Hochdurchsatz-Screening chemischer Verbindungen zur Aufklärung ihrer Auswirkungen auf die bakterielle Persistenz
Summary
In diesem Methodenpapier stellen wir eine Hochdurchsatz-Screening-Strategie vor, um chemische Verbindungen wie Osmolyte zu identifizieren, die einen signifikanten Einfluss auf die bakterielle Persistenz haben.
Abstract
Bakterielle Persister sind definiert als eine kleine Subpopulation phänotypischer Varianten mit der Fähigkeit, hohe Konzentrationen von Antibiotika zu vertünden. Sie sind ein wichtiges Gesundheitsproblem, da sie mit wiederkehrenden chronischen Infektionen in Verbindung gebracht wurden. Obwohl bekannt ist, dass stochastische und deterministische Dynamiken stressbezogener Mechanismen eine bedeutende Rolle bei der Persistenz spielen, sind die Mechanismen, die dem phänotypischen Wechsel zum/vom Persistenzzustand zugrunde liegen, nicht vollständig verstanden. Während Persistenzfaktoren, die durch Umweltsignale ausgelöst werden (z. B. Erschöpfung von Kohlenstoff-, Stickstoff- und Sauerstoffquellen), umfassend untersucht wurden, müssen die Auswirkungen von Osmolyten auf die Persistenz noch bestimmt werden. Mit Microarrays (d.h. 96 Brunnenplatten, die verschiedene Chemikalien enthalten) haben wir einen Ansatz entwickelt, um die Auswirkungen verschiedener Osmolyte auf die Persistenz von Escherichia coli mit hohem Durchsatz aufzuklären. Dieser Ansatz ist transformativ, da er leicht für andere Screening-Arrays wie Arzneimittelpanels und Gen-Knockout-Bibliotheken angepasst werden kann.
Introduction
Bakterienkulturen enthalten eine kleine Subpopulation von Persisterzellen, die vorübergehend tolerant gegenüber ungewöhnlich hohen Antibiotikaspiegeln sind. Persisterzellen sind genetisch identisch mit ihren antibiotikaempfindlichen Verwandten, und ihr Überleben wurde der vorübergehenden Wachstumshemmung zugeschrieben1. Persisterzellen wurden zuerst von Gladys Hobby2 entdeckt, aber der Begriff wurde zuerst von Joseph Bigger verwendet, als er sie in Penicillin-behandelten Staphylococcus pyogenes-Kulturen identifizierte3. Eine bahnbrechende Studie, die von Balaban et al.4 veröffentlicht wurde, entdeckte zwei Persistertypen: Typ-I-Varianten, die hauptsächlich durch die Passage durch die stationäre Phase gebildet werden, und Typ-II-Varianten, die während des exponentiellen Wachstums kontinuierlich erzeugt werden. Persister werden durch klonogene Überlebenstests nachgewiesen, bei denen Während der Antibiotikabehandlung in verschiedenen Abständen Kulturproben entnommen, gewaschen und auf einem typischen Wachstumsmedium plattiert werden, um die überlebenden Zellen zu zählen, die sich ohne Antibiotika ansiedeln können. Die Existenz von Persistern in einer Zellkultur wird durch eine biphasische Tötungskurve4,5 beurteilt,wobei der anfängliche exponentielle Zerfall den Tod antibiotikaempfindlicher Zellen anzeigt. Der Tötungstrend nimmt jedoch im Laufe der Zeit ab, was schließlich zu einer Plateauregion führt, die die überlebenden Persisterzellen darstellt.
Persisterzellen wurden mit verschiedenen Krankheiten wie Tuberkulose6, Mukoviszidose7, Candidiasis8 und Harnwegsinfektionen9 inVerbindung gebracht . Fast alle bisher getesteten Mikroorganismen erzeugen persistere Phänotypen, darunter hochpathogene Mycobacterium tuberculosis6, Staphylococcus aureus10, Pseudomonas aeruginosa7 und Candida albicans8. Neuere Studien liefern auch Hinweise auf den Anstieg multiresistenter Mutanten aus persisteren Subpopulationen11,12. Erhebliche Anstrengungen in diesem Bereich haben gezeigt, dass Persistenzmechanismen sehr komplex und vielfältig sind; Es istbekannt,dass sowohl stochastische als auch deterministische Faktoren, die mit der SOS-Reaktion13,14, reaktiven Sauerstoffspezies (ROS)15, Toxin/Antitoxin (TA) -Systemen16, Autophagie oder Selbstverdauung17 und ppGpp-bezogener strenger Reaktion18 verbunden sind, die Persisterbildung erleichtern.
Trotz signifikanter Fortschritte beim Verständnis des Persistenzphänotyps sind die Auswirkungen von Osmolyten auf die bakterielle Persistenz nicht vollständig verstanden. Da die Aufrechterhaltung eines optimalen osmotischen Drucks eine Notwendigkeit für das Wachstum, die ordnungsgemäße Funktion und das Überleben der Zellen ist, könnte eine eingehende Untersuchung von Osmolyten zu potenziellen Zielen für Anti-Persister-Strategien führen. Obwohl mühsam, ist das Hochdurchsatz-Screening ein sehr effektiver Ansatz zur Identifizierung von Metaboliten und anderen Chemikalien, die eine entscheidende Rolle bei der Persistenz des Phänotyps19,20spielen. In dieser Arbeit werden wir unsere veröffentlichte Methode19diskutieren, bei der wir Microarrays verwendet haben, dh 96 Wellplatten, die verschiedene Osmolyte enthalten (z. B. Natriumchlorid, Harnstoff, Natriumnitrit, Natriumnitrat, Kaliumchlorid), um Osmolyte zu identifizieren, die die Persistenz von E. coli signifikant beeinflussen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der hier beschriebene Hochdurchsatz-Persister-Assay wurde entwickelt, um die Auswirkungen verschiedener Chemikalien auf die Persistenz von E. coli aufzuklären. Zusätzlich zu kommerziellen PM-Platten können Microarrays manuell konstruiert werden, wie in Schritt 4.2 beschrieben. Darüber hinaus ist das hier vorgestellte Protokoll flexibel und kann verwendet werden, um andere Microarrays wie Drug Panels und Zellbibliotheken zu screenen, die in 96 Well-Plate-Formaten vorliegen. Die experimentellen Bedingungen ein…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken den Mitgliedern des Orman Lab für ihre wertvollen Beiträge während dieser Studie. Diese Studie wurde durch den NIH / NIAID K22AI125468 Career Transition Award und ein Startup-Stipendium der University of Houston finanziert.
Materials
| 14-ml test tube | Fisher Scientific | 14-959-1B | |
| E. coli strain MG1655 | Princeton University | Obtained from Brynildsen lab | |
| Flat-bottom 96-well plate | USA Scientific | 5665-5161 | |
| Gas permeable sealing membrane | VWR | 102097-058 | Sterilized by gamma irradiation and free of cytotoxins |
| Half-area flat-bottom 96-well plate | VWR | 82050-062 | |
| LB agar | Fisher Scientific | BP1425-2 | Molecular genetics grade |
| Ofloxacin salt | VWR | 103466-232 | HPLC ≥97.5 |
| Phenotype microarray (PM-9 and PM-10) | Biolog | N/A | PM-9 and PM-10 plates contained various osmolytes and buffers respectively |
| Round-bottom 96-well plate | USA Scientific | 5665-0161 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-500 | Certified ACS grade |
| Sodium nitrate | Fisher Scientific | AC424345000 | ACS reagent grade |
| Sodium nitrite | Fisher Scientific | AAA186680B | 98% purity |
| Square petri dish | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| Tryptone | Fisher Scientific | BP1421-500 | Molecular genetics grade |
| Varioskan lux multi mode microplate reader | Thermo Fisher Scientific | VLBL00D0 | Used for optical density measurement at 600 nm |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-100 | Molecular genetics grade |
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