단일 나노 입자 암장 현미경 검사를 사용하여 세포 막에 금 나노로드의 확산 역학 시각화
Summary
여기서, 우리는 세포막에 금 나노로드 (AuNRs)의 역학을 감시하기 위하여 전통적인 암장 현미경 검사법의 사용을 보여줍니다. 단일 AuNR의 위치와 방향은 ImageJ 및 MATLAB을 사용하여 감지되며 AuNRs의 확산 상태는 단일 입자 추적 해석을 특징으로 합니다.
Abstract
세포막에 나노 입자의 확산 역학을 분석하는 것은 세포 섭취 과정을 더 잘 이해하는 데 중요한 역할을하며 나노 의학 전달의 합리적 설계를위한 이론적 근거를 제공합니다. 단일 입자 추적(SPT) 분석은 세포막에 개별 나노 입자의 위치와 방향을 조사하고 그들의 번역 및 회전 상태를 나타낼 수 있었습니다. 여기에서, 우리는 살아있는 세포막에 금 나노로드 (AuNRs)의 역학을 감시하기 위하여 전통적인 암장 현미경 검사를 사용하는 방법을 보여줍니다. 또한 ImageJ 및 MATLAB을 사용하여 AuN의 위치와 방향을 추출하는 방법과 AuNR의 확산 상태를 특성화하는 방법을 보여줍니다. 수백 개의 입자의 통계 적 분석은 단일 AuNRs가 U87 MG 세포막의 표면에 브라운 운동을 수행한다는 것을 보여줍니다. 그러나 개별 적인 긴 궤적 분석은 AuNRs가 멤브레인, 즉 장거리 운송 및 제한된 면적 감금에 두 가지 유형의 모션 상태를 가지고 있음을 보여줍니다. 우리의 SPT 방법은 잠재적으로 다른 생물학적 세포에 있는 표면 또는 세포내 입자 확산을 연구하기 위하여 이용될 수 있고 복잡한 세포 기계장치의 조사를 위한 강력한 공구가 될 수 있습니다.
Introduction
멤브레인상 나노입자(NPs)의 역학은 세포 기능, 바이러스 또는 세균 감염 및 인공 나노 의료 전달 시스템의 개발에 필수적인 세포 섭취 과정과 밀접한 관련이 있다1,2. 단일 입자 추적(SPT) 기술은 NPs3,4의이기종 동작을 특성화하는 강력한 도구이다. 일반적으로, 세포막은 단백질 및 지질과 같은 성분이 혈장 막평면5,6,7에서측면으로 이동할 수 있음을 의미하는 유체이다. 멤브레인 조직과 구조의 현면복잡성은 NP와 멤브레인 간의 상호 작용의 현면적 이질성으로 이어질 수 있다. 따라서 멤브레인에서 의한 NPs 의 움직임을 직접 시각화하려면 높은 공간 및 시간적 해상도가 필요합니다.
수십 나노미터의 공간 분해능과 밀리초의 시간 분해능을 가진 살아있는 세포에서 개별 입자의 국소화를 모니터링하는 단일 입자 추적 현미경 검사법은 NPs 또는 멤브레인 분자 역학8,9를연구하기 위해 잘 개발되었다. 형광계 현미경 이미징 기술은 살아있는 세포 환경에서 NPs/분자를 관찰하기 위한 귀중한도구가 되었다9,10,11,12. 예를 들어, 높은 스피처럴 분해능을 가진 기판/용액 인터페이스에서 시료의 얇은 층(~100nm)을 이미지하는 총 내부 반사 형광 현미경검사법은 멤브레인 분자 역학13,14의연구에 널리 사용되고 있다. 그러나, 낮은 강도및 신속한 돌이킬 수 없는 광표백과 같은 단일 형광의 내재된 단점은추적13의정확도와 지속시간을 감소시다. 따라서 형광 프로브를 대체하는 비형성 플라스모닉 PPs는 독특한 광학특성(15)으로인해 장기 이미징 연구에서 점점 더 많은 관심을 받고 있다. 플라스모닉 NP 프로브의 산란 신호에 기초하여, 여러 종류의 광학 현미경 이미징 기술은 암야 현미경 검사법(DFM)16,간섭 성 산란(iSCAT) 현미경 검사법(DICM)18과같은 생물학적 과정의 메커니즘을 연구하기 위해 사용되어 왔다. 또한, AuNRs의 동작 및 회전 역학은 DFM 및 DICM18,19,20,21,22를사용하여 얻을 수 있다. 전형적으로, SPT 실험에서, 물체의 움직임은 광학 현미경에 의해 기록된 다음 SPT 분석 방법3에의해 분석된다. 개별 NP에 의해 생성된 시간 해결 궤적 및 방향 각도는 일반적으로 스토카스틱및 이기종이므로 다양한 분석 방법으로 풍부한 동적 정보를 제시할 필요가 있습니다.
여기서는 DFM을 사용하여 세포막에 대한 AuNRs의 역학을 모니터링하고 ImageJ 및 MATLAB을 사용하여 AuNRs의 위치와 방향을 추출하고 SPT 분석 방법으로 AuNRs의 확산을 특징으로하는 통합 프로토콜을 제공합니다. 시연으로, 우리는 U87 MG 세포막에 수정되지 않은 AuNRs (CTAB-AuNRs, 보호 에이전트로 cetyltrimelammonium 암모늄 브로마이저 분자에 의해 합성)의 역학을 시각화하기 위해 SPT 프로토콜을 사용하는 방법을 여기에 보여줍니다. CTAB-AuNRs가 생물학적 환경에서 단백질을 흡착하고 세포막으로 이동한 다음 세포2,20,22를입력할 수 있음을 입증하였다. U87 MG 세포는 중추 신경계의 가장 일반적이고 가장 악성 종양이며, 그 막 수용체는 비정상적으로 발현된다. 멤브레인 수용체는 AuNRs의 역학에 영향을 미치는 AuNRs의 단백질과 상호 작용할 수 있습니다. 우리의 프로토콜은 일반적으로 생물학 분야의 다른 SPT 실험에 적용됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
제시된 프로토콜은 세포막에 AuNRs의 역학을 연구하기 위하여 이용됩니다. 이 프로토콜은 현미경 이미징, 데이터 추출, 동적 매개 변수 계산 및 데이터 분석 방법을 포함한 4개의 부분으로 구성되어 있으며 각 부품은 유연하고 보편적입니다. 따라서, 예를 들어, 멤브레인에 NP 연결 멤브레인 분자의 움직임을 연구하는 많은 가능한 미래의 응용 프로그램, NP 라벨 수용체의 내분비역학, 세포 내 NPs및 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 21425519, 91853105 및 21621003의 보조금 번호로 중국의 국립 자연 과학 재단에 의해 지원되었다.
Materials
| CTAB coated gold nanorods(CTAB-AuNRs) | Nanoseedz | NR-40-650 | 85 nm * 40 nm |
| Color CMOS camera | Olympus | DP74 | Japan |
| Coverslips | Citoglas | z10212222C | 22*22 mm |
| Dark-field microscopy | Nikon | 80i | upright microscope |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10099141 | |
| Fiji | National Institutes of Health | 2.0.0-rc-69/1.52 p | a distribution of ImageJ |
| Grooved glass slide | Sail brand | 7103 | Single concave |
| Image J | National Institutes of Health | 1.52 j | |
| MATLAB | MathWorks | R2019b | |
| MATLAB Code | https://github.com/fenggeqd/JOVE-2020 | ||
| Minimum essential medium (MEM) | Gibco | 10-010-CVR | with phenol red |
| Minimum essential medium (MEM) | Gibco | 51200038 | no phenol red |
| Origin | OriginLab | Origin Pro 2018C | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Plastic cell culture dishes | Falcon | 353002 | |
| Plastic cell culture dishes | Falcon | 353001 | 35*10 mm |
| U87 MG cell | American Type Culture Collection | ATCC HTB-14 | a human primary glioblastoma cell line |
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