Durchflusszytometrische Charakterisierung der Entwicklung von Murinen B-Zellen
Summary
Wir beschreiben hierin eine einfache Analyse der Heterogenität des murinen Immun-B-Zell-Kompartiments im Peritoneum-, Milz- und Knochenmarkgewebe mittels Durchflusszytometrie. Das Protokoll kann angepasst und auf andere Mausgewebe ausgedehnt werden.
Abstract
Umfangreiche Studien haben die Entwicklung und Differenzierung von murinen B-Zellen in sekundären lymphatischen Organen charakterisiert. Antikörper, die von B-Zellen sezerniert werden, wurden isoliert und zu etablierten Therapeutika weiterentwickelt. Die Validierung der Entwicklung von murinen B-Zellen im Zusammenhang mit autoimmunanfälligen Mäusen oder bei Mäusen mit verändertem Immunsystem ist ein entscheidender Bestandteil der Entwicklung oder Erprobung von Therapeutika bei Mäusen und eine geeignete Anwendung der Durchflusszytometrie. Gut etablierte zytometrische Parameter des B-Zell-Flusses können verwendet werden, um die B-Zell-Entwicklung im murinen Peritoneum, Knochenmark und Milz zu bewerten, aber eine Reihe von Best Practices müssen eingehalten werden. Darüber hinaus sollte die durchflusszytometrische Analyse von B-Zell-Kompartimenten auch zusätzliche Ablesungen der B-Zell-Entwicklung ergänzen. Daten, die mit dieser Technik generiert werden, können unser Verständnis von wildtypischen, autoimmunanfälligen Mausmodellen sowie humanisierten Mäusen verbessern, die zur Erzeugung von Antikörpern oder antikörperähnlichen Molekülen als Therapeutika verwendet werden können.
Introduction
Monoklonale Antikörper sind zunehmend zur bevorzugten Therapie für viele menschliche Krankheiten geworden, da sie Teil der Schulmedizin werden1,2. Wir haben zuvor gentechnisch veränderte Mäuse beschrieben, die effizient Antikörper produzieren, die vollständig menschliche variable Regionen mit Maus-IgH-Konstanten beherbergen3,4. Zuletzt haben wir gentechnisch veränderte Mäuse beschrieben, die antikörperähnliche Moleküle produzieren, die eine ausgeprägte Antigenbindung aufweisen5. Antikörper werden von B-Zellen sezerniert und bilden die Grundlage der adaptiven humoralen Immunität. Es gibt zwei verschiedene Arten von B-Zellen, B-1 und B-2. Bei Säugetieren stammen B-1-Zellen aus der fetalen Leber und sind nach der Geburt im Schleimhautgewebe und in der Pleura- und Peritonealhöhle angereichert, während B-2-Zellen vor der Geburt in der fetalen Leber und danach im Knochenmark (BM) entstehen. B-2-Zellen sind in sekundären lymphatischen Organen einschließlich Milz und Blut angereichert6,7,8. In der BM beginnen B-2 hämatopoetische Vorläuferzellen mit der Initiierung der Ig mu schweren Kettenumlagerung zu Pro-B-Zellen zu differenzieren9,10. Die erfolgreiche Umlagerung der schweren Ig-Kette und ihre Montage in den Prä-B-Zell-Rezeptor (Pre-BCR) führt zusammen mit der Signalgebung und proliferativen Expansion zu einer Differenzierung zu Prä-B-Zellen. Nachdem Prä-B-Zellen ihre Ig kappa (Igκ) oder, wenn unproduktiv, Ig lambda (Igλ) leichten Ketten neu angeordnet haben, paaren sie sich mit μ schweren Kette, was zu einer Oberflächen-IgM-BCR-Expression führt. Es ist wichtig darauf hinzuweisen, dass bekannt ist, dass die IgM-Oberflächenexpression unter Bedingungen der Autoreaktivität reduziert wird, was zur Selbsttoleranz in funktionell nicht reagierenden oder anergen B-Zellen beiträgt11,12. Unreife B-Zellen treten dann in ein Übergangsstadium ein, in dem sie beginnen, IgD mitzuexprimieren und vom BM in die Milz zu wandern. In der Milz nimmt die IgD-Expression weiter zu und die Zellen reifen zu einem zweiten Stadium von Übergangs-B-Zellen heran, gefolgt von der Vollendung ihres Reifungsstatus und der Entwicklung zu entweder marginalen Zonen( MZ) oder follikulären (Fol) Zellen13,14,15. Bei erwachsenen Mäusen bleibt die Anzahl der reifen B-Zellen in einer nicht erkrankten Umgebung konstant, obwohl täglich 10-20 Millionen unreife B-Zellen im BM erzeugt werden. Davon gelangen nur drei Prozent in den Pool der reifen B-Zellen. Die Größe des peripheren B-Zell-Kompartiments wird durch den Zelltod eingeschränkt, was zum Teil auf mehrere Faktoren zurückzuführen ist, darunter Selbstreaktivität und unvollständige Reifung16,17,18. Die durchflusszytometrische Analyse wurde umfassend eingesetzt, um viele Immunzellunterkompartimente bei Menschen und Mäusen zu charakterisieren und aufzuzählen. Während es einige Ähnlichkeiten zwischen menschlichen und murinen B-Zell-Kompartimenten gibt, gilt dieses Protokoll nur für die Analyse von murinen B-Zellen. Dieses Protokoll wurde mit dem Ziel entwickelt, gentechnisch veränderte Mäuse zu phänotypisieren, um festzustellen, ob genetische Manipulation die B-Zellentwicklung verändern würde. Die Durchflusszytometrie ist auch in vielen weiteren Anwendungen sehr beliebt, darunter bei der Messung von Zellaktivierung, Funktion, Proliferation, Zyklusanalyse, DNA-Gehaltsanalyse, Apoptose und Zellsortierung 19,20.
Die Durchflusszytometrie ist das Werkzeug der Wahl, um verschiedene Lymphozytenkompartimente bei Mäusen und Menschen zu charakterisieren, einschließlich komplexer Organe wie Milz, BM und Blut. Aufgrund der weit verbreiteten mausspezifischen Antikörperreagenzien für die Durchflusszytometrie kann mit dieser Technik nicht nur Zelloberflächenproteine, sondern auch intrazelluläre Phosphoproteine und Zytokine sowie funktionelle Auslesungen untersucht werden21. Hierin zeigen wir, wie Durchflusszytometrie-Reagenzien verwendet werden können, um B-Zell-Untergruppen zu identifizieren, wenn sie in sekundären lymphatischen Organen reifen und differenzieren. Nach der Optimierung der Färbebedingungen, der Probenhandhabung, der korrekten Geräteeinrichtung und Datenerfassung und schließlich der Datenanalyse kann ein Protokoll für die umfassende durchflusszytometrische Analyse des B-Zell-Kompartiments bei Mäusen verwendet werden. Eine solche umfassende Analyse basiert auf einer jahrzehntealten Nomenklatur, die von Hardy und Kollegen entwickelt wurde, wobei sich entwickelnde BM B-2-Zellen in Abhängigkeit von ihrer Expression von B220, CD43, BP-1, CD24, IgM und IgD22 in verschiedene Fraktionen (Fraction) unterteilt werden können. Hardy et al. zeigten, dass B220+ CD43 BM B-Zellen auf der Grundlage der BP-1- und CD24(30F1)-Expression in vier Untergruppen (Fraction A-C’) unterteilt werden können, während B220+ CD43-(dim to neg) BM B-Zellen basierend auf der differentiellen Expression von IgD und Oberflächen-IgM23 in drei Untergruppen (Fraction D-F’) aufgelöst werden können. Fraktion A (Prä-Pro-B-Zellen) sind definiert als BP-1– CD24 (30F1)–, Fraktion B (frühe Pro-B-Zellen) sind definiert als BP-1– CD24 (30F1)+, Fraktion C (späte Pro-B-Zellen) sind definiert als BP-1+ CD24 (30F1)+ und Fraktion C’ (frühe Prä-B-Zellen) sind als BP-1+ und CD24high definiert. Darüber hinaus sind Fraktion D (Prä-B-Zellen) definiert als B220 + CD43– IgM– B-Zellen, und Fraktion E (neu erzeugte B-Zellen, Kombination von unreifen und Übergangszellen) sind definiert als B220 + CD43– IgM + B-Zellen und Fraktion F (reife, rezirkulierende B-Zellen) sind definiert als B220high CD43– IgM + B-Zellen. Im Gegensatz dazu kann die Mehrheit der naiven B-Zellen in der Milz in reife (B220+ CD93-) B-Zellen und Übergangszellen (T1, T2, T3) unterteilt werden, abhängig von der Expression von CD93, CD23 und IgM. Reife B-Zellen können basierend auf der Expression von IgM und CD21/CD35 in Marginalzonen und follikuläre Untergruppen aufgelöst werden, und follikuläre Untergruppen können weiter in reife follikuläre Typ I und follikuläre Typ II B-Zelluntergruppen unterteilt werden, abhängig von der Ebene ihrer IgM- und IgD-Oberflächenexpression24. Diese Milz-B-Zell-Populationen exprimieren überwiegend Igκ-Leichtketten. Schließlich wurden B-1 B-Zellpopulationen, die aus der fetalen Leber stammen und hauptsächlich in den Peritoneal- und Pleurahöhlen erwachsener Mäuse vorkommen, in der Literatur beschrieben. Diese peritonealen B-Zellen können von den zuvor beschriebenen B-2 B-Zellen durch ihre fehlende CD23-Expression unterschieden werden. Sie werden dann weiter in B-1a- oder B-1b-Populationen unterteilt, wobei erstere durch das Vorhandensein von CD5 und letztere durch sein Fehlen definiert werden25. B-1-Zell-Vorläufer sind in der fetalen Leber reichlich vorhanden, werden aber nicht in erwachsenen BM gefunden. Während B-1a- und B-1b-Zellen von verschiedenen Vorläuferzellen stammen, säen beide die Peritoneal- und Pleurahöhle24. Im Gegensatz zu B-2-Zellen sind B-1-Zellen einzigartig in der Lage, sich selbst zu erneuern und sind für die Produktion natürlicher IgM-Antikörper verantwortlich.
Defekte in der B-Zell-Entwicklung können in vielen Fällen auftreten, einschließlich Mängel in den Komponenten des BCR26,27, Störungen von Signalmolekülen, die die BCR-Signalstärke beeinflussen14,28,29, oder Störungen von Zytokinen, die das Überleben von B-Zellen modulieren30,31 . Die durchflusszytometrische Analyse der lymphatischen Kompartimente hat zur Charakterisierung der B-Zell-Entwicklungsblöcke bei diesen Mäusen und vielen anderen beigetragen. Ein Vorteil der durchflusszytometrischen Analyse von lymphatischen Kompartimenten besteht darin, dass sie die Möglichkeit bietet, Messungen an einzelnen Zellen durchzuführen, die aus lebendem dissoziiertem Gewebe gewonnen werden. Die Verfügbarkeit von Reagenzien in einem ständig wachsenden Spektrum von Fluorophoren ermöglicht die gleichzeitige Analyse mehrerer Parameter und die Beurteilung der B-Zell-Heterogenität. Darüber hinaus ergänzt die Aufzählung von B-Zellen durch durchflusszytometrische Analyse andere immunologische Assays wie immunhistochemische Methoden, die die Zelllokalisierung in lymphatischen Organen visualisieren, den Nachweis zirkulierender Antikörperspiegel als Maß für die humorale Immunität sowie die Zwei-Photonen-Mikroskopie zur Messung von B-Zell-Antworten in realem Raum und Zeit32.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die durchflusszytometrische Analyse von lymphatischem und nicht-lymphatischem Gewebe ermöglicht seit den 1980er Jahren die gleichzeitige Identifizierung und Zählung von B-Zell-Subpopulationen bei Mäusen und Menschen. Es wurde als Maß für die humorale Immunität verwendet und kann weiter angewendet werden, um die B-Zell-Funktionalität zu bewerten. Diese Methode nutzt die Verfügbarkeit von Reagenzien, um verschiedene Stadien der B-Zell-Reifung bei Mäusen und Menschen durch die gleichzeitige Analyse mehrerer Paramet…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Matthew Sleeman für die kritische Lektüre des Manuskripts. Wir danken auch den Kernabteilungen Vivarium Operations und Flow Cytometry bei Regeneron für die Unterstützung dieser Forschung.
Materials
| 0.5 mL safe-lock Eppendorf tubes | Eppendorf | 22363611 | 0.5 mL microcentrifuge tube |
| 1.5mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 22364111 | 1.5 mL microcentrifuge tube |
| 15 mL Falcon tubes | Corning | 352097 | 15 mL conical tube |
| 18 gauge needle | BD | 305196 | |
| 25 gauge needle | BD | 305124 | |
| 3 mL syringe | BD | 309657 | |
| 70 mM MACS SmartStrainer | Miltenyi Biotec | 130-110-916 | 70 mM cell strainer |
| 96 well U bottom plate | VWR | 10861-564 | |
| ACK lysis buffer | GIBCO | A1049201 | red blood cell lysis buffer |
| Acroprep Advance 96 Well Filter Plate | Pall Corporation | 8027 | filter plate |
| B220 | eBiosciences | 17-0452-82 | |
| BD CompBead Anti-Mouse Ig/κ | BD | 552843 | compensation beads |
| BD CompBead Anti-Rat Ig/κ | BD | 552844 | compensation beads |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A8577 | BSA |
| BP-1 | BD | 740882 | |
| Brilliant Stain Buffer | BD | 566349 | brilliant stain buffer |
| C-Kit | BD | 564011 | |
| CD11b | BD | 563168 | |
| CD11b | BioLegend | 101222 | |
| CD19 | BD | 560143 | |
| CD21/35 | BD | 562756 | |
| CD23 | BD | 740216 | |
| CD24 (HSA) | BioLegend | 138504 | |
| CD3 | BD | 561388 | |
| CD3 | BioLegend | 100214 | |
| CD43 | BD | 553270 | |
| CD43 | BioLegend | 121206 | |
| CD5 | BD | 563194 | |
| CD93 | BD | 740750 | |
| CD93 | BioLegend | 136504 | |
| DPBS (1x) | ThermoFisher | 14190-144 | DPBS |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 506 | ThermoFisher | 65-0866-14 | viability dye |
| Extended Fine Tip Transfer Pipette | Samco | 233 | disposable transfer pipette |
| FACSymphony A3 flow cytometer | BD | custom order | flow cytometer |
| Fc Block, CD16/CD32 (2.4G2) | BD | 553142 | Fc block |
| FlowJo | Flowjo | flow cytometer analysis software | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | automated dissociation tube |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-095-937 | tissue dissociator instrument |
| GR1 (Ly6C/6G) | BioLegend | 108422 | |
| IgD | BioLegend | 405710 | |
| IgM | eBiosciences | 25-5790-82 | |
| Kappa | BD | 550003 | |
| Lambda | BioLegend | 407308 | |
| paraformaldehyde, 32% Solution | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| Ter119 | BioLegend | 116220 | |
| True-Stain Monocyte Blocker | BioLegend | 426103 | monocyte blocker |
| UltraPure EDTA, pH 8.0 | ThermoFisher | 15575038 | EDTA |
| Vi-CELL XR | Beckman Coulter | 731050 | cell counter instrument |
References
- Shepard, H. M., Philips, G. L., Thanos, D., Feldman, M. Developments in therapy with monoclonal antibodies and related proteins. Clinical Medicine. 17 (3), 220 (2017).
- Ecker, D. M., Jones, S. D., Levine, H. L. The therapeutic monoclonal antibody market. MAbs. 7 (1), 9-14 (2015).
- Macdonald, L. E., et al. Precise and in situ genetic humanization of 6 Mb of mouse immunoglobulin genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (14), 5147-5152 (2014).
- Murphy, A. J., et al. Mice with megabase humanization of their immunoglobulin genes generate antibodies as efficiently as normal mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (14), 5153-5158 (2014).
- Macdonald, L. E., et al. Kappa-on-Heavy (KoH) bodies are a distinct class of fully-human antibody-like therapeutic agents with antigen-binding properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 292-299 (2020).
- Pieper, K., Grimbacher, B., Eibel, H. B-cell biology and development. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 131 (4), 959-971 (2013).
- Nagasawa, T. Microenvironmental niches in the bone marrow required for B-cell development. Nature Reviews: Immunology. 6 (2), 107-116 (2006).
- Lund, F. E. Cytokine-producing B lymphocytes-key regulators of immunity. Current Opinion in Immunology. 20 (3), 332-338 (2008).
- Martensson, I. L., Keenan, R. A., Licence, S. The pre-B-cell receptor. Current Opinion in Immunology. 19 (2), 137-142 (2007).
- von Boehmer, H., Melchers, F. Checkpoints in lymphocyte development and autoimmune disease. Nature Immunology. 11 (1), 14-20 (2010).
- Goodnow, C. C., et al. Altered immunoglobulin expression and functional silencing of self-reactive B lymphocytes in transgenic mice. Nature. 334 (6184), 676-682 (1988).
- Zikherman, J., Parameswaran, R., Weiss, A. Endogenous antigen tunes the responsiveness of naive B cells but not T cells. Nature. 489 (7414), 160-164 (2012).
- Melchers, F. Checkpoints that control B cell development. Journal of Clinical Investigation. 125 (6), 2203-2210 (2015).
- Henderson, R. B., et al. A novel Rac-dependent checkpoint in B cell development controls entry into the splenic white pulp and cell survival. Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 837-853 (2010).
- Pillai, S., Cariappa, A. The follicular versus marginal zone B lymphocyte cell fate decision. Nature Reviews: Immunology. 9 (11), 767-777 (2009).
- Shahaf, G., Zisman-Rozen, S., Benhamou, D., Melamed, D., Mehr, R. B. Cell Development in the Bone Marrow Is Regulated by Homeostatic Feedback Exerted by Mature B Cells. Frontiers in Immunology. 7, 77 (2016).
- Nemazee, D. Mechanisms of central tolerance for B cells. Nature Reviews: Immunology. 17 (5), 281-294 (2017).
- Petkau, G., Turner, M. Signalling circuits that direct early B-cell development. Biochemical Journal. 476 (5), 769-778 (2019).
- McKinnon, K. M. Flow Cytometry: An Overview. Current Protocols in Immunology. 120, 1-5 (2018).
- Betters, D. M. Use of Flow Cytometry in Clinical Practice. Journal of the Advanced Practioner in Oncology. 6 (5), 435-440 (2015).
- Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project. Nature Reviews: Immunology. 12 (3), 191-200 (2012).
- Van Epps, H. L. Bringing order to early B cell chaos. Journal of Experimental Medicine. 203 (6), 1389 (2006).
- Hardy, R. R., Carmack, C. E., Shinton, S. A., Kemp, J. D., Hayakawa, K. Resolution and characterization of pro-B and pre-pro-B cell stages in normal mouse bone marrow. Journal of Experimental Medicine. 173 (5), 1213-1225 (1991).
- Allman, D., Pillai, S. Peripheral B cell subsets. Current Opinion in Immunology. 20 (2), 149-157 (2008).
- Shapiro-Shelef, M., Calame, K. Regulation of plasma-cell development. Nature Reviews: Immunology. 5 (3), 230-242 (2005).
- Kitamura, D., Roes, J., Kuhn, R., Rajewsky, K. A B cell-deficient mouse by targeted disruption of the membrane exon of the immunoglobulin mu chain gene. Nature. 350 (6317), 423-426 (1991).
- Keenan, R. A., et al. Censoring of autoreactive B cell development by the pre-B cell receptor. Science. 321 (5889), 696-699 (2008).
- Chan, V. W., Meng, F., Soriano, P., DeFranco, A. L., Lowell, C. A. Characterization of the B lymphocyte populations in Lyn-deficient mice and the role of Lyn in signal initiation and down-regulation. Immunity. 7 (1), 69-81 (1997).
- Zikherman, J., Doan, K., Parameswaran, R., Raschke, W., Weiss, A. Quantitative differences in CD45 expression unmask functions for CD45 in B-cell development, tolerance, and survival. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (1), 3-12 (2012).
- Miyamoto, A., et al. Increased proliferation of B cells and auto-immunity in mice lacking protein kinase Cdelta. Nature. 416 (6883), 865-869 (2002).
- Mecklenbrauker, I., Kalled, S. L., Leitges, M., Mackay, F., Tarakhovsky, A. Regulation of B-cell survival by BAFF-dependent PKCdelta-mediated nuclear signalling. Nature. 431 (7007), 456-461 (2004).
- Okada, T., et al. Antigen-engaged B cells undergo chemotaxis toward the T zone and form motile conjugates with helper T cells. PLoS Biology. 3 (6), 150 (2005).
- Robinson, J. P. Flow Cytometry. Encyclopedia of Biomaterials and Biomedical Engineering. , 630-640 (2004).
- Lugli, E., Roederer, M., Cossarizza, A. Data analysis in flow cytometry: the future just started. Cytometry A. 77 (7), 705-713 (2010).
- Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies. European Journal of Immunology. 47 (10), 1584 (2017).
- Bigos, M. Separation index: an easy-to-use metric for evaluation of different configurations on the same flow cytometer. Current Protocols in Cytometry. , 21 (2007).
- Pillai, S., Mattoo, H., Cariappa, A. B. B cells and autoimmunity. Current Opinion in Immunology. 23 (6), 721-731 (2011).
