세균성 지속성에 미치는 영향을 밝히기 위해 화학 화합물의 높은 처리량 선별
Summary
이 방법 논문에서, 우리는 세균성 지속성에 중대한 영향을 미치는 삼투병과 같은 화학 화합물을 확인하기 위하여 고처리량 검열 전략을 제시합니다.
Abstract
세균성 퍼시스터는 항생제의 고농도를 용인하는 기능을 가진 현상변이의 작은 하위 집단으로 정의됩니다. 그(것)들은 재발하는 만성 감염과 연관되었기 때문에 중요한 건강 관심사입니다. 스트레스 관련 메커니즘의 금욕적이고 결정적인 역학은 지속성에 중요한 역할을하는 것으로 알려져 있지만, 지속성 상태에서 페노티픽 스위치의 기본 메커니즘은 완전히 이해되지 않습니다. 환경 신호(예: 탄소, 질소 및 산소 소스의 고갈)에 의해 유발되는 지속성 요인이 광범위하게 연구되었지만, 지속성에 대한 삼투석의 영향은 아직 결정되지 않았습니다. 마이크로어레이(즉, 다양한 화학 물질을 함유한 96개의 웰 플레이트)를 사용하여, 우리는 높은 처리량 방식으로 대장균 지속성에 대한 다양한 삼투석의 효과를 해명하는 접근법을 설계했습니다. 이 접근법은 약물 패널 및 유전자 녹아웃 라이브러리와 같은 다른 스크리닝 어레이에 쉽게 적응할 수 있으므로 변형적입니다.
Introduction
세균성 배양은 항생제의 비정상적으로 높은 수준에 일시적으로 관대 하는 persister 세포의 작은 하위 인구를 포함. Persister 세포는 그들의 항생제 에 민감한 친척과 유전적으로 동일하고, 그들의 생존은 일시적인 성장 억제1에기인했습니다. Persister 세포는 글래디스 취미2에 의해 처음 발견되었지만, 용어는 그가 페니실린 처리 황색포도상구균 pyogenes 배양3에서그(것)들을 확인했을 때 조셉 더 크에 의해 처음 이용되었습니다. 발라반 외4에 의해 간행된 정액 연구 결과는 2개의 persister 모형을 찾아냈습니다: 정지단계를 통해 통과하여 주로 형성되는 타입 I 변이체, 및 기하급수적인 성장 도중 지속적으로 생성되는 타입 II 변종. Persisters는 항생제 치료 중 다양한 간격으로 배양 샘플을 채취하여 항생제가 없는 경우 식민지화 할 수있는 생존 세포를 계산하기 위해 전형적인 성장 매체에 도금되는 clonogenic 생존 분석서에 의해 검출됩니다. 세포 배양에서 persisters의 존재는 초기 기하급수성 부패가 항생제에 민감한 세포의 죽음을 나타내는 biphasic 킬 곡선4,5에 의해 평가됩니다. 그러나, 살인 추세는 시간이 지남에 따라 감소, 결국 살아남은 persister 세포를 나타내는 고원 지역으로 이어지는.
퍼시스터 세포는 결핵6,낭포성 섬유증7,칸디다증8 및 요로 감염9와같은 다양한 질병과 관련이 있다. 지금까지 테스트된 거의 모든 미생물은 고병원성 진균결핵6, 황색포도상구균10, 슈도모나스 아에루기노사7 및 칸디다 알비칸스8을포함하여 퍼시스터 현상형을 생성하는 것으로 나타났다. 최근 연구는 또한 persister 하위 집단에서 다중 약물 내성 돌연변이의 상승의 증거를 제공합니다11,12. 이 분야에서 상당한 노력은 지속성 메커니즘이 매우 복잡하고 다양하다는 것을 밝혔습니다. SOS응답(13,14,반응성 산소 종(ROS)15,독소/항독소(TA)시스템(16),자가식 또는 자가소화(17) 및 ppGpp 관련 엄격한반응(18)과 관련된 관면 및 결정적 인자 모두 관음 형성을 용이하게 하는 것으로 알려져 있다.
지속성 표현형을 이해하는 중요한 진전에도 불구하고, 세균성 지속성에 대한 삼투병의 효력은 완전히 이해되지 않았습니다. 최적의 삼투압의 유지는 세포의 성장, 적절한 기능 및 생존에 필요한 이유이기 때문에 삼투석에 대한 심층연구는 반퍼 자매 전략에 대한 잠재적 인 대상으로 이어질 수 있습니다. 힘들지만, 고처리량 스크리닝은19,20에서중요한 역할을 하는 대사 산물 및 기타 화학 물질을 식별하기 위한 매우 효과적인 접근법이다. 이 작품에서는, 우리는 우리가 마이크로 어레이를 사용한 우리의 간행된 방법19,즉, 96 각종 삼투엽소를 포함하는 96 개의 잘 플레이트 (예를 들어, 염화나트륨, 우레아, 아질산나트륨, 나트륨 아질산염, 칼륨 염화) 대장균 지속성에 현저하게 영향을 미치는 osmolytes를 규명하기 위하여 토론할 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명된 높은 처리량 퍼시스터 분석은 대장균 지속성에 대한 다양한 화학 물질의 효과를 해명하기 위해 개발되었다. 상용 PM 플레이트 외에도 마이크로어레이는 4.2 단계에서 설명된 대로 수동으로 시공할 수 있습니다. 더욱이, 여기에 제시된 프로토콜은 유연하고 96개의 웰 플레이트 형식으로 약물 패널 및 세포 라이브러리와 같은 다른 마이크로어레이를 선별하는 데 사용될 수 있다….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는이 연구 기간 동안 그들의 귀중한 입력에 대한 Orman 연구소의 회원들에게 감사드립니다. 이 연구는 NIH /NIAID K22AI125468 경력 전환 상과 휴스턴 대학 스타트업 보조금에 의해 투자되었다.
Materials
| 14-ml test tube | Fisher Scientific | 14-959-1B | |
| E. coli strain MG1655 | Princeton University | Obtained from Brynildsen lab | |
| Flat-bottom 96-well plate | USA Scientific | 5665-5161 | |
| Gas permeable sealing membrane | VWR | 102097-058 | Sterilized by gamma irradiation and free of cytotoxins |
| Half-area flat-bottom 96-well plate | VWR | 82050-062 | |
| LB agar | Fisher Scientific | BP1425-2 | Molecular genetics grade |
| Ofloxacin salt | VWR | 103466-232 | HPLC ≥97.5 |
| Phenotype microarray (PM-9 and PM-10) | Biolog | N/A | PM-9 and PM-10 plates contained various osmolytes and buffers respectively |
| Round-bottom 96-well plate | USA Scientific | 5665-0161 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-500 | Certified ACS grade |
| Sodium nitrate | Fisher Scientific | AC424345000 | ACS reagent grade |
| Sodium nitrite | Fisher Scientific | AAA186680B | 98% purity |
| Square petri dish | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| Tryptone | Fisher Scientific | BP1421-500 | Molecular genetics grade |
| Varioskan lux multi mode microplate reader | Thermo Fisher Scientific | VLBL00D0 | Used for optical density measurement at 600 nm |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-100 | Molecular genetics grade |
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