Summary
Presentiamo un metodo in vitro ad alta produttività per quantificare la deposizione polmonare regionale a livello di lobo utilizzando modelli polmonari stampati in 3D derivati dalla TAC con profili di flusso d'aria tonnibili.
Abstract
Lo sviluppo di terapie mirate per le malattie polmonari è limitato dalla disponibilità di metodi di test preclinici con la capacità di prevedere l'erogazione regionale di aerosol. Sfruttando la stampa 3D per generare modelli polmonari specifici del paziente, descriviamo la progettazione di una configurazione sperimentale in vitro ad alta produttività per quantificare la deposizione polmonare lobulare. Questo sistema è realizzato con una combinazione di componenti stampati in commercio e stampati in 3D e consente di controllare in modo indipendente la portata attraverso ogni lobo del polmone. La consegna di aerosol fluorescenti a ciascun lobo viene misurata utilizzando la microscopia a fluorescenza. Questo protocollo ha il potenziale per promuovere la crescita della medicina personalizzata per le malattie respiratorie attraverso la sua capacità di modellare una vasta gamma di dati demografici dei pazienti e stati di malattia. Sia la geometria del modello polmonare stampato in 3D che l'impostazione del profilo del flusso d'aria possono essere facilmente modulate per riflettere i dati clinici per pazienti con età, razza e sesso variabili. I dispositivi di somministrazione dei farmaci clinicamente rilevanti, come il tubo endotracheale mostrato qui, possono essere incorporati nella configurazione del test per prevedere in modo più accurato la capacità di un dispositivo di indirizzare l'erogazione terapeutica in una regione masabile del polmone. La versatilità di questa configurazione sperimentale permette di personalizzarla per riflettere una moltitudine di condizioni di inalazione, esaltando il rigore dei test terapeutici preclinici.
Introduction
Molte malattie polmonari come il cancro ai polmoni e la broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO) presentano differenze regionali nelle caratteristiche della malattia; tuttavia, mancano tecniche terapeutiche disponibili per indirizzare la somministrazione di farmaci solo alle regioni masmato del polmone1. Molteplici modelli di fluidodinamica computazionale (CFD) hanno dimostrato che è possibile modulare i profili di deposizione dei farmaci identificando specifiche snellenel polmone 2,3. Nello stesso laboratorio sono in corso lo sviluppo di inalatori e adattatori per tubi endotracheali (ET) con capacità di targeting regionali per controllare la distribuzione di aerosol nelle regioni polmonari mante. L'estensione di questi principi all'uso clinico è limitata dall'attuale capacità di test preclinici. La posizione precisa in cui un farmaco si deposita all'interno del polmone è nota per essere il miglior predittore di efficacia; tuttavia, le attuali valutazioni farmaceutiche delle terapie inalabili sono più spesso previste utilizzando correlazioni in vitro-in vivo della dimensione delle particelle per approssimare semplicemente la deposizione4. Questa tecnica non consente alcuna analisi spaziale per determinare gli effetti delle diverse geometrie delle vie aeree sulla distribuzione regionale attraverso i vari lobi del polmone. Inoltre, questo test manca di geometrie polmonari anatomicamente accurate, che i ricercatori hanno dimostrato possono avere un impatto significativo sui profili di deposizione5. Sono stati compiuti alcuni sforzi per incorporare geometrie polmonari specifiche del paziente nei protocolli di prova attraverso l'aggiunta delle vie aeree superiori; tuttavia, la maggior parte di questi approcci campiona l'erogazione di aerosol a varie generazioni del polmone piuttosto che a ciascun lobopolmonare 6,7,8. Il seguente protocollo presenta un metodo ad alta produttività per generare modelli polmonari specifici del paziente con la capacità di quantificare la deposizione relativa di particelle in ciascuno dei cinque lobi delpolmone 9.
I polmoni modello anatomicamente accurati sono generati dalla stampa 3D di scansioni di tomografia computerizzata (CT) del paziente. Se utilizzate in combinazione con un sistema di flusso facilmente assemblabile, le portate relative attraverso ciascuno dei lobi del polmone modello possono essere controllate in modo indipendente e su misura per imitare quelle di diversi stati demografici e / o di malattia del paziente. Con questo metodo, i ricercatori possono testare l'efficacia di potenziali metodi terapeutici in una geometria polmonare rilevante e correlare le prestazioni di ogni metodo con la progressione della morfologia masabile. Qui, due progetti di dispositivi sviluppati nel nostro laboratorio vengono testati per la loro capacità di aumentare la deposizione in un lobo polmonare desiderato controllando la posizione del rilascio di aerosol in bocca o trachea. Questo protocollo ha anche il potenziale per influire in modo significativo sullo sviluppo di procedure personalizzate per i pazienti facilitando la rapida previsione dell'efficacia del trattamento in un polmone modello specifico per i dati di TAC di quel paziente.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparazione di componenti sperimentali stampati in 3D
NOTA: Tutti i software utilizzati nel protocollo sono indicati nella Tabella dei Materiali. Inoltre, il software di affezione utilizzato è specifico della stampante 3D elencata nella tabella dei materiali; tuttavia, questo protocollo può essere esteso a una vasta gamma di stampanti 3D stereolitografiche (SLA).
- Convertire le scansioni CT del paziente in oggetti 3D (file stl).
NOTA: Per una discussione più dettagliata delle caratteristiche geometriche del modello polmonare specifico utilizzato in questi studi, fare riferimento a Feng etal.- Eseguire il rendering delle scansioni CT in un oggetto 3D utilizzando il software di scansione CT (vedere Table of Materials). Aprire la tac e creare una maschera sullo spazio aereo utilizzando lo strumento Soglia con un'impostazione nell'intervallo da -800 a -1000. Utilizzando lo strumento Anteprima 3D, visualizzare il rendering 3D ed esportare l'oggetto (File | Export) come file stl.
- Importazione dei file nel software di modifica mesh (vedere Table of Materials), rimuovere eventuali feature frastagliate utilizzando lo strumento Seleziona(Sculpt | Pennelli: "Shrink/Smooth" | Proprietà: Resistenza (50), Dimensione (10), Profondità(0)). Smussare la superficie (CTRL+A | Deformazione | Liscio | Smussatura (0,2), scala di smussatura (1)).
- Nel software di modifica mesh, estendere la parete di questi oggetti di 2 mm(CTRL+A | Modifica | Offset) e consentire all'oggetto interno di rimanere vuoto in modo che rimanga solo il muro. Sezionare l'oggetto( Selezionare | Modifica | Plane Cut) alla trachea per formare un'ingresso e alle generazioni 2 o 3 in cui l'oggetto si dirama in ogni lobo per creare prese (Figura 1A).
NOTA: Lo spessore di 2 mm è stato scelto in base alle dimensioni di feature accettabili specificate dal produttore della stampante 3D elencata nella tabella dei materiali. Questo spessore può essere regolato in base alle specifiche della stampante 3D disponibile se viene mantenuta la geometria interna del modello.
- Modificare le geometrie di uscita del modello polmonare del paziente in modo che siano compatibili con i componenti del tappodi uscitadel lobo precedentemente progettati ( Figura 1B,C) elencati nella tabella dei materiali.
- Importare l'oggetto 3D, che replica la TAC all'interno, ha uno spessore della parete di 2 mm ed è aperto all'ingresso e alle uscite, in un software di modellazione 3D (vedere Table of Materials) come corpo solido(Open | File mesh | Opzioni | Corpo solido).
- Creare un piano basato su una faccia in ciascuna delle prese(inserire | Geometria di riferimento | Piano). Utilizzando lo strumento di giunzione, tracciate la parete interna e la parete esterna dell'uscita in uno schizzo sul piano(Sketch | Spline).
- Loft un cilindro (OD 18,5 mm, ID 12,5 mm, H 15,15 mm) per collegarsi alla parete interna ed esterna del modello, estendendo così la presa per essere uniforme ad ogni lobo(Caratteristiche | Lofted Boss/Base). Aggiungete una tacca attorno al bordo della presa in modo che corrisponda al cappuccio(Feature | Taglio estruso | Offset).
NOTA: Il cappuccio (Figura 1D) è un cilindro cavo che corrisponde alle dimensioni delle prese e ha un ripiano che si collega alla tacca dell'uscita del modello. Un'estremità del cappuccio è bloccata in modo tale che l'ID sia più piccolo del resto della parte, ciò garantisce una vestibilità aderente intorno alla connessione del tubo spinato (Figura 1E). La connessione del tubo spinato è una forma a cono spinato tale che la spina si adatta attraverso l'apertura del cappuccio, ma il resto della parte no, consentendo alla connessione del tubo di adattarsi saldamente al cappuccio. Pertanto, il cappuccio si adatta strettamente sia alla connessione del tubo spinato che al modello polmonare(Figura 1F,G). - Modificare l'ingresso del modello polmonare a seconda delle condizioni sperimentali desiderate. La gola e le regioni gngole possono essere incluse per imitare un paziente che può respirare da solo (Figura 1B). Le regioni sopra la trachea possono essere rimosse utilizzando un taglio estruso per imitare un paziente intubato sul supporto del ventilatore(caratteristiche | Taglio estruso(Figura 1C).
- Orientare e supportare componenti sperimentali nel software di affezione fornito dal produttore della stampante 3D.
- Importare file di parti 3D nel software di affezione della stampante 3D e scegliere la resina appropriata. Utilizzare una resina dura per stampare i modelli polmonari e le connessioni dei tubi spinati e una resina morbida per stampare i tappi.
NOTA: La resina utilizzata per la stampa dei tappi deve avere proprietà elastiche per consentirgli di allungarsi sopra l'uscita del lobo e creare una tenuta ermetica. - Impostare l'orientamento della parte in modo che tutti i volumi "isole" e non inventati siano ridotti al minimo. Il miglior orientamento per i modelli polmonari è con le prese di lobo rivolte lontano dalla piattaforma di stampa. Assicurarsi che sia i collegamenti dei tubi spinati che i tappi abbiano le porzioni più larghe rivolte verso la piattaforma di stampa.
NOTA: le singole fette possono essere visualizzate per verificare l'aspetto delle "isole", sezioni della parte che appaiono per la prima volta in una fetta senza essere collegate al corpo principale della parte. La funzione di revisione può essere utilizzata per verificare la presenza di fette con volumi nonvented, aree in cui la resina non polimerizzata può rimanere intrappolata all'interno della parte durante la stampa. Sia i volumi "isole" che i volumi non inventati riducono la qualità di stampa e potrebbero causare errori di stampa. - Visualizzando ogni fetta singolarmente, aggiungere supporti a tutte le "isole" rimanenti nella parte e a tutte le aree con sporgenze significative. Esportare e visualizzare le sezioni per la stampa per verificare che tutte le aree siano supportate correttamente.
- Importare file di parti 3D nel software di affezione della stampante 3D e scegliere la resina appropriata. Utilizzare una resina dura per stampare i modelli polmonari e le connessioni dei tubi spinati e una resina morbida per stampare i tappi.
- Stampare componenti sperimentali e post-elaborazione completa secondo le istruzioni del produttore.
NOTA: tutte le fasi di post-elaborazione descritte di seguito sono specifiche della stampante 3D elencata nella tabella dei materiali. Quando si utilizzano stampanti o materiali alternativi, regolare questi passaggi per riflettere le istruzioni del produttore.- Per le parti stampate in resina morbida, lavare con alcool isopropile di purezza ≥99% (IPA) per rimuovere la resina non polimerizzata in eccesso e la cura termica in un forno a convezione per 8 ore secondo le specifiche del produttore.
NOTA: Le parti stampate in resina morbida possono essere molto delicate immediatamente dopo la stampa, quindi è necessario prestare particolare attenzione durante le fasi di pulizia. L'esposizione all'IPA deve essere mantenuta al di sotto del limite di esposizione del materiale al solvente per prevenire la degradazione delle parti. - Per le parti stampate in resina dura, lavare con IPA per rimuovere la resina non polimerizzata in eccesso e polimerizzare in un forno UV (365 nm di luce a 5-10 mW / cm2) per 1 minuto per lato.
NOTA: Per valutare l'accuratezza della replica stampata in 3D, si consiglia di utilizzare la scansione μCT della parte stampata e del software di scansione CT per confrontare, quantitativamente, le variazioni tra il rendering 3D originale e la replica stampata in 3D.
- Per le parti stampate in resina morbida, lavare con alcool isopropile di purezza ≥99% (IPA) per rimuovere la resina non polimerizzata in eccesso e la cura termica in un forno a convezione per 8 ore secondo le specifiche del produttore.
2. Montaggio del sistema di tubi per il controllo della portata
- Avvitare raccordi a tubo spinato da 1/4" sul lato del collettore con 6 porte(Figura 2A-6) e un tubo spinato da 3/8" che si adatta alla porta rimanente.
- Tagliare i tubi da 1/4" alle lunghezze desiderate e inserirli in ciascuna estremità delle valvole push-to-connect(Figura 2A-5). Collegare ogni valvola a uno dei raccordi da 1/4" inseriti nel collettore.
- Collegare un misuratore di portata( Figura 2A-4) all'altra estremità di ogni valvola.
- Posizionare il sistema di tubi sopra la tavola di legno in modo che il raccordo singolo da 3/8" del collettore si estenda oltre il bordo della tavola. Per fissare in posizione, aggiungere due viti sul lato della tavola di legno e fissare il collettore alle viti utilizzando il filo.
- Aggiungere quattro viti posizionate attorno a ciascuna delle valvole e dei misuratori di portata e utilizzare il filo per fissare ciascuna di esse alla tavola di legno (Figura 2E).
- Con circa 6" di tubi ID da 3/8", collegare il collettore a un filtro di grado vuoto in linea da 0,1 μm. Collegare l'altra estremità del filtro al controller di flusso utilizzando altri tubi ID da 6" da 3/8"
NOTA: Il sistema di tubi deve essere assemblato una sola volta.
3. Assemblaggio di tappi di uscita per lobi con modello polmonare paziente
NOTA: Questa parte del protocollo deve essere completata prima di ogni esecuzione sperimentale.
- Inserire la connessione del tubo spinato nel cappuccio con l'ugello sporgente attraverso l'apertura nella base del cappuccio. Per prima cosa, inserire un'estremità della base di connessione del tubo spinato ovale nel cappuccio. Quindi, allungare con cura il cappuccio flessibile sull'altra estremità della base ovale, facendo particolare attenzione a non rompere la base sottile.
NOTA: I tappi appena stampati possono essere più rigidi del desiderato e possono essere allungati eseguendo due dita lungo l'interno del cappuccio. - Tagliare la carta filtrante da 10 μm in modo che sia leggermente più grande dell'area di uscita. Piegare la carta filtrante sopra l'uscita del lobo e tenerla in posizione con una mano.
- Con l'altra mano, utilizzare le pinzette per allungare il cappuccio con la connessione del tubo spinato sopra l'uscita. Premere il cappuccio verso il basso fino a quando la tacca del cappuccio corrisponde alla tacca corrispondente sulla presa del lobo (Figura 2C).
NOTA: Strappare la carta da filtro in questo passaggio può invalidare i risultati, quindi è necessario prestare particolare attenzione per evitare una forza eccessiva quando si preme il tappo sull'uscita. - Ripetere per tutte le uscite di lobi rimanenti (Figura 2D).
4. Generazione di profilo del flusso d'aria clinicamente rilevante
NOTA: Questa parte del protocollo deve essere completata prima di ogni esecuzione sperimentale.
- Collegare ogni uscita del lobo del modello polmonare al tubo del misuratore di portata e della valvola corrispondenti, facendo attenzione a non applicare troppa pressione laterale alla connessione del tubo spinato. Collegare il misuratore di portata elettronico all'ingresso della bocca del modello polmonare per misurare la portata totale dell'aria al modello polmonare.
- Accendere il controller di flusso(Figura 2A-7) e la pompa per vuoto (Figura 2A-8). Selezionare l'impostazione "test setup" sul controller di flusso e aumentare lentamente la portata fino a quando il misuratore di portata elettronico non visualizza la portata totale desiderata.
- Utilizzando le valvole(Figura 2E-5), regolare la portata attraverso ciascuno dei cinque lobi polmonari: Superiore destro (RU), Centro destro (RM), Destra inferiore (RL), Sinistra Superiore (LU) e Sinistra Inferiore (LL). Una volta che le portate del lobo mostrate sui misuratori di portata (Figura 2E-4) sono costanti al valore desiderato, controllare nuovamente la portata complessiva sul misuratore di portata elettronico per verificare che non vi siano perdite nel sistema.
- Se c'è una discrepanza nella portata totale, abbassare la portata con il controller di flusso, impostare tutte le valvole sulla configurazione completamente aperta e ripetere i passaggi 4.2 e 4.3.
NOTA: I risultati qui presentati sono stati ottenuti utilizzando profili di flusso d'aria basati sui dati riportati da Sul etal. I risultati sono presentati per due distinte condizioni di flusso, entrambe ad una portata di ingresso complessiva di 1 L/min. Il profilo di flusso di uscita del lobo polmonare sano viene distribuito ad ogni uscita dalla seguente percentuale del flusso di ingresso: LL-23,7%, LU-23,7%, RL-18,7%, RM-14,0%, RU-20,3%. Il profilo di flusso di uscita del lobo COPD è distribuito tra ogni uscita dalla seguente percentuale del flusso di ingresso: LL-10,0%, LU-29,0%, RL-13,0%, RM-5,0%, RU-43,0%9,10.
- Se c'è una discrepanza nella portata totale, abbassare la portata con il controller di flusso, impostare tutte le valvole sulla configurazione completamente aperta e ripetere i passaggi 4.2 e 4.3.
- Uscire dalla funzione di" configurazione diprova " del controller di flusso, ma lasciare la pompa del vuoto in funzione.
NOTA: Spegnere la pompa per vuoto tra l'impostazione delle portate e l'esecuzione dell'esperimento di deposizione può causare imprecisioni nel profilo di flusso generato. Si consiglia di lasciare la pompa per vuoto su una volta impostate le portate desiderate per completare il test di deposizione dell'aerosol.
5. Consegna di aerosol al modello polmonare
NOTA: Gli esperimenti devono essere eseguiti in una cappa aspirante con la fascia chiusa per ridurre al minimo l'esposizione a eventuali aerosol generati dal nebulizzatore.
- Riempire il nebulizzatore con la soluzione delle particelle fluorescenti desiderate (Figura 2A-1) e connettersi all'ingresso del modello polmonare (Figura 2B).
NOTA: I risultati qui presentati sono stati ottenuti utilizzando 30 mL di una diluizione di 1:100 di particelle di polistirolo fluorescente da 1 μm nel metanolo.- Per convalidare la configurazione sperimentale, collegare il nebulizzatore direttamente all'ingresso del modello polmonare senza alcun dispositivo di targeting.
- Per misurare l'efficacia di un dispositivo di targeting, collegare il nebulizzatore al dispositivo e inserire il dispositivo nel modello polmonare.
- Collegare la linea dell'aria compressa al nebulizzatore e chiudere il più possibile la fascia del cofano dei fumi.
- Impostare il controller di flusso in modo che sia eseguito per una versione di prova di 10 s. Prima di premere start, aprire leggermente la valvola ad aria compressa per iniziare a generare un aerosol all'interno del nebulizzatore.
- Premere start sul controller di flusso e aprire immediatamente completamente la valvola ad aria compressa. Una volta che il regolatore di flusso raggiunge circa 9 s, iniziare a chiudere la valvola ad aria compressa.
- Una volta che la valvola dell'aria compressa è completamente chiusa, scollegare il nebulizzatore dalla linea dell'aria compressa, chiudere completamente la fascia del cofano dei fumi, spegnere la pompa del vuoto e lasciare che eventuali aerosol sgombro dalla cappa dei fumi per circa 10 minuti.
NOTA: È importante spegnere la pompa del vuoto dopo aver completato una corsa per evitare che si costruisci un vuoto all'interno del sistema di tubi. - Dopo aver atteso una quantità sufficiente di tempo, scollegare il modello polmonare dal sistema di tubi, facendo particolare attenzione a non rompere le connessioni dei tubi spinati.
- Rimuovere i tappi di uscita del lobo eseguendo un paio di pinzette sotto il bordo del cappuccio e sollevandolo delicatamente dal modello polmonare.
- Rimuovere la carta filtrante dal cappuccio e posizionarla in una piastra di 24 po' con il lato su cui si depositano le particelle essendo sul fondo rivolto verso il pozzo della piastra. Ripetere per le uscite rimanenti ed etichettare il pozzo corrispondente a ciascun lobo.
NOTA: Per evitare che qualsiasi deposizione residua di particelle influisa su esperimenti successivi, è importante risciacquare sia il modello polmonare che i componenti del cappuccio con IPA o solvente appropriato tra una tira e l'altra. Questo può essere raccolto e incluso nell'analisi come desiderato. Inoltre, viene mantenuto un registro per garantire che tutte le repliche utilizzate siano state minimamente esposte all'IPA per mantenere l'integrità delle parti e si consiglia l'ispezione visiva delle parti prima dell'uso.
6. Imaging della carta da filtro outlet
- Posizionare la piastra del pozzo nel microscopio a fluorescenza digitale e impostare il microscopio su un ingrandimento 4x e l'appropriato canale di fluorescenza.
- Identificare visivamente quale carta filtrante del lobo ha la più alta quantità di deposizione di particelle e utilizzare la funzione "Auto Expose". Prendere nota dei valori di esposizione e tempo di integrazione risultanti.
- Applicare questa esposizione a tutti i filtri per la corsa e valutare se l'impostazione produce un'immagine soddisfacente per tutte le aree ad alta deposizione dei filtri.
NOTA: le impostazioni di messa a fuoco possono essere modificate da filtro a filtro; tuttavia, tutti i filtri per una determinata esecuzione devono essere analizzati con le stesse impostazioni di esposizione. È possibile avere un solo fotogramma di messa a fuoco alla volta, quindi piegamenti o strappi nella carta filtrante possono impedire che tutte le particelle depositate nella vista siano a fuoco. Questo può essere evitato assicurando che la carta filtrante sia piatta contro la parte inferiore della piastra del pozzo. - Scatta almeno tre immagini della carta filtrante di ogni lobo in posizioni casuali e salva come .tiff file.
7. Quantificazione della deposizione di particelle
- Importare tutte le immagini di carta da filtro per una determinata esecuzione in una sessione ImageJ.
- Modificare il tipo di ogni immagine in 8 bit selezionando Immagine | Digitare | 8 bit.
- Aprire l'immagine con la fluorescenza più alta e selezionare Immagine | Regolare | Soglia per aprire una finestra di soglia. Regolare i valori soglia per ridurre al minimo il segnale di fondo dalla carta filtrante e definire chiaramente i bordi delle particelle. Cfr. figura 3 per le rappresentazioni di soglie di buona qualità e di scarsa qualità.
NOTA: Per i filtri con alti livelli di deposizione, si può osservare una "corona" di fluorescenza, causata dalla diffrazione della luce da parte delle fibre di carta filtrante, attorno a grandi raggruppamenti di particelle. Quando si thresholding queste immagini, un intervallo troppo grande visualizza punti piccoli o forme "simili a piume" intorno a questi raggruppamenti, come osservato nelle immagini di soglia "scadenti" nella figura 3. Questo può essere migliorato aumentando gradualmente il limite inferiore della soglia fino a quando il segnale proveniente dalle fibre di carta filtrante non viene ridotto al minimo senza oscurare il segnale dalle particelle stesse. - Propagare le impostazioni di soglia per l'immagine a fluorescenza più alta a tutte le altre immagini.
- Quantificare il numero di particelle e l'area fluorescente totale selezionando Analizza | Analizzare le particelle.
NOTA: i set di dati vengono confrontati utilizzando il test di confronto multiplo di Sidak e un ANOVA a due modi. Inoltre, la deposizione solo nel lobo di interesse viene confrontata utilizzando un test T dello studente assumendo la stessa varianza.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Particelle in questo intervallo di dimensioni (1-5 μm) e condizioni di flusso (1-10 L/min) seguono le linee del flusso fluido in base sia al loro numero teorico di Stokes che ai dati in vivo; pertanto, in assenza di un dispositivo di consegna mirato, le particelle rilasciate nel modello polmonare dovrebbero depositarsi in base alla percentuale del flusso d'aria totale dirottato su ciascun lobo. Le quantità relative di consegna di particelle a ciascun lobo possono quindi essere confrontate con i dati clinici sulla portata del lobo ottenuti analizzando le scansioni della tomografia computerizzata ad alta risoluzione (HRCT) specifiche del paziente10. Un set-up sperimentale convalidato produrrà un profilo di deposizione di particelle non mirato che non ha differenze statisticamente significative dal profilo clinico del flusso d'aria. I dati di convalida sono presentati per due distinte condizioni di flusso: 1 L/min in un polmone sano (Figura 4A) e 1 L/min in un polmone affetto da BPCO (Figura 4B). In entrambe queste condizioni, il profilo di deposizione determinato sperimentalmente non era statisticamente diverso dai dati clinici, dimostrando che l'insieme imita accuratamente la distribuzione del flusso d'aria a ciascuno dei lobi polmonari. Questi profili di deposizione di base fungevano da controllo rispetto al quale vengono confrontati i profili di deposizione delle particelle mirati.
Per illustrare la capacità di questo protocollo di quantificare i cambiamenti nella deposizione polmonare regionale, sono stati inclusi i dati per la prova di due diversi dispositivi di targeting: un tubo endotracheale (ET) modificato (Figura 5B) e un dispositivo cilindrico concentrico (Figura 5E). Entrambi questi dispositivi presentavano una presa ID da 2 mm con posizione tonnibile per il rilascio mirato delle particelle. Il tubo ET modificato è stato valutato con il modello polmonare intubato per la sua capacità di indirizzare la deposizione di particelle sia nel lobo inferiore sinistro (LL) che nel lobo inferiore destro (RL). Rispetto al profilo di deposizione delle particelle non mirato, questo dispositivo ha generato un aumento quasi quattro volte dell'erogazione del lobo LL (T-test p=0,004, n=3) oltre a deviare oltre il 96% delle particelle consegnate al polmone sinistro (test T p=0,0001, n=3) (Figura 5A). Alterando l'impostazione della posizione di rilascio per la destinazione del lobo RL, questo dispositivo ha generato più del doppio dell'erogazione di particelle al lobo RL (T-test p=0.02, n=3) e ha deviato il 94% delle particelle consegnate al polmone destro (T-test p=0.0005, n=3) (Figura 5C). Ciò indica che il dispositivo ha un grande successo nella produzione della modulazione del profilo di deposizione prevista. Il dispositivo cilindro concentrico è stato testato nel modello polmonare completo con un bersaglio previsto del lobo superiore sinistro (LU). Rispetto al profilo di deposizione delle particelle non mirato, questo dispositivo ha causato un aumento quasi triplicato dell'erogazione del lobo LU (T-test p=0,0003, n=3) oltre a deviare oltre l'87% delle particelle consegnate al polmone sinistro (test T p=0,002, n=3) (Figura 5D). L'efficienza di targeting può anche essere osservata qualitativamente confrontando le immagini del filtro del lobo di destinazione con gli altri filtri di uscita. Come illustrato nella figura 3, il metodo di targeting più efficace produrrà un'elevata deposizione di particelle al lobo di interesse previsto e una bassa deposizione nelle restanti prese di lobo. Per ulteriori dimostrazioni delle capacità di questo protocollo, vedere gli esperimenti eseguiti da Kolewe et al9.
Figura 1: Componenti sperimentali stampati in 3D. (A) Tac del paziente convertita in file di parti 3D utilizzando la TAC e il software di editing mesh. (B) Modello polmonare con modifiche all'uscita del lobo apportate nel software di editing mesh e modellazione 3D. (C) Modello polmonare con ingresso modificato nel software di modellazione 3D per riflettere un paziente intubato. (D) Collegamento di tubi spinati e cappuccio(E)progettato in software di modellazione 3D. (F) Sezione trasversale del modello 3D raffigurante la natura interconnessa delle prese del modello polmonare con il cappuccio e la connessione del tubo spinato. (G) Vista esplosa dell'assemblaggio del tappo di uscita del modello polmonare. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Montaggio di una configurazione sperimentale. (A) Schema di configurazione sperimentale che comprende (1) nebulizzatore, (2) modello polmonare, (3) tappi di uscita, (4) misuratori di portata, (5) valvole, (6) collettore, (7) regolatore di flusso e (8) una pompa per vuoto. (B) Installazione completamente assemblata. (C) Primo dell'uscita del lobo con tappo assemblato. (D) Modello polmonare con tutti i tappi aggiunti. (E) Primo di una rete di tubi per la fissazione delle portate di uscita del lobo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Filtra l'elaborazione delle immagini cartacee. Le immagini grezze presentate sono state raccolte durante un esperimento per colpire il polmone sinistro usando particelle di polistirolo fluorescente da 1 μm a 1 L/min sotto un profilo respiratorio sano. Le immagini di deposizione "alta" e "bassa" raffigurano rispettivamente i filtri LL e RU Lobe. La soglia "buona", applicata con un intervallo da 43 a 255, mantiene i bordi definiti tra le singole particelle ed evita il rilevamento di fibre di carta filtrante. La soglia "scarsa", applicata con un intervallo da 17 a 255, oscura i singoli bordi delle particelle e sovrastima l'area fluorescente del filtro. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Convalida sperimentale dell'installazione. (A) Risultati della convalida per pazienti sani e (B) un paziente affetti da BPCO a 1 L/min. Tutti i dati presentati sono ± SD con tre repliche (ad eccezione dei dati clinici sulla BPCO, in cui è stato segnalato un solo paziente). I dati di riferimento clinici per i pazienti sani e affetti da BPCO sono stati ottenuti da Sul, et al10. I set di dati sono stati confrontati utilizzando il test di confronto multiplo di Sidak e tutte le differenze non sono significative. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Dati di esempio per gli esperimenti mirati. (A) Lobo inferiore sinistro e ( C )Puntamentodel lobo inferiore destro ottenuto utilizzando (B) un sistema di erogazione dei tubi ET modificato. (D) Mira del lobo superiore sinistro ottenuta utilizzando (E) un sistema concentrico di erogazione dei tubi. Per tutti e tre i set di dati, l'anello interno rappresenta il profilo di deposizione non mirato ottenuto durante la convalida dell'installazione e l'anello esterno rappresenta il profilo di deposizione prodotto con l'aggiunta del dispositivo di destinazione indicato. Vengono visualizzati i mezzi di tre repliche per ogni configurazione. I set di dati sono stati confrontati utilizzando il test di confronto multiplo di Sidak e un test T dello studente assumendo la stessa varianza. Tutte e tre le configurazioni hanno prodotto un significativo aumento della consegna al lobo di interesse: LL Lobe (T-test p=0.004, n=3), RL Lobe (T-test p=0.02, n=3) e LU Lobe (T-test p=0.0003, n=3). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
L'attuale dispositivo all'avanguardia per il test farmaceutico polmonare di una dose completa di inalazione è il Next Generator Impactor (NGI), che misura il diametro aerodinamico di un aerosol4. Questi dati di dimensionamento vengono quindi utilizzati per prevedere la generazione polmonare in cui l'aerosol si depositerà sulla base di una correlazione sviluppata per un maschio adultosano 11. Sfortunatamente, questo metodo è limitato nella sua capacità di valutare le differenze nella deposizione polmonare regionale, determinare gli effetti delle condizioni della malattia sull'erogazione farmaceutica e prevedere i profili di deposizione per varie fasce d'età, razze e generi12,13,14. Il protocollo qui delineato ha la capacità di soddisfare queste esigenze di test consentendo ai ricercatori di generare modelli polmonari tonnibili e anatomicamente accurati con la capacità di quantificare la deposizione relativa a livello di lobo, in base al comportamento del flusso del fluido precedentemente dimostrato nei modelli computazionali3,5,15. Utilizzando questo metodo, il dosaggio e la somministrazione farmaceutica possono essere valutati meglio per le geometrie polmonari pediatriche e mas diseased prima di entrare negli studi clinici.
Come mostrato nelle figure 4 e nella figura 5, la deposizione a livello di lobo può essere misurata con precisione e rapidità sia per gli aerosol di inalazione mirati che per i non mirati. In assenza di un dispositivo di puntamento, le particelle in questo intervallo di dimensioni (1-5 μm) e le condizioni di flusso (1-10 L/min) seguono la semplificazione del fluido e il profilo del flusso d'aria totale deviato su ciascun lobo(figura 4). In particolare, vari dispositivi di inalatore e accessori per tubi ET possono essere sviluppati per concentrare i medicinali inalati in luoghi di lobi controllati. Come descritto nel nostro recente lavoro e in quelli di altri, molte caratteristiche del dispositivo inalatore, del profilo di flusso e della geometria delle vie aeree contribuiscono al comportamento di deposizionemirato 2,3,9,16. In generale, un efficiente targeting regionale, come dimostrato dai nostri modelli unici in vitro, richiede una distribuzione stretta delle dimensioni dell'aerosol e basse portate di inalazione per evitare turbolenze delle vie aeree che si trovano specificamente all'interno della trachea. L'inclusione delle vie aeree superiori complete all'interno del nostro modello in vitro consente un'accurata ricreazione di questi modelli di flusso d'aria che sono noti per influenzare la distribuzione a valle a livello di lobo9. A causa di questi flussi complessi, il lavoro recente ha dimostrato un aumento del targeting da sotto il glottide9. I nostri risultati nella figura 5 evidenziano specificamente il vantaggio dell'utilizzo di un adattatore per tubi ET per indirizzare a livello regionale i singoli lobi dal rilascio al di sotto della glottide, con un efficiente targeting specifico per lobi mostrato per i lobi dei polmoni destro e sinistro a efficienze che vanno dal 62 al 74% della dose totale. Ciò rappresenta un aumento rispetto alle efficienze di targeting regionale precedentemente riportate sperimentalmente ed è una strada importante per l'implementazione clinica di questo approccio9. È importante sottolineare che il protocollo consente misurazioni sperimentali della distribuzione dei lobi di un dosaggio farmaceutico completo da una vasta gamma di potenziali dispositivi di targeting regionali oltre a quelli qui dimostrati.
Con solo una TAC, un modello polmonare specifico del paziente può essere stampato rapidamente in 3D per testare un potenziale metodo di somministrazione terapeutica. Questo protocollo non solo fornirà un approccio sperimentale su scala lab per supportare la progettazione di nuovi dispositivi inalatori, ma creerà anche opportunità per dispositivi di inalazione personalizzati su richiesta nella pratica clinica. La resina dura utilizzata in questo protocollo costa ~$0,12/mL; pertanto, gli ospedali con l'infrastruttura di stampa 3D esistente potrebbero stampare un modello polmonare per soli $ 15 neimateriali 17 e assemblare una via aerea personalizzata in meno di un giorno. In particolare, i tempi di stampa e i costi dei materiali nella produzione additiva continuano a diminuire rapidamente, aumentando la fattibilità complessiva di questo approccio. Il nostro set-up sperimentale può essere facilmente modificato per riflettere una serie di condizioni di flusso d'aria utilizzando un diverso modello polmonare o impostazione di distribuzione del flusso d'aria, a seguito della convalida sperimentale mostrata nella figura 4. Le differenze nei profili di flusso polmonare e nelle geometrie dovute a caratteristiche come età, razza e sesso sono ben documentate in letteratura e possono essere prontamente incorporate nel nostro approccio dimodellazione 18,19,20. In particolare, le variazioni geometriche nella laringe, nella faringe e nella trachea dei modelli polmonari possono avere un impatto significativo sul flusso d'aria e sui successivi modelli di deposizioneregionale 15,21,22, che questo protocollo è ben attrezzato per rilevare. Pertanto, l'incorporazione di questo approccio di modellazione personalizzata dovrebbe avere un impatto significativo sullo sviluppo di terapie per inalazione personalizzate.
Qui, le portate del lobo sono state alterate per riflettere quelle di uno stato di malattia copd caratterizzato da una diminuzione del flusso d'aria verso i lobi inferiori (Figura 4B), ma le tac derivate dal paziente COPD potrebbero anche essere utilizzate per imitare più accuratamente l'architettura polmonare mascellata e possibili ostruzioni23. Con una libreria di modelli polmonari del paziente e profili di flusso, gli effetti della progressione della malattia sull'efficienza di consegna possono essere studiati. Esiste una vasta gamma di scansioni open source disponibili presso organizzazioni, come il National Institutes of Health (NIH) e il Cancer Imaging Archive (TCIA)24. Mentre questi modelli attualmente possono replicare la geometria del paziente solo fino alla seconda o terza generazione per misurare adeguatamente la distribuzione a livello di lobo, è in corso il lavoro per sviluppare modifiche che possono incorporare le vie aeree inferiori per un'analisi più dettagliata. Questo protocollo può anche incorporare dispositivi di somministrazione di farmaci clinicamente rilevanti come un tubo ET come descritto nella figura 5B. I ricercatori possono valutare più dispositivi di consegna per rivelare caratteristiche che possono aumentare o diminuire l'efficienza del trattamento. Ad esempio, l'efficacia del targeting viene ridotta quando viene tentata nel modello polmonare completo rispetto al modello polmonare intubato (Figura 5). Questa differenza indica che bypassare la regione gngole evita aree di miscelazione turbolenta che diminuiscono la capacità di targeting.
Questo protocollo è limitato dalla sua incapacità di imitare accuratamente l'interfaccia biologica aria-liquido. Di conseguenza, gli aerosol che normalmente si depositano per impazione inerziale possono invece rimbalzare dalle pareti rigide del modello polmonare25. Per migliorare questo, le direzioni future includono l'esplorazione di modifiche superficiali e rivestimenti per imitare lo strato mucoso dell'epitelio polmonare. Rivestimenti come olio di silicio e glicerina sono stati studiati per la prevenzione del rimbalzo delle particelle in un NGI e potrebbero essere facilmente incorporati nei modelli polmonari stampati in 3D26. Altre tecniche come la biostamma e la lavorazione delle cellule su modelli stampati in 3D sono allo studio per la loro capacità di incorporare una risposta cellulare nel protocollo27. Inoltre, questo protocollo utilizza apparecchiature ottimizzate per portate di 1-15 L/min; in futuro, si potrebbero utilizzare portate più elevate di 30-60 L/min, la gamma normale di portate inspiratorie di picco, spegnendo le valvole di controllo e i misuratori di portata per quelli appropriati per l'intervallo di portatadesiderato 28,29. Con il modello di controller di flusso utilizzato, il sistema è in grado di modellare solo l'ispirazione piuttosto che un ciclo di respirazione ciclico completo. L'incorporazione di modelli respiratori transitori attraverso l'uso di un ventilatore o di un sistema di flusso più complesso migliorerebbe probabilmente l'accuratezza dei risultati sperimentali per quanto riguarda l'efficienza di deposizionedelle particelle 30. Infine, gli esperimenti di deposizione sono stati eseguiti solo con sfere di polistirolo fluorescente monodisperso di dimensioni che vanno da 1 a 5 μm. La quantificazione della deposizione si basa sulla fluorescenza aerosol, quindi l'uso di questo protocollo con aerosol non fluorescenti può richiedere l'incorporazione di un'etichetta fluorescente come l'isotiocianato di fluoresceina (FITC) perl'analisi 31. Tuttavia, potrebbero essere applicate tecniche analitiche aggiuntive per analizzare il filtro a seconda della composizione dell'aerosol, come la cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) e o la spettrometria di massa.
Il nostro protocollo dimostra la prima configurazione sperimentale in vitro con la capacità di quantificare la deposizione polmonare lobulare in una geometria polmonare specifica del paziente. Si prevede che il raggiungimento di una distribuzione controllata a livello di lobi aumenterà l'efficacia terapeutica delle terapie per inalazione, che sarà ottenuta solo attraverso progressi nelle misurazioni in vitro della dose intera. Con il crescente interesse per la medicina personalizzata, questo protocollo ha il potenziale per stimolare lo sviluppo di nuove terapie polmonari mirate consentendo previsioni più accurate della potenziale efficacia del trattamento.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano il professor Yu Feng, la dott.ssa Jenna Briddell, Ian Woodward e Lucas Attia per le loro utili discussioni.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/4" Plastic Barbed Tube Fitting | McMaster Carr | 5372K111 | |
| 10 um Filter Paper | Fisher | 1093-110 | |
| 1um Fluorescent Polystyrene Particles | Polysciences | 15702-10 | |
| 1um Non-Fluorescent Polystyrene Particles | Polysciences | 8226 | |
| 2-Propanol | Fisher | A516-4 | Referred to in protocol as "IPA" |
| 3/8" Plastic Barbed Tube Fitting | McMaster Carr | 5372K117 | |
| Air Flow Meter (1 - 280 mL/min) | McMaster Carr | 41695K32 | Referred to in protocol as "flow meter" |
| Carbon M1 3D Printer | Carbon 3D | https://www.carbon3d.com/, Associated software referred to in protocol as "slicing software" | |
| Collison Jet Nebulizer | CH Technologies | ARGCNB0008 (CN-25) | 6 Jet MRE style horizontal collision with glass jar, Referred to in protocol as "nebulizer", http://chtechusa.com/Manuals/MRE_Collison_Manual.pdf |
| Convection Oven | Yamato | DKN602 | |
| Copley Critical Flow Controller TPK2000 Reve 120V | MSP Corp | 0001-01-9810 | Referred to in protocol as "flow controller" |
| Copley High Capacity Pump Model HCP5 | MSP Corp | 0001-01-9982 | Referred to in protocol as "vacuum pump" |
| Cytation | BioTek | CYT5MPV | Multifunctional Spectrophotometer/Fluorescent imager equiped with 4x/20x/40x objectives and DAPI/GFP/TexasRed laser/filter cubes |
| EPU40 Resin | Carbon 3D | https://www.carbon3d.com/materials/epu-elastomeric-polyurethane/, Referred to in protocol as "soft resin" | |
| Filter for vacuum pump | Whatman | 6722-5000 | |
| Flow Meter Model DFM 2000 | MSP Corp | 0001-01-8764 | Referred to in protocol as "electronic flow meter" |
| ImageJ Software | ImageJ | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| Inline Air Flow Control Valve (Push-to-Connect) | McMaster Carr | 62005K333 | Referred to in protocol as "valve" |
| Inline Filter Devices | Whatman | WHA67225000 | |
| Marine-Grade Plywood Sheet | McMaster Carr | 62005K333 | Referred to in protocol as "wooden board" |
| Materialise Mimics Software | Materialise | https://www.materialise.com/en/medical/mimics-innovation-suite, Referred to in protocol as "CT scan software" | |
| Meshmixer Software | Autodesk | http://www.meshmixer.com/, Referred to in protocol as "mesh editing software" | |
| Methanol | Fisher | A454-4 | |
| Opticure LED Cube | APM Technica | 102843 | Referred to in protocol as "UV oven" |
| PR25 Resin | Carbon 3D | https://www.carbon3d.com/materials/uma-urethanemethacrylate, /Referred to in protocol as "hard resin" | |
| PVC Tube for Chemicals | McMaster Carr | 5231K161 | 1/4" ID |
| Screws | |||
| SolidWorks Software | Dassault Systèmes SolidWorks Corporation | https://www.solidworks.com/, Referred to in protocol as "3D modeling software" | |
| Straight Flow Rectangular Manifold | McMaster Carr | 1125T31 | |
| Tubing to Flow Controller | McMaster Carr | 5233K65 | 3/8" ID |
| Wire |
References
- Goel, A., Baboota, S., Sahni, J. K., Ali, J. Exploring targeted pulmonary delivery for treatment of lung cancer. International Journal of Pharmaceutical Investigation. 3 (1), 8-14 (2013).
- Kleinstreuer, C., Zhang, Z., Li, Z., Roberts, W. L., Rojas, C. A new methodology for targeting drug-aerosols in the human respiratory system. International Journal of Heat and Mass Transfer. 51 (23), 5578-5589 (2008).
- Feng, Y., Chen, X., Yang, M. An In Silico Investigation of a Lobe-Specific Targeted Pulmonary Drug Delivery Method. Design of Medical Devices Conference. , (2018).
- Marple, V. A., et al. Next generation pharmaceutical impactor (a new impactor for pharmaceutical inhaler testing). Part I: Design. Journal of Aerosol Medicine. 16 (3), 283-299 (2003).
- Feng, Y., Zhao, J., Chen, X., Lin, J. An In Silico Subject-Variability Study of Upper Airway Morphological Influence on the Airflow Regime in a Tracheobronchial Tree. Bioengineering. 4 (4), 90 (2017).
- Huynh, B. K., et al. The Development and Validation of an In Vitro Airway Model to Assess Realistic Airway Deposition and Drug Permeation Behavior of Orally Inhaled Products Across Synthetic Membranes. Journal of Aerosol Medicine and Pulmonary Drug Delivery. 31 (2), 103-108 (2018).
- Lizal, F., Elcner, J., Hopke, P. K., Jedelsky, J., Jicha, M. Development of a realistic human airway model. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H: Journal of Engineering in Medicine. 226 (3), 197-207 (2011).
- Wei, X., Hindle, M., Delvadia, R. R., Byron, P. R. In Vitro Tests for Aerosol Deposition. V: Using Realistic Testing to Estimate Variations in Aerosol Properties at the Trachea. Journal of Aerosol Medicine and Pulmonary Drug Delivery. 30 (5), 339-348 (2017).
- Kolewe, E. L., Feng, Y., Fromen, C. A. Realizing Lobe-Specific Aerosol Targeting in a 3D-Printed In Vitro Lung Model. Journal of Aerosol Medicine and Pulmonary Drug Delivery. , (2020).
- Sul, B., et al. Assessing Airflow Sensitivity to Healthy and Diseased Lung Conditions in a Computational Fluid Dynamics Model Validated In Vitro. Journal of Biomechanical Engineering. 140 (5), (2018).
- Martonen, T. B., Katz, I. Deposition Patterns of Polydisperse Aerosols Within Human Lungs. Journal of Aerosol Medicine. 6 (4), 251-274 (1993).
- Nahar, K., et al. In vitro, in vivo and ex vivo models for studying particle deposition and drug absorption of inhaled pharmaceuticals. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 49 (5), 805-818 (2013).
- Nichols, S. C., et al. A Multi-laboratory in Vitro Study to Compare Data from Abbreviated and Pharmacopeial Impactor Measurements for Orally Inhaled Products: a Report of the European Aerosol Group (EPAG). AAPS PharmSciTech. 17 (6), 1383-1392 (2016).
- Yoshida, H., Kuwana, A., Shibata, H., Izutsu, K. I., Goda, Y. Comparison of Aerodynamic Particle Size Distribution Between a Next Generation Impactor and a Cascade Impactor at a Range of Flow Rates. AAPS PharmSciTech. 18 (3), 646-653 (2017).
- Feng, Y., et al. An in silico inter-subject variability study of extra-thoracic morphology effects on inhaled particle transport and deposition. Journal of Aerosol Science. 123, 185-207 (2018).
- Kleinstreuer, C., Seelecke, S. Inhaler system for targeted maximum drug-aerosol delivery. United States patent. , (2005).
- Pietila, T. How Medical 3D Printing is Gaining Ground in Top Hospitals. , Available from: https://www.materialise.com/en/blog/3d-printing-hospitals (2019).
- Weber, P. W., Price, O. T., McClellan, G. E. Demographic Variability of Inhalation Mechanics: A Review. Defense Threat Reduction Agency. , (2016).
- Jiang, Y. Y., Xu, X., Su, H. L., Liu, D. X. Gender-related difference in the upper airway dimensions and hyoid bone position in Chinese Han children and adolescents aged 6-18 years using cone beam computed tomography. Acta Odontologica Scandinavica. 73 (5), 391-400 (2015).
- Martin, S. E., Mathur, R., Marshall, I., Douglas, N. J. The effect of age, sex, obesity and posture on upper airway size. European Respiratory Journal. 10 (9), 2087 (1997).
- Xi, J., Longest, P. W., Martonen, T. B. Effects of the laryngeal jet on nano- and microparticle transport and deposition in an approximate model of the upper tracheobronchial airways. Journal of Applied Physiology. 104 (6), 1761-1777 (2008).
- Zhao, J., Feng, Y., Fromen, C. A. Glottis motion effects on the particle transport and deposition in a subject-specific mouth-to-trachea model: A CFPD study. Computers in Biology and Medicine. 116, 103532 (2020).
- Kim, S. S., et al. Chronic obstructive pulmonary disease: lobe-based visual assessment of volumetric CT by Using standard images--comparison with quantitative CT and pulmonary function test in the COPDGene study. Radiology. 266 (2), 626-635 (2013).
- The Cancer Imaging Archive. , Available from: https://www.cancerimagingarchive.net/ (2020).
- Li, A., Ahmadi, G. Computer Simulation of Deposition of Aerosols in a Turbulent Channel Flow with Rough Walls. Aerosol Science and Technology. 18 (1), 11-24 (1993).
- Khalili, S. F., Ghanbarzadeh, S., Nokhodchi, A., Hamishehkar, H. The effect of different coating materials on the prevention of powder bounce in the next generation impactor. Research in Pharmaceutical Sciences. 13 (3), 283-287 (2018).
- Galliger, Z., Vogt, C. D., Panoskaltsis-Mortari, A. 3D bioprinting for lungs and hollow organs. Translational Research. 211, 19-34 (2019).
- Schwarz, K., Biller, H., Windt, H., Koch, W., Hohlfeld, J. M. Characterization of exhaled particles from the healthy human lung--a systematic analysis in relation to pulmonary function variables. Journal of Aerosol Medicine and Pulmonary Drug Delivery. 23 (6), 371-379 (2010).
- Patton, J. S., Byron, P. R. Inhaling medicines: delivering drugs to the body through the lungs. Nature Reviews Drug Discovery. 6 (1), 67-74 (2007).
- Zhang, Z., Kleinstreuer, C., Kim, C. S. Cyclic micron-size particle inhalation and deposition in a triple bifurcation lung airway model. Journal of Aerosol Science. 33 (2), 257-281 (2002).
- Ju, Y., et al. Engineering of Nebulized Metal-Phenolic Capsules for Controlled Pulmonary Deposition. Advanced Science. 7 (6), 1902650 (2020).
