgM 표면 발현은 자가 반응성 조건하에서 감소되는 것으로 알려져 있으며, 따라서 기능적으로 반응성이 없거나 식욕 부진 B cells11,12에서 자기 허용오차에 기여하는 것이 중요하다. 미숙한 B 세포는 전환 단계에 들어가서 IgD를 공동 발현하고 BM에서 비장으로 이동합니다. 비장에서, IgD 발현은 더 증가하고 세포는 과도기 B 세포의 두 번째 단계로 성숙하고, 그들의 성숙 상태 및 한계 영역 (MZ) 또는 여포 (Fol) 세포로 의 발달의 완료에 선행됩니다13,14,15. 성인 마우스에서, 비병 환경에서, 성숙한 B 세포의 수는 BM에서 매일 생성되고 10-20000,000,000미성숙 B 세포에도 불구하고 일정하게 남아 있습니다. 이 중 3%만이 성숙한 B 세포의 풀을 입력합니다. 말초 B 세포 구획의 크기는 세포 사멸에 의해 제한되며, 부분적으로자가 반응성 및 불완전한 성숙을 포함한 여러 가지 요인으로 인해 16,17,18. 유동 세포 측정 분석은 인간과 마우스에 있는 많은 면역 세포 하위 구획을 특성화하고 예매하기 위하여 광범위하게 이용되었습니다. 인간과 뮤린 B 세포 구획 사이에 는 몇 가지 유사점이 있지만,이 프로토콜은 뮤린 B 세포의 분석에만 적용됩니다. 이 프로토콜은 유전자 조작이 B 세포 발달을 바꿀 지 여부를 결정하기 위해 유전자 조작 된 마우스를 phenotyping의 목적으로 개발되었습니다. 유동 세포측정은 또한 세포 활성화, 기능, 증식, 사이클 분석, DNA 함량 분석, 세포 분석, 세포 분류 19,20을 측정하는 등 많은 추가 응용 분야에서 큰 인기를 끌고 있다.
유동 세포측정은 비장, BM 및 혈액과 같은 복잡한 장기를 포함하여 마우스와 인간에서 다양한 림프구 구획을 특성화하는 데 선택하는 도구입니다. 유세포측정을 위한 마우스 특이적 항체 시약으로 인해, 이 기술은 세포 표면 단백질뿐만 아니라 세포내 인포단백질 및 사이토카인뿐만 아니라 기능적인 readouts21을 조사하는 데 사용될 수 있다. 본명 우리는 이차 림프구 기관에서 성숙하고 분화할 때 B 세포 하위 집합을 식별하는 데 어떻게 유동 세포 측정 시약을 사용할 수 있는지 보여줍니다. 염색 조건, 시료 처리, 올바른 계측기 설정 및 데이터 수집, 마지막으로 데이터 분석의 최적화 후, 마우스내 B 세포 구획의 포괄적인 유량 세포 측정 분석을 위한 프로토콜을 활용할 수 있다. 이러한 포괄적인 분석은 BM B-2 세포를 개발하는 것이 B220, CD43, BP-1, CD24, IgM 및 IgD22의 발현에 따라 다른 분획 (분수)으로 나눌 수 있는 하디와 동료에 의해 고안된 수십 년 된 명명율을 기반으로 합니다. Hardy 등., B220+ CD43 BM B 세포가 BP-1 및 CD24(30F1) 발현을 기준으로 4개의 하위 집합(분수 A-C’)으로 세분화될 수 있는 반면, B220+ CD43-(dim to neg) BM B 셀은 이그3의 상이한 발현을 기반으로 3개의 하위 집합(분수 D-F)으로 해결할 수 있음을 보여주었다. 분수 A(pre-pro-B 세포)는 BP-1-CD24(30F1)–분수 B(초기 프로-B 셀)로 정의되며, 분수 C(초기 프로-B 셀)는 BP-1+ CD24(30F1)++, 및 분수 C(초기 BP-1)로 정의된다. 또한, 분수 D(사전 B 셀)는 B220+ CD43-IgM-B 세포로 정의되며, 분수 E(새로 생성된 B 셀, 미숙한 및 과도기의 조합)는 B220+ CD43-IgM+ B 세포 및 분수 F(성숙하고 재순환하는 B 셀)로 정의됩니다. 대조적으로, 비장에서 발견되는 순진한 B 세포의 대부분은 CD93, CD23 및 IgM의 발현에 따라 성숙한 (B220+ CD93–) B 세포 및 과도기 (T1, T2, T3) 세포로 나눌 수 있다. 성숙한 B 세포는 IgM 및 CD21/CD35의 발현에 기초하여 한계 영역 및 여포 서브세트로 해결될 수 있으며, 여포 서브세트는 그들의 IgM 및 IgD 표면 발현의 수준에 따라 성숙한 여포 타입 I 및 여포형 II B 세포 서브셋으로 더 나눌 수 있다24. 이러한 비장 B 세포 인구는 주로 Igθ 광 사슬을 표현합니다. 마지막으로, 태아 간에서 유래하고 성인 마우스의 복막 및 흉막 구멍에서 주로 발견되는 B-1 B 세포 인구는 문헌에 설명되어 있다. 이러한 회막 B 세포는 CD23 발현의 부족에 의해 이전에 설명된 B-2 B 세포와 구별될 수 있다. 그(것)들은 그 후에 B-1a 또는 B-1b 인구로 더 세분화됩니다, 전자는 CD5의 존재에 의해 정의되고 그것의 부재25에 의해 후자에 의해 정의됩니다. B-1 세포 선조는 태아 간에서 풍부하지만 성인 BM에서는 발견되지 않습니다. B-1a 및 B-1b 세포는 다른 선조에서 유래하는 동안, 둘 다 복막과 흉막 충치를 시드24. B-2 세포와는 달리, B-1 세포는 자기 재생이 유일하게 가능하고 천연 IgM 항체의 생산을 담당합니다.
B 세포 발달의 결함은 BCR26,27의 성분에 있는 결핍, BCR 신호 강도에 영향을 미치는 신호 분자의 동요 14,28,29, 또는 B 세포 생존을 조절하는 사이토카인의 중단을 포함하여 많은 경우에 생길 수 있습니다30,31 . 림프구의 유동 세포 분석은 이들 마우스 및 많은 다른 사람들의 B 세포 발달 블록의 특성화에 기여했다. 림프구의 유동 세포 분석의 한 가지 장점은 살아있는 해리 된 조직에서 얻은 개별 세포에 대한 측정을 할 수있는 능력을 제공한다는 것입니다. 형광의 계속 확장 범위에서 시약의 가용성은 다중 매개 변수의 동시 분석을 허용하고 B 세포 이질성의 평가를 가능하게한다. 더욱이, 유동 세포측정 분석에 의한 B 세포의 열거는 림프구 기관 내에서 세포 국소화를 시각화하는 면역조직화학 방법, 유머 면역의 척도로서 순환 항체 수준을 검출하는 면역학적 분석, 그리고 실제 공간과 시간 32에서 B 세포 반응을 측정하는 2개의 광자 현미경 검사법과 같은 다른 면역학적 분석을 보완한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
림프및 비 림프구 조직의 흐름 세포 분석은 1980 년대 이후 마우스와 인간에서 B 세포 하위 집단의 동시 식별 및 열거를 가능하게했다. 그것은 유머 면역의 척도로 사용되었으며 B 세포 기능을 평가하기 위해 더 적용 할 수 있습니다. 이 방법은 희귀 한 집단에서도 B 세포 이질성의 평가를 가능하게하는 다중 매개 변수의 동시 분석을 통해 마우스와 인간에서 B 세포 성숙의 다른 단계를 평가하기 위해…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
원고를 비판적으로 읽어주신 매튜 슬리먼에게 감사드립니다. 우리는 또한 이 연구를 지원해 준 Regeneron의 Vivarium 운영 및 플로우 세포측정 핵심 부서에 감사드립니다.
Materials
| 0.5 mL safe-lock Eppendorf tubes | Eppendorf | 22363611 | 0.5 mL microcentrifuge tube |
| 1.5mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 22364111 | 1.5 mL microcentrifuge tube |
| 15 mL Falcon tubes | Corning | 352097 | 15 mL conical tube |
| 18 gauge needle | BD | 305196 | |
| 25 gauge needle | BD | 305124 | |
| 3 mL syringe | BD | 309657 | |
| 70 mM MACS SmartStrainer | Miltenyi Biotec | 130-110-916 | 70 mM cell strainer |
| 96 well U bottom plate | VWR | 10861-564 | |
| ACK lysis buffer | GIBCO | A1049201 | red blood cell lysis buffer |
| Acroprep Advance 96 Well Filter Plate | Pall Corporation | 8027 | filter plate |
| B220 | eBiosciences | 17-0452-82 | |
| BD CompBead Anti-Mouse Ig/κ | BD | 552843 | compensation beads |
| BD CompBead Anti-Rat Ig/κ | BD | 552844 | compensation beads |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A8577 | BSA |
| BP-1 | BD | 740882 | |
| Brilliant Stain Buffer | BD | 566349 | brilliant stain buffer |
| C-Kit | BD | 564011 | |
| CD11b | BD | 563168 | |
| CD11b | BioLegend | 101222 | |
| CD19 | BD | 560143 | |
| CD21/35 | BD | 562756 | |
| CD23 | BD | 740216 | |
| CD24 (HSA) | BioLegend | 138504 | |
| CD3 | BD | 561388 | |
| CD3 | BioLegend | 100214 | |
| CD43 | BD | 553270 | |
| CD43 | BioLegend | 121206 | |
| CD5 | BD | 563194 | |
| CD93 | BD | 740750 | |
| CD93 | BioLegend | 136504 | |
| DPBS (1x) | ThermoFisher | 14190-144 | DPBS |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 506 | ThermoFisher | 65-0866-14 | viability dye |
| Extended Fine Tip Transfer Pipette | Samco | 233 | disposable transfer pipette |
| FACSymphony A3 flow cytometer | BD | custom order | flow cytometer |
| Fc Block, CD16/CD32 (2.4G2) | BD | 553142 | Fc block |
| FlowJo | Flowjo | flow cytometer analysis software | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | automated dissociation tube |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-095-937 | tissue dissociator instrument |
| GR1 (Ly6C/6G) | BioLegend | 108422 | |
| IgD | BioLegend | 405710 | |
| IgM | eBiosciences | 25-5790-82 | |
| Kappa | BD | 550003 | |
| Lambda | BioLegend | 407308 | |
| paraformaldehyde, 32% Solution | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| Ter119 | BioLegend | 116220 | |
| True-Stain Monocyte Blocker | BioLegend | 426103 | monocyte blocker |
| UltraPure EDTA, pH 8.0 | ThermoFisher | 15575038 | EDTA |
| Vi-CELL XR | Beckman Coulter | 731050 | cell counter instrument |
References
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