Visualisation de la dynamique diffusionnelle des nanorods d’or sur la membrane cellulaire à l’aide d’une microscopie darkfield nanoparticule unique
Summary
Ici, nous montrons l’utilisation de la microscopie traditionnelle en champ sombre pour surveiller la dynamique des nanorods d’or (AuNRs) sur la membrane cellulaire. L’emplacement et l’orientation des aunrs simples sont détectés à l’aide d’ImageJ et de MATLAB, et les états diffusifs des AuNRs sont caractérisés par une analyse unique du suivi des particules.
Abstract
L’analyse de la dynamique de diffusion des nanoparticules sur la membrane cellulaire joue un rôle important dans une meilleure compréhension du processus d’absorption cellulaire et fournit une base théorique pour la conception rationnelle de la livraison de nanomédication. L’analyse du suivi unique des particules (SPT) pourrait sonder la position et l’orientation des nanoparticules individuelles sur la membrane cellulaire et révéler leurs états translationnels et de rotation. Ici, nous montrons comment utiliser la microscopie traditionnelle en champ sombre pour surveiller la dynamique des nanorods d’or (AuNRs) sur la membrane cellulaire vivante. Nous montrons également comment extraire l’emplacement et l’orientation des AuNR à l’aide d’ImageJ et matlab, et comment caractériser les états diffusifs des AuNRs. L’analyse statistique de centaines de particules montre qu’un seul AuNRs effectue le mouvement brownien à la surface de la membrane cellulaire U87 MG. Toutefois, l’analyse individuelle à longue trajectoire montre que les AuNR ont deux types d’états de mouvement distinctement différents sur la membrane, à savoir le transport à longue portée et l’enfermement à zone limitée. Nos méthodes de SPT peuvent être potentiellement utilisées pour étudier la diffusion des particules de surface ou intracellulaires dans différentes cellules biologiques et peuvent devenir un outil puissant pour l’étude de mécanismes cellulaires complexes.
Introduction
La dynamique des nanoparticules (PN) sur la membrane est étroitement associée au processus d’absorption cellulaire, qui est essentiel à la compréhension des fonctions cellulaires, des infections virales ou bactériennes et au développement de systèmes artificiels de livraison nanomédicale1,2. La technique de suivi des particules simples (SPT) est un outil robuste pour caractériser les comportements hétérogènes desPN 3,4. En général, la membrane cellulaire est fluide, ce qui signifie que les composants tels que les protéines et les lipides peuvent se déplacer latéralement dans le plan de la membraneplasmatique 5,6,7. La complexité spatiotemporal de l’organisation et de la structure de membrane peut mener à l’hétérogénéité spatiotemporal de l’interaction entre NPs et membrane. Par conséquent, la visualisation directe du mouvement des PN sur la membrane nécessite à la fois une résolution spatiale et temporelle élevée.
La microscopie de suivi des particules individuelles qui surveille la localisation des particules individuelles dans les cellules vivantes avec une résolution spatiale de dizaines de nanomètres et une résolution de temps de millisecondes a été bien développée pour étudier les SNP ou la dynamique des molécules membranaires8,9. Les techniques d’imagerie microscopique à base de fluorescence sont devenues des outils précieux pour l’observation des PN/molécules dans le milieu cellulairevivant 9,10,11,12. Par exemple, la microscopie totale de fluorescence de réflexion interne, qui images couches minces (~100 nm) de l’échantillon à l’interface substrat/solution avec une résolution spatiotemporal élevée a été employée couramment dans des études de la dynamique de molécules de membrane13,14. Cependant, les inconvénients inhérents des fluorophores simples, tels que la faible intensité et le photobleaching irréversible rapide réduisent la précision et la durée du suivi13. Par conséquent, les PN plasmoniques non fluorescents, qui remplacent les sondes fluorescentes, ont attiré de plus en plus l’attention dans les études d’imagerie à long terme en raison de leurs caractéristiques optiques uniques15. Sur la base des signaux de diffusion des sondes plasmoniques de PN, plusieurs types de technologies optiques d’imagerie microscopique ont été utilisés pour étudier le mécanisme des processus biologiques, tels que la microscopie des champs sombres (DFM)16,la microscopie interférométrique de diffusion (iSCAT)17 et la microscopie différentielle de contraste d’interférence (DICM)18. En outre, la dynamique de mouvement et de rotation des AuNRs peut être obtenue à l’aide de DFM et DICM18,19,20,21,22. En règle générale, dans une expérience SPT, le mouvement de l’objet est enregistré par le microscope optique, puis analysé par les méthodes d’analyse SPT3. Les trajectoires et les angles d’orientation résolus dans le temps générés par les PN individuels sont normalement stochastiques et hétérogènes, il est donc nécessaire de présenter des informations dynamiques abondantes avec diverses méthodes d’analyse.
Ici, nous fournissons un protocole intégré qui surveille la dynamique des aunrs sur la membrane cellulaire à l’aide de DFM, extrait l’emplacement et l’orientation des AuNRs avec ImageJ et MATLAB et caractérise la diffusion des AuNRs avec des méthodes d’analyse SPT. En démonstration, nous montrons ici comment utiliser le protocole SPT pour visualiser la dynamique des AuNRs non modifiés (CTAB-AuNRs, synthétisés par la molécule de bromure d’ammonium de cetyltriméthylammonium comme agent protecteur) sur la membrane cellulaire U87 MG. Il a été démontré que les CTAB-AuNRs peuvent adsorb protéines dans l’environnement biologique, se déplacer sur la membrane cellulaire, puis entrer dansles cellules 2,20,22. La cellule U87 MG est la tumeur la plus commune et la plus maligne du système nerveux central, et ses récepteurs membranaires sont anormalement exprimés. Les récepteurs membranaires peuvent interagir avec les protéines des AuNR, qui influencent la dynamique des AuNRs. Notre protocole s’applique généralement à d’autres expériences SPT dans le domaine de la biologie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole présenté est utilisé pour étudier la dynamique des AuNRs sur la membrane cellulaire. Le protocole se compose de quatre parties, y compris l’imagerie microscopique, l’extraction de données, le calcul des paramètres dynamiques et les méthodes d’analyse des données, et chaque partie est flexible et universelle. Par conséquent, il existe de nombreuses applications futures possibles, par exemple, l’étude du mouvement des molécules membranaires liées à la PN sur la membrane, la dynamique endoc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été soutenus par la National Natural Science Foundation of China avec des subventions de 21425519, 91853105 et 21621003.
Materials
| CTAB coated gold nanorods(CTAB-AuNRs) | Nanoseedz | NR-40-650 | 85 nm * 40 nm |
| Color CMOS camera | Olympus | DP74 | Japan |
| Coverslips | Citoglas | z10212222C | 22*22 mm |
| Dark-field microscopy | Nikon | 80i | upright microscope |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10099141 | |
| Fiji | National Institutes of Health | 2.0.0-rc-69/1.52 p | a distribution of ImageJ |
| Grooved glass slide | Sail brand | 7103 | Single concave |
| Image J | National Institutes of Health | 1.52 j | |
| MATLAB | MathWorks | R2019b | |
| MATLAB Code | https://github.com/fenggeqd/JOVE-2020 | ||
| Minimum essential medium (MEM) | Gibco | 10-010-CVR | with phenol red |
| Minimum essential medium (MEM) | Gibco | 51200038 | no phenol red |
| Origin | OriginLab | Origin Pro 2018C | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Plastic cell culture dishes | Falcon | 353002 | |
| Plastic cell culture dishes | Falcon | 353001 | 35*10 mm |
| U87 MG cell | American Type Culture Collection | ATCC HTB-14 | a human primary glioblastoma cell line |
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