Visualisierung der Diffusionsdynamik von Gold-Nanostäben auf der Zellmembran mit Single Nanoparticle Darkfield-Mikroskopie
Summary
Hier zeigen wir den Einsatz der traditionellen Dunkelfeldmikroskopie zur Überwachung der Dynamik von Gold-Nanostäben (AuNRs) auf der Zellmembran. Die Position und Ausrichtung einzelner AuNRs wird mit ImageJ und MATLAB erkannt, und die diffusiven Zustände von AuNRs sind durch eine einzelfaktnverfolgte Analyse gekennzeichnet.
Abstract
Die Analyse der Diffusionsdynamik von Nanopartikeln auf der Zellmembran spielt eine wichtige Rolle für ein besseres Verständnis des zellulären Aufnahmeprozesses und bietet eine theoretische Grundlage für die rationale Gestaltung der Nanomedizin-Entbindung. Die Einzelpartikelverfolgungsanalyse (SPT) könnte die Position und Ausrichtung einzelner Nanopartikel auf der Zellmembran untersuchen und deren Translations- und Rotationszustände aufzeigen. Hier zeigen wir, wie sie die traditionelle Dunkelfeldmikroskopie nutzt, um die Dynamik von Gold-Nanostäben (AuNRs) auf der lebenden Zellmembran zu überwachen. Wir zeigen auch, wie Sie die Position und Ausrichtung von AuNRs mit ImageJ und MATLAB extrahieren und die diffusiven Zustände von AuNRs charakterisieren. Die statistische Analyse von Hunderten von Partikeln zeigt, dass einzelne AuNRs Brownsche Bewegungen auf der Oberfläche der U87 MG-Zellmembran durchführen. Die individuelle Langzeitanalyse zeigt jedoch, dass AuNRs zwei deutlich unterschiedliche Arten von Bewegungszuständen auf der Membran aufweisen, nämlich Langstreckentransport und ein begrenztes Gebiet. Unsere SPT-Methoden können potenziell verwendet werden, um die Oberflächen- oder intrazelluläre Partikeldiffusion in verschiedenen biologischen Zellen zu untersuchen und kann zu einem leistungsfähigen Werkzeug für Untersuchungen komplexer zellulärer Mechanismen werden.
Introduction
Die Dynamik von Nanopartikeln (NPs) auf der Membran ist eng mit dem zellulären Aufnahmeprozess verbunden, der für das Verständnis von Zellfunktionen, viralen oder bakteriellen Infektionen und der Entwicklung künstlicher nanomedizinischer Abgabesysteme1,2wesentlich ist. Die Single-Partikel-Tracking-Technik (SPT) ist ein robustes Werkzeug zur Charakterisierung des heterogenen Verhaltens von NPs3,4. Im Allgemeinen ist die Zellmembran flüssig, was bedeutet, dass sich die Komponenten wie Proteine und Lipide seitlich in der Plasmamembranebene5,6,7bewegen können. Die räumlich zeitliche Komplexität der Membranorganisation und -struktur kann zu einer raumzeitlichen Heterogenität der Interaktion zwischen NPs und Membran führen. Daher erfordert die direkte Visualisierung der Bewegung von NPs auf der Membran sowohl eine hohe räumliche als auch zeitliche Auflösung.
Die Einzelpartikel-Tracking-Mikroskopie, die die Lokalisierung einzelner Teilchen in lebenden Zellen mit einer räumlichen Auflösung von zig Nanometern und einer Zeitauflösung von Millisekunden überwacht, wurde gut entwickelt, um die Dynamik von NPs oder Membranmolekülen zu untersuchen8,9. Fluoreszenzbasierte mikroskopische Bildgebungstechniken sind zu wertvollen Werkzeugen für die Beobachtung von NPs/Molekülen in lebenden Zellumgebungen9,10,11,12. Zum Beispiel wurde die gesamte interne Reflexionsfluoreszenzmikroskopie, die dünne Schichten (ca. 100 nm) der Probe an der Substrat-/Lösungsschnittstelle mit einer hohen raumzeitlichen Auflösung abbildt, in Studien der Membranmoleküldynamik13,14weit verbreitet eingesetzt. Die inhärenten Nachteile einzelner Fluorophore, wie niedrige Intensität und schnelle irreversible Photobleichung, reduzieren jedoch die Genauigkeit und Dauer der Verfolgung13. Daher haben nichtfluoreszierende Plasmononische NPs, die die fluoreszierenden Sonden ersetzen, aufgrund ihrer einzigartigen optischen Eigenschaften immer mehr Aufmerksamkeit in Langzeit-Bildgebungsstudien erregt15. Basierend auf den Streusignalen von plasmonischen NP-Sonden wurden verschiedene Arten von optischen mikroskopischen Bildgebungstechnologien verwendet, um den Mechanismus biologischer Prozesse zu untersuchen, wie z. B. Die Dunkelfeldmikroskopie (DFM)16, die interferometrische Streuung (iSCAT) Mikroskopie17 und die Differentialinterferenzkontrastmikroskopie (DICM)18. Darüber hinaus kann die Bewegungs- und Rotationsdynamik von AuNRs mit DFM und DICM18,19,20,21,22erhalten werden. In der Regel wird in einem SPT-Experiment die Bewegung des Objekts vom optischen Mikroskop aufgezeichnet und dann mit SPT-Analysemethoden3analysiert. Die zeitaufgelösten Bahnen und Orientierungswinkel, die von einzelnen NPs erzeugt werden, sind normalerweise stochastisch und heterogen, so dass es notwendig ist, reichlich dynamische Informationen mit verschiedenen Analysemethoden darzustellen.
Hier bieten wir ein integriertes Protokoll, das die Dynamik von AuNRs auf Zellmembran mit DFM überwacht, die Position und Ausrichtung von AuNRs mit ImageJ und MATLAB extrahiert und die Diffusion von AuNRs mit SPT-Analysemethoden charakterisiert. Als Demonstration zeigen wir hier, wie man das SPT-Protokoll verwendet, um die Dynamik von unveränderten AuNRs (CTAB-AuNRs, synthetisiert durch Cetyltrimethylammoniumammoniumbromidmolekül als Schutzmittel) auf der U87 MG-Zellmembran zu visualisieren. Es wurde gezeigt, dass CTAB-AuNRs Proteine in biologischer Umgebung adsorbieren, sich auf der Zellmembran bewegen und dann in Zellen2,20,22eindringen können. U87 MG-Zelle ist der häufigste und bösartigste Tumor des zentralen Nervensystems, und seine Membranrezeptoren sind ungewöhnlich exprimiert. Die Membranrezeptoren können mit Proteinen auf AuNRs interagieren, die die Dynamik von AuNRs beeinflussen. Unser Protokoll ist allgemein auf andere SPT-Experimente auf dem Gebiet der Biologie anwendbar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das vorgestellte Protokoll wird verwendet, um die Dynamik von AuNRs auf Zellmembran zu untersuchen. Das Protokoll besteht aus vier Teilen, einschließlich mikroskopischer Bildgebung, Datenextraktion, Berechnung dynamischer Parameter und Datenanalysemethoden, und jedes Teil ist flexibel und universell. Daher gibt es viele mögliche zukünftige Anwendungen, zum Beispiel die Untersuchung der Bewegung von NP-verknüpften Membranmolekülen auf der Membran, endozytose Dynamik von NP-markierten Rezeptoren, dynamische Analyse vo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China mit den Fördernummern 21425519, 91853105 und 21621003 unterstützt.
Materials
| CTAB coated gold nanorods(CTAB-AuNRs) | Nanoseedz | NR-40-650 | 85 nm * 40 nm |
| Color CMOS camera | Olympus | DP74 | Japan |
| Coverslips | Citoglas | z10212222C | 22*22 mm |
| Dark-field microscopy | Nikon | 80i | upright microscope |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10099141 | |
| Fiji | National Institutes of Health | 2.0.0-rc-69/1.52 p | a distribution of ImageJ |
| Grooved glass slide | Sail brand | 7103 | Single concave |
| Image J | National Institutes of Health | 1.52 j | |
| MATLAB | MathWorks | R2019b | |
| MATLAB Code | https://github.com/fenggeqd/JOVE-2020 | ||
| Minimum essential medium (MEM) | Gibco | 10-010-CVR | with phenol red |
| Minimum essential medium (MEM) | Gibco | 51200038 | no phenol red |
| Origin | OriginLab | Origin Pro 2018C | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Plastic cell culture dishes | Falcon | 353002 | |
| Plastic cell culture dishes | Falcon | 353001 | 35*10 mm |
| U87 MG cell | American Type Culture Collection | ATCC HTB-14 | a human primary glioblastoma cell line |
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