Diffusional Dynamics of Gold Nanorods visualiseren op celmembraan met behulp van Single Nanoparticle Darkfield Microscopy
Summary
Hier tonen we het gebruik van traditionele donkerveldmicroscopie om de dynamiek van gouden nanorods (AuNRs) op celmembraan te monitoren. De locatie en oriëntatie van enkele AuNR’s worden gedetecteerd met behulp van ImageJ en MATLAB, en de diffusieve toestanden van AuNR’s worden gekenmerkt door analyse van het volgen van afzonderlijke deeltjes.
Abstract
Het analyseren van de diffusionele dynamiek van nanodeeltjes op het celmembraan speelt een belangrijke rol bij een beter begrip van het cellulaire opnameproces en biedt een theoretische basis voor het rationele ontwerp van de levering van nanogeneeskunde. Single particle tracking (SPT) analyse kan de positie en oriëntatie van individuele nanodeeltjes op celmembraan onderzoeken en hun translationele en rotatietoestanden onthullen. Hier laten we zien hoe we traditionele donkerveldmicroscopie kunnen gebruiken om de dynamiek van gouden nanorods (AuNRs) op levend celmembraan te monitoren. We laten ook zien hoe u de locatie en oriëntatie van AuNRs extraheren met Behulp van ImageJ en MATLAB, en hoe u de diffusieve statussen van AuNRs karakteriseren. Statistische analyse van honderden deeltjes toont aan dat enkele AuNRs Browniaanse beweging uitvoeren op het oppervlak van U87 MG celmembraan. Individuele longtrajectanalyses tonen echter aan dat AuNR’s twee duidelijk verschillende soorten bewegingstoestanden op het membraan hebben, namelijk langeafstandstransport en opsluiting met een beperkt oppervlak. Onze SPT-methoden kunnen mogelijk worden gebruikt om de oppervlakte- of intracellulaire deeltjesdiffusie in verschillende biologische cellen te bestuderen en kunnen een krachtig hulpmiddel worden voor onderzoek naar complexe cellulaire mechanismen.
Introduction
De dynamiek van nanodeeltjes (NPs) op het membraan is nauw verbonden met het cellulaire opnameproces, wat essentieel is voor het begrip van celfuncties, virale of bacteriële infecties en de ontwikkeling van kunstmatige nanomedische toedieningssystemen1,2. Single particle tracking (SPT) techniek is een robuust hulpmiddel voor het karakteriseren van het heterogene gedrag van NPs3,4. Over het algemeen is celmembraan vloeibaar, wat betekent dat de componenten zoals eiwitten en lipiden zijdelings kunnen bewegen in het plasmamembraanvlak5,6,7. De spatiotemporale complexiteit van membraanorganisatie en -structuur kan leiden tot spatiotemporale heterogeniteit van de interactie tussen NPs en membraan. Daarom vereist directe visualisatie van de beweging van NPs op het membraan zowel een hoge ruimtelijke als temporele resolutie.
Single particle tracking microscopie die de lokalisatie van individuele deeltjes in levende cellen monitort met een ruimtelijke resolutie van tientallen nanometers en een tijdsresolutie van milliseconden is goed ontwikkeld om de NPs of membraanmoleculendynamica8,9te bestuderen . Fluorescentie-gebaseerde microscopische beeldvormingstechnieken zijn waardevolle instrumenten geworden voor het observeren van NPs/moleculen in de leefomgeving9,10,11,12. Bijvoorbeeld, totale interne reflectie fluorescentie microscopie, die dunne lagen (~ 100 nm) van het monster op de substraat / oplossingsinterface met een hoge spatiotemporale resolutie in beeldbrengen,is veel gebruikt in studies naar membraanmoleculendynamiek13,14. De inherente nadelen van enkele fluorforen, zoals lage intensiteit en snelle onomkeerbare fotobleaching, verminderen echter de nauwkeurigheid en duur van tracking13. Daarom hebben niet-fluorescerende plasmonische NPs, die de fluorescerende sondes vervangen, steeds meer aandacht getrokken in langetermijnbeeldvormingsstudies vanwege hun unieke optische kenmerken15. Op basis van de verstrooiingssignalen van plasmonische NP-sondes zijn verschillende soorten optische microscopische beeldvormingstechnologieën gebruikt om het mechanisme van biologische processen te bestuderen, zoals donkerveldmicroscopie (DFM)16,interferometrische verstrooiing (iSCAT) microscopie17 en differentiële interferentiecontrastmicroscopie (DICM)18. Bovendien kan de bewegings – en rotatiedynamiek van AuNRs worden verkregen met behulp van DFM en DICM18,19,20,21,22. Meestal wordt in een SPT-experiment de beweging van het object geregistreerd door de optische microscoop en vervolgens geanalyseerd door SPT-analysemethoden3. De tijdgeopgeleerde trajecten en oriëntatiehoeken die door individuele NPs worden gegenereerd, zijn normaal stochastisch en heterogeen, dus het is noodzakelijk om overvloedige dynamische informatie te presenteren met verschillende analysemethoden.
Hier bieden we een geïntegreerd protocol dat de dynamiek van AuNR’s op celmembraan bewaakt met behulp van DFM, de locatie en oriëntatie van AuNR’s extraheert met ImageJ en MATLAB en de verspreiding van AuNR’s karakteriseert met SPT-analysemethoden. Als demonstratie laten we hier zien hoe we het SPT-protocol kunnen gebruiken om de dynamiek van ongewijzigde AuNR’s (CTAB-AuNRs, gesynthetiseerd door cetyltrimethylammonium ammoniumbromidemolecuul als beschermend middel) op U87 MG-celmembraan te visualiseren. Er is aangetoond dat CTAB-AuNRs eiwitten in biologische omgeving kunnen adsorberen, op celmembraan kunnen bewegen en vervolgens cellen2,20,22kunnen binnendringen . U87 MG-cel is de meest voorkomende en meest kwaadaardige tumor van het centrale zenuwstelsel en de membraanreceptoren worden abnormaal uitgedrukt. De membraanreceptoren kunnen interageren met eiwitten op AuNR’s, die de dynamiek van AuNR’s beïnvloeden. Ons protocol is algemeen toepasbaar op andere SPT experimenten op het gebied van biologie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het gepresenteerde protocol wordt gebruikt om de dynamiek van AuNR’s op celmembraan te bestuderen. Het protocol bestaat uit vier delen, waaronder microscopische beeldvorming, gegevensextractie, dynamische parametersberekening en data-analysemethoden, en elk onderdeel is flexibel en universeel. Daarom zijn er veel mogelijke toekomstige toepassingen, bijvoorbeeld het bestuderen van de beweging van NP-gekoppelde membraanmoleculen op membraan, endocytosedynamiek van NP-gelabelde receptoren, dynamische analyse van intracellul…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China met subsidienummers van 21425519, 91853105 en 21621003.
Materials
| CTAB coated gold nanorods(CTAB-AuNRs) | Nanoseedz | NR-40-650 | 85 nm * 40 nm |
| Color CMOS camera | Olympus | DP74 | Japan |
| Coverslips | Citoglas | z10212222C | 22*22 mm |
| Dark-field microscopy | Nikon | 80i | upright microscope |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10099141 | |
| Fiji | National Institutes of Health | 2.0.0-rc-69/1.52 p | a distribution of ImageJ |
| Grooved glass slide | Sail brand | 7103 | Single concave |
| Image J | National Institutes of Health | 1.52 j | |
| MATLAB | MathWorks | R2019b | |
| MATLAB Code | https://github.com/fenggeqd/JOVE-2020 | ||
| Minimum essential medium (MEM) | Gibco | 10-010-CVR | with phenol red |
| Minimum essential medium (MEM) | Gibco | 51200038 | no phenol red |
| Origin | OriginLab | Origin Pro 2018C | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Plastic cell culture dishes | Falcon | 353002 | |
| Plastic cell culture dishes | Falcon | 353001 | 35*10 mm |
| U87 MG cell | American Type Culture Collection | ATCC HTB-14 | a human primary glioblastoma cell line |
References
- Rees, P., Wills, J. W., Brown, M. R., Barnes, C. M., Summers, H. D. The origin of heterogeneous nanoparticle uptake by cells. Nature Communication. 10 (1), 2341 (2019).
- Behzadi, S., et al. Cellular uptake of nanoparticles: journey inside the cell. Chemical Society Reviews. 46 (14), 4218-4244 (2017).
- Shen, H., et al. Single Particle Tracking: From Theory to Biophysical Applications. Chemical Reviews. 117 (11), 7331-7376 (2017).
- Saxton, M. J. Single-particle tracking: connecting the dots. Nature Methods. 5 (8), 671-672 (2008).
- Kusumi, A., et al. Dynamic organizing principles of the plasma membrane that regulate signal transduction: commemorating the fortieth anniversary of Singer and Nicolson’s fluid-mosaic model. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 215-250 (2012).
- Jacobson, K., Liu, P., Lagerholm, B. C. The Lateral Organization and Mobility of Plasma Membrane Components. Cell. 177 (4), 806-819 (2019).
- Sezgin, E., Levental, I., Mayor, S., Eggeling, C. The mystery of membrane organization: composition, regulation and roles of lipid rafts. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 361-374 (2017).
- von Diezmann, A., Shechtman, Y., Moerner, W. E. Three-Dimensional Localization of Single Molecules for Super-Resolution Imaging and Single-Particle Tracking. Chemical Reviews. 117 (11), 7244-7275 (2017).
- Rosenberg, J., Huang, J. Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (155), e59914 (2020).
- Kusumi, A., Tsunoyama, T. A., Hirosawa, K. M., Kasai, R. S., Fujiwara, T. K. Tracking single molecules at work in living cells. Nature Chemical Biology. 10 (7), 524-532 (2014).
- Rocha, J. M., Gahlmann, A. Single-Molecule Tracking Microscopy – A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules. Journal of Visualized Experiments. (151), e59387 (2019).
- Uphoff, S., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. Visualizing protein-DNA interactions in live bacterial cells using photoactivated single-molecule tracking. Journal of Visualized Experiments. (85), e511177 (2014).
- Pinaud, F., Clarke, S., Sittner, A., Dahan, M. Probing cellular events, one quantum dot at a time. Nature Methods. 7 (4), 275-285 (2010).
- Mehidi, A., et al. Transient Activations of Rac1 at the Lamellipodium Tip Trigger Membrane Protrusion. Current Biology. 29 (17), 2852-2866 (2019).
- Ye, Z., Wang, X., Xiao, L. Single-Particle Tracking with Scattering-Based Optical Microscopy. Analytical Chemistry. 91 (24), 15327-15334 (2019).
- Pan, Q., Zhao, H., Lin, X., He, Y. Spatiotemporal Heterogeneity of Reactions in Solution Observed with High-Speed Single-Nanorod Rotational Sensing. Angewandte Chemie. International Ed. in English. 58 (25), 8389-8393 (2019).
- Taylor, R. W., et al. Interferometric scattering microscopy reveals microsecond nanoscopic protein motion on a live cell membrane. Nature Photonics. 13 (7), 480-487 (2019).
- Chen, K., et al. Characteristic rotational behaviors of rod-shaped cargo revealed by automated five-dimensional single particle tracking. Nature Communication. 8 (1), 887 (2017).
- Xu, D., He, Y., Yeung, E. S. Y. Direct observation of the orientation dynamics of single protein-coated nanoparticles at liquid/solid interfaces. Angewandte Chemie. International Ed. in English. 53 (27), 6951-6955 (2014).
- Lehui, X., Yan, H., Edward, S. Y. Three Dimensional Orientational Imaging of Nanoparticles with Darkfield Microscopy. Analytical Chemistry. 82, 5268-5274 (2010).
- Ge, F., Xue, J., Wang, Z., Xiong, B., He, Y. Real-time observation of dynamic heterogeneity of gold nanorods on plasma membrane with darkfield microscopy. Science China Chemistry. 62, 1072-1081 (2019).
- Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
- Janczura, J., Weron, A. Ergodicity testing for anomalous diffusion: small sample statistics. The Journal of Chemical Physics. 142 (14), 144103 (2015).
- Kim, D. H., et al. Single particle tracking-based reaction progress kinetic analysis reveals a series of molecular mechanisms of cetuximab-induced EGFR processes in a single living cell. Chemical Science. 8 (7), 4823-4832 (2017).
- Kurzthaler, C., et al. Probing the Spatiotemporal Dynamics of Catalytic Janus Particles with Single-Particle Tracking and Differential Dynamic Microscopy. Physical Review Letters. 121 (7), 078001 (2018).
- Lin, X., Pan, Q., He, Y. In situ detection of protein corona on single particle by rotational diffusivity. Nanoscale. 11 (39), 18367-18374 (2019).
- Wei, L., et al. Sub-diffraction-limit localization imaging of a plasmonic nanoparticle pair with wavelength-resolved dark-field microscopy. Nanoscale. 9 (25), 8747-8755 (2017).
- Cheng, X., Dai, D., Xu, D., He, Y., Yeung, E. S. Subdiffraction-limited plasmonic imaging with anisotropic metal nanoparticles. Analytical Chemistry. 86 (5), 2303-2307 (2014).
- Belyy, V., et al. PhotoGate microscopy to track single molecules in crowded environments. Nature Communication. 8, 13978 (2017).
