Высокопроизводительный скрининг химических соединений для выяснения их влияния на бактериальную персистенцию
Summary
В этой статье мы представляем высокопроизводительную стратегию скрининга для выявления химических соединений, таких как осмолиты, которые оказывают значительное влияние на бактериальную персистенцию.
Abstract
Бактериальные персистенты определяются как небольшая субпопуляция фенотипических вариантов со способностью выдерживать высокие концентрации антибиотиков. Они являются важной проблемой для здоровья, поскольку они связаны с рецидивирующими хроническими инфекциями. Хотя стохастическая и детерминированная динамика механизмов, связанных со стрессом, как известно, играет значительную роль в персистентности, механизмы, лежащие в основе фенотипического перехода в состояние персистентности / из него, не полностью поняты. Хотя факторы стойкости, вызванные сигналами окружающей среды (например, истощение источников углерода, азота и кислорода), были широко изучены, воздействие осмолитов на стойкость еще предстоит определить. Используя микрочипы (т.е. 96 пластин скважин, содержащих различные химические вещества), мы разработали подход к выяснению влияния различных осмолитов на персистенцию кишечной палочки с высокой пропускной способностью. Этот подход является преобразующим, поскольку он может быть легко адаптирован для других скрининговых массивов, таких как панели лекарств и библиотеки нокаута генов.
Introduction
Бактериальные культуры содержат небольшую субпопуляцию персистентных клеток, которые временно терпимы к необычно высоким уровням антибиотиков. Персистентные клетки генетически идентичны своим чувствительным к антибиотикам сородиням, и их выживание объясняется временным ингибированием роста1. Персистентные клетки были впервые обнаружены Глэдис Хобби2, но этот термин был впервые использован Джозефом Биггером, когда он идентифицировал их в обработанных пенициллином культурах Staphylococcus pyogenes 3. Основополагающее исследование, опубликованное Balaban et al.4, обнаружило два типа персистентов: варианты типа I, которые в основном формируются при прохождении через стационарную фазу, и варианты типа II, которые непрерывно генерируются во время экспоненциального роста. Персистенты обнаруживаются с помощью клоногенных анализов выживаемости, в которых образцы культуры берутся через различные промежутки времени во время лечения антибиотиками, промываются и покрываются на типичной питательной среде для подсчета выживших клеток, которые могут колонизироваться в отсутствие антибиотиков. Существование персистентов в клеточной культуре оценивается по двухфазной кривой убийства4,5, где начальный экспоненциальный распад указывает на гибель чувствительных к антибиотикам клеток. Тем не менее, тенденция к уничтожению со временем уменьшается, что в конечном итоге приводит к плато, которая представляет собой выжившие персистентные клетки.
Персистентные клетки были связаны с различными заболеваниями, такими как туберкулез6,муковисцидоз7,кандидоз8 и инфекции мочевыводящих путей9. Было обнаружено, что почти все микроорганизмы, протестированные до сих пор, генерируют персистентные фенотипы, включая высокопатогенные Mycobacterium tuberculosis6, Staphylococcus aureus10, Pseudomonas aeruginosa7 и Candida albicans8. Недавние исследования также свидетельствуют о росте мутантов с множественной лекарственной устойчивостью из персистных субпопуляций11,12. Значительные усилия в этой области показали, что механизмы сохранения являются весьма сложными и разнообразными; известно, что как стохастические и детерминированныефакторы,связанные с реакцией SOS13,14,активных форм кислорода (АФК)15,системами токсина/антитоксина (ТА)16,аутофагией или самоперевариванием17 и строгим ответом18, связанным с ppGpp, облегчают образование персистаторов.
Несмотря на значительный прогресс в понимании фенотипа персистенции, влияние осмолитов на бактериальную персистенцию не было полностью понято. Поскольку поддержание оптимального осмотического давления является необходимостью для роста клеток, правильного функционирования и выживания, углубленное изучение осмолитов может привести к потенциальным целям для антиперсистентных стратегий. Несмотря на трудоемкий, высокопроизводительный скрининг является очень эффективным подходом к выявлению метаболитов и других химических веществ, которые играют решающую роль в фенотипе персистенции19,20. В этой работе мы обсудим наш опубликованный метод19,где мы использовали микрочипы, т.е. 96 пластин скважин, содержащих различные осмолиты (например, хлорид натрия, мочевину, нитрит натрия, нитрат натрия, хлорид калия), для выявления осмолитов, которые существенно влияют на персистенцию E. coli.
Protocol
Representative Results
Discussion
Описанный здесь высокопроизводительный персистерный анализ был разработан для выяснения влияния различных химических веществ на персистенцию E. coli. В дополнение к коммерческим пластинам ТЧ микрочипы могут быть изготовлены вручную, как описано в шаге 4.2. Кроме того, протокол, пред?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить членов Orman Lab за их ценный вклад в это исследование. Это исследование финансировалось премией NIH / NIAID K22AI125468 за переход к карьере и грантом на запуск Университета Хьюстона.
Materials
| 14-ml test tube | Fisher Scientific | 14-959-1B | |
| E. coli strain MG1655 | Princeton University | Obtained from Brynildsen lab | |
| Flat-bottom 96-well plate | USA Scientific | 5665-5161 | |
| Gas permeable sealing membrane | VWR | 102097-058 | Sterilized by gamma irradiation and free of cytotoxins |
| Half-area flat-bottom 96-well plate | VWR | 82050-062 | |
| LB agar | Fisher Scientific | BP1425-2 | Molecular genetics grade |
| Ofloxacin salt | VWR | 103466-232 | HPLC ≥97.5 |
| Phenotype microarray (PM-9 and PM-10) | Biolog | N/A | PM-9 and PM-10 plates contained various osmolytes and buffers respectively |
| Round-bottom 96-well plate | USA Scientific | 5665-0161 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-500 | Certified ACS grade |
| Sodium nitrate | Fisher Scientific | AC424345000 | ACS reagent grade |
| Sodium nitrite | Fisher Scientific | AAA186680B | 98% purity |
| Square petri dish | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| Tryptone | Fisher Scientific | BP1421-500 | Molecular genetics grade |
| Varioskan lux multi mode microplate reader | Thermo Fisher Scientific | VLBL00D0 | Used for optical density measurement at 600 nm |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-100 | Molecular genetics grade |
References
- Lewis, K. Persister cells, dormancy and infectious disease. Nature Reviews Microbiology. 5 (1), 48-56 (2007).
- Hobby, G. L., Meyer, K., Chaffee, E. Observations on the Mechanism of Action of Penicillin. Experimental Biology and Medicine. 50 (2), 281-285 (1942).
- Bigger, J. Treatment of staphylococcal infections with penicillin by intermittent sterilisation. The Lancet. 244 (6320), 497-500 (1944).
- Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. Bacterial persistence as a phenotypic switch. Science. 305 (5690), 1622-1625 (2004).
- Keren, I., Kaldalu, N., Spoering, A., Wang, Y., Lewis, K. Persister cells and tolerance to antimicrobials. FEMS Microbiology Letters. 230 (1), 13-18 (2004).
- Keren, I., Minami, S., Rubin, E., Lewis, K. Characterization and transcriptome analysis of mycobacterium tuberculosis persisters. mBio. 2 (3), (2011).
- Mulcahy, L. R., Burns, J. L., Lory, S., Lewis, K. Emergence of Pseudomonas aeruginosa Strains Producing High Levels of Persister Cells in Patients with Cystic Fibrosis. Journal of Bacteriology. 192 (23), 6191-6199 (2010).
- LaFleur, M. D., Kumamoto, C. A., Lewis, K. Candida albicans biofilms produce antifungal-tolerant persister cells. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (11), 3839-3846 (2006).
- Allison, K. R., Brynildsen, M. P., Collins, J. J. Metabolite-enabled eradication of bacterial persisters by aminoglycosides. Nature. 473 (7346), 216-220 (2011).
- Lechner, S., Lewis, K., Bertram, R. Staphylococcus aureus persisters tolerant to bactericidal antibiotics. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 22 (4), 235-244 (2012).
- Barrett, T. C., Mok, W. W. K., Murawski, A. M., Brynildsen, M. P. Enhanced antibiotic resistance development from fluoroquinolone persisters after a single exposure to antibiotic. Nature Communications. 10 (1), 1177 (2019).
- Windels, E. M., et al. Bacterial persistence promotes the evolution of antibiotic resistance by increasing survival and mutation rates. ISME Journal. 13 (5), 1239-1251 (2019).
- Dörr, T., Lewis, K., Vulić, M. SOS response induces persistence to fluoroquinolones in Escherichia coli. PLoS Genetics. 5 (12), 1000760 (2009).
- Völzing, K. G., Brynildsen, M. P. Stationary-phase persisters to ofloxacin sustain DNA damage and require repair systems only during recovery. mBio. 6 (5), (2015).
- Grant, S. S., Kaufmann, B. B., Chand, N. S., Haseley, N., Hung, D. T. Eradication of bacterial persisters with antibiotic-generated hydroxyl radicals. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (30), 12147-12152 (2012).
- Gerdes, K., Maisonneuve, E. Bacterial Persistence and Toxin-Antitoxin Loci. Annual Review of Microbiology. 66 (1), 103-123 (2012).
- Orman, M. A., Brynildsen, M. P. Inhibition of stationary phase respiration impairs persister formation in E. coli. Nature Communications. 6 (1), 7983 (2015).
- Korch, S. B., Henderson, T. A., Hill, T. M. Characterization of the hipA7 allele of Escherichia coli and evidence that high persistence is governed by (p)ppGpp synthesis. Molecular Microbiology. 50 (4), 1199-1213 (2003).
- Karki, P., Mohiuddin, S. G., Kavousi, P., Orman, M. A. Investigating the effects of osmolytes and environmental ph on bacterial persisters. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 64 (5), 02393 (2020).
- Mohiuddin, S. G., Hoang, T., Saba, A., Karki, P., Orman, M. A. Identifying Metabolic Inhibitors to Reduce Bacterial Persistence. Frontiers in Microbiology. 11, 472 (2020).
- Brooun, A., Liu, S., Lewis, K. A dose-response study of antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 44 (3), 640-646 (2000).
- Luidalepp, H., Jõers, A., Kaldalu, N., Tenson, T. Age of inoculum strongly influences persister frequency and can mask effects of mutations implicated in altered persistence. Journal of Bacteriology. 193 (14), 3598-3605 (2011).
- Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: The Keio collection. Molecular Systems Biology. 2, 0008 (2006).
- Zaslaver, A., et al. A comprehensive library of fluorescent transcriptional reporters for Escherichia coli. Nature Methods. 3 (8), 623-628 (2006).
- Hajmeer, M., Ceylan, E., Marsden, J. L., Fung, D. Y. C. Impact of sodium chloride on Escherichia coli O157:H7 and Staphylococcus aureus analysed using transmission electron microscopy. Food Microbiology. 23 (5), 446-452 (2006).
