High-throughput screening van chemische verbindingen om hun effecten op bacteriële persistentie op te helderen
Summary
In dit methodedocument presenteren we een screeningsstrategie met hoge doorvoer om chemische verbindingen, zoals osmolyten, te identificeren die een aanzienlijke impact hebben op de bacteriële persistentie.
Abstract
Bacteriële persistenten worden gedefinieerd als een kleine subpopulatie van fenotypische varianten met het vermogen om hoge concentraties antibiotica te tolereren. Ze zijn een belangrijk gezondheidsprobleem omdat ze zijn geassocieerd met terugkerende chronische infecties. Hoewel bekend is dat stochastische en deterministische dynamiek van stressgerelateerde mechanismen een belangrijke rol speelt bij persistentie, worden mechanismen die ten grondslag liggen aan de fenotypische switch van/naar de persistentietoestand niet volledig begrepen. Hoewel persistentiefactoren die worden veroorzaakt door omgevingssignalen (bijv. uitputting van koolstof-, stikstof- en zuurstofbronnen) uitgebreid zijn bestudeerd, moeten de effecten van osmolyten op persistentie nog worden bepaald. Met behulp van microarrays (d.w.z. 96 putplaten met verschillende chemicaliën) hebben we een aanpak ontworpen om de effecten van verschillende osmolyten op escherichia coli persistentie op een hoge doorvoer manier op te helderen. Deze aanpak is transformerend omdat het gemakkelijk kan worden aangepast voor andere screeningarrays, zoals medicijnpanels en gen knock-outbibliotheken.
Introduction
Bacteriële culturen bevatten een kleine subpopulatie van persistente cellen die tijdelijk tolerant zijn voor ongewoon hoge niveaus van antibiotica. Persistentiecellen zijn genetisch identiek aan hun antibioticagevoelige verwanten en hun overleving is toegeschreven aan voorbijgaande groeiremming1. Persistercellen werden voor het eerst ontdekt door Gladys Hobby2, maar de term werd voor het eerst gebruikt door Joseph Bigger toen hij ze identificeerde in met penicilline behandelde Staphylococcus pyogenesculturen 3. Een baanbrekende studie gepubliceerd door Balaban et al.4 ontdekte twee persistentietypen: type I-varianten die voornamelijk worden gevormd door passage door de stationaire fase, en type II-varianten die continu worden gegenereerd tijdens de exponentiële groei. Persistenten worden gedetecteerd door clonogene overlevingstesten, waarbij kweekmonsters met verschillende tussenpozen worden genomen tijdens antibioticabehandelingen, gewassen en geplateerd op een typisch groeimedium om de overlevende cellen te tellen die kunnen koloniseren bij afwezigheid van antibiotica. Het bestaan van persistenten in een celkweek wordt beoordeeld door een bifasische kill curve4,5 waarbij het initiële exponentiële verval wijst op de dood van antibioticagevoelige cellen. De moordtrend neemt echter in de loop van de tijd af, wat uiteindelijk leidt tot een plateaugebied dat de overlevende persistentiecellen vertegenwoordigt.
Persistercellen zijn geassocieerd met verschillende ziekten zoals tuberculose6, cystische fibrose7, candidiasis8 en urineweginfecties9. Bijna alle tot nu toe geteste micro-organismen bleken persistenterfenotypes te genereren, waaronder hoogpathogene Mycobacterium tuberculosis6, Staphylococcus aureus10, Pseudomonas aeruginosa7 en Candida albicans8. Recente studies leveren ook bewijs voor de opkomst van multidrugresistente mutanten uit persistenter subpopulaties11,12. Uit aanzienlijke inspanningen op dit gebied is gebleken dat persistentiemechanismen zeer complex en divers zijn; van zowel stochastische als deterministische factoren geassocieerd met de SOS-respons13,14, reactieve zuurstofsoorten (ROS)15, toxine/antitoxine (TA) systemen16, autofagie of zelfvertering17 en ppGpp-gerelateerde strenge respons18 is bekend dat persistentievorming wordt vergemakkelijkt.
Ondanks aanzienlijke vooruitgang bij het begrijpen van het persistentiefenotype, zijn de effecten van osmolyten op bacteriële persistentie niet volledig begrepen. Aangezien het behoud van optimale osmotische druk een noodzaak is voor de groei, goede werking en overleving van cellen, kan een diepgaande studie van osmolyten leiden tot potentiële doelwitten voor anti-persisterstrategieën. Hoewel moeizame screening met hoge doorvoer een zeer effectieve benadering is voor het identificeren van metabolieten en andere chemische stoffen die een cruciale rol spelen in de persistentie fenotype19,20. In dit werk zullen we onze gepubliceerde methode19bespreken , waarbij we microarrays hebben gebruikt, d.w.z. 96 putplaten die verschillende osmolyten bevatten (bijv. natriumchloride, ureum, natriumnitriet, natriumnitraat, kaliumchloride), om osmolyten te identificeren die de persistentie van E. coli aanzienlijk beïnvloeden.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hier beschreven persistentietest met hoge doorvoer is ontwikkeld om de effecten van verschillende chemicaliën op de persistentie van E. coli te verduidelijken. Naast commerciële PM-platen kunnen microarrays handmatig worden geconstrueerd zoals beschreven in stap 4.2. Bovendien is het hier gepresenteerde protocol flexibel en kan het worden gebruikt om andere microarrays te screenen, zoals medicijnpanelen en celbibliotheken, die in 96 putplaatformaten zijn. De experimentele omstandigheden, waaronder de groeif…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen de leden van Orman Lab bedanken voor hun waardevolle inbreng tijdens dit onderzoek. Deze studie werd gefinancierd door de NIH/NIAID K22AI125468 career transition award en een University of Houston startup grant.
Materials
| 14-ml test tube | Fisher Scientific | 14-959-1B | |
| E. coli strain MG1655 | Princeton University | Obtained from Brynildsen lab | |
| Flat-bottom 96-well plate | USA Scientific | 5665-5161 | |
| Gas permeable sealing membrane | VWR | 102097-058 | Sterilized by gamma irradiation and free of cytotoxins |
| Half-area flat-bottom 96-well plate | VWR | 82050-062 | |
| LB agar | Fisher Scientific | BP1425-2 | Molecular genetics grade |
| Ofloxacin salt | VWR | 103466-232 | HPLC ≥97.5 |
| Phenotype microarray (PM-9 and PM-10) | Biolog | N/A | PM-9 and PM-10 plates contained various osmolytes and buffers respectively |
| Round-bottom 96-well plate | USA Scientific | 5665-0161 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-500 | Certified ACS grade |
| Sodium nitrate | Fisher Scientific | AC424345000 | ACS reagent grade |
| Sodium nitrite | Fisher Scientific | AAA186680B | 98% purity |
| Square petri dish | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| Tryptone | Fisher Scientific | BP1421-500 | Molecular genetics grade |
| Varioskan lux multi mode microplate reader | Thermo Fisher Scientific | VLBL00D0 | Used for optical density measurement at 600 nm |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-100 | Molecular genetics grade |
References
- Lewis, K. Persister cells, dormancy and infectious disease. Nature Reviews Microbiology. 5 (1), 48-56 (2007).
- Hobby, G. L., Meyer, K., Chaffee, E. Observations on the Mechanism of Action of Penicillin. Experimental Biology and Medicine. 50 (2), 281-285 (1942).
- Bigger, J. Treatment of staphylococcal infections with penicillin by intermittent sterilisation. The Lancet. 244 (6320), 497-500 (1944).
- Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. Bacterial persistence as a phenotypic switch. Science. 305 (5690), 1622-1625 (2004).
- Keren, I., Kaldalu, N., Spoering, A., Wang, Y., Lewis, K. Persister cells and tolerance to antimicrobials. FEMS Microbiology Letters. 230 (1), 13-18 (2004).
- Keren, I., Minami, S., Rubin, E., Lewis, K. Characterization and transcriptome analysis of mycobacterium tuberculosis persisters. mBio. 2 (3), (2011).
- Mulcahy, L. R., Burns, J. L., Lory, S., Lewis, K. Emergence of Pseudomonas aeruginosa Strains Producing High Levels of Persister Cells in Patients with Cystic Fibrosis. Journal of Bacteriology. 192 (23), 6191-6199 (2010).
- LaFleur, M. D., Kumamoto, C. A., Lewis, K. Candida albicans biofilms produce antifungal-tolerant persister cells. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (11), 3839-3846 (2006).
- Allison, K. R., Brynildsen, M. P., Collins, J. J. Metabolite-enabled eradication of bacterial persisters by aminoglycosides. Nature. 473 (7346), 216-220 (2011).
- Lechner, S., Lewis, K., Bertram, R. Staphylococcus aureus persisters tolerant to bactericidal antibiotics. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 22 (4), 235-244 (2012).
- Barrett, T. C., Mok, W. W. K., Murawski, A. M., Brynildsen, M. P. Enhanced antibiotic resistance development from fluoroquinolone persisters after a single exposure to antibiotic. Nature Communications. 10 (1), 1177 (2019).
- Windels, E. M., et al. Bacterial persistence promotes the evolution of antibiotic resistance by increasing survival and mutation rates. ISME Journal. 13 (5), 1239-1251 (2019).
- Dörr, T., Lewis, K., Vulić, M. SOS response induces persistence to fluoroquinolones in Escherichia coli. PLoS Genetics. 5 (12), 1000760 (2009).
- Völzing, K. G., Brynildsen, M. P. Stationary-phase persisters to ofloxacin sustain DNA damage and require repair systems only during recovery. mBio. 6 (5), (2015).
- Grant, S. S., Kaufmann, B. B., Chand, N. S., Haseley, N., Hung, D. T. Eradication of bacterial persisters with antibiotic-generated hydroxyl radicals. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (30), 12147-12152 (2012).
- Gerdes, K., Maisonneuve, E. Bacterial Persistence and Toxin-Antitoxin Loci. Annual Review of Microbiology. 66 (1), 103-123 (2012).
- Orman, M. A., Brynildsen, M. P. Inhibition of stationary phase respiration impairs persister formation in E. coli. Nature Communications. 6 (1), 7983 (2015).
- Korch, S. B., Henderson, T. A., Hill, T. M. Characterization of the hipA7 allele of Escherichia coli and evidence that high persistence is governed by (p)ppGpp synthesis. Molecular Microbiology. 50 (4), 1199-1213 (2003).
- Karki, P., Mohiuddin, S. G., Kavousi, P., Orman, M. A. Investigating the effects of osmolytes and environmental ph on bacterial persisters. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 64 (5), 02393 (2020).
- Mohiuddin, S. G., Hoang, T., Saba, A., Karki, P., Orman, M. A. Identifying Metabolic Inhibitors to Reduce Bacterial Persistence. Frontiers in Microbiology. 11, 472 (2020).
- Brooun, A., Liu, S., Lewis, K. A dose-response study of antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 44 (3), 640-646 (2000).
- Luidalepp, H., Jõers, A., Kaldalu, N., Tenson, T. Age of inoculum strongly influences persister frequency and can mask effects of mutations implicated in altered persistence. Journal of Bacteriology. 193 (14), 3598-3605 (2011).
- Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: The Keio collection. Molecular Systems Biology. 2, 0008 (2006).
- Zaslaver, A., et al. A comprehensive library of fluorescent transcriptional reporters for Escherichia coli. Nature Methods. 3 (8), 623-628 (2006).
- Hajmeer, M., Ceylan, E., Marsden, J. L., Fung, D. Y. C. Impact of sodium chloride on Escherichia coli O157:H7 and Staphylococcus aureus analysed using transmission electron microscopy. Food Microbiology. 23 (5), 446-452 (2006).
