Summary
CT 스캔 파생, 3D 프린팅 폐 모델을 튜닝 가능한 공기 흐름 프로파일을 사용하여 로브 수준에서 지역 폐 증착을 정량화하는 고처리량, 시험관 내 방법을 제시한다.
Abstract
폐 질환에 대한 표적 치료법의 개발은 지역 에어로졸 전달을 예측할 수 있는 전임상 시험 방법의 가용성에 의해 제한됩니다. 3D 프린팅을 활용하여 환자 전용 폐 모델을 생성하여, 우리는 lobular 폐 증착을 정량화하기 위한 높은 처리량, 시험관 내 실험 설정의 설계를 간략하게 설명합니다. 이 시스템은 시판되는 3D 인쇄 성분의 조합으로 만들어졌으며 폐의 각 엽을 통한 유속이 독립적으로 제어될 수 있게 합니다. 각 엽에 형광 에어로졸의 전달은 형광 현미경 검사를 사용하여 측정된다. 이 프로토콜은 광범위한 환자 인구 통계 및 질병 상태를 모델링하는 능력을 통해 호흡기 질환에 대한 개인화 된 의학의 성장을 촉진 할 수있는 잠재력을 가지고 있습니다. 3D 프린팅 폐 모델의 기하학과 공기 흐름 프로파일 설정은 다양한 연령, 인종 및 성별을 가진 환자를 위한 임상 데이터를 반영하도록 쉽게 변조될 수 있다. 여기에 도시된 엔타락힐 튜브와 같은 임상적으로 관련된 약물 전달 장치는, 폐의 병들 영역으로 치료 전달을 표적으로 하는 장치의 용량을 보다 정확하게 예측하기 위해 시험 설정에 통합될 수 있다. 이 실험 용 설정의 다재다능함은 다양한 흡입 조건을 반영하도록 사용자 정의 할 수 있으며 전임상 치료 테스트의 엄격함을 향상시킵니다.
Introduction
폐암과 만성 폐쇄성 폐질환(COPD)과 같은 많은 폐질환은 질병 특성에 있어서 지역적 차이를 나타낸다. 그러나, 폐1의병들인 부위에만 약물 전달을 표적으로 하는 치료 기술의 부족이 있다. 다중 전산 유체 동적(CFD) 모델은 폐2,3에서특정 유선형을 식별하여 약물 증착 프로파일을 조절할 수 있음을 입증하였다. 지역 타겟팅 기능을 갖춘 흡입기및 엔노트라큐어(ET) 튜브 어댑터의 개발은 병든 폐 부위에 에어로졸 분포를 제어하기 위해 실험실에서 진행되고 있습니다. 임상 사용에 이러한 원칙의 확장은 현재 전임상 테스트 용량에 의해 제한됩니다. 정확한 위치는 폐 내의 약물 침전물이 효능의 가장 좋은 예측변수로 알려져 있습니다. 그러나, 현재 의약학적 평가는 입자 크기의 생체내 상관관계를 단지 근사적 증착4로이용하여 가장 자주 예측된다. 이 기술은 폐의 다양한 엽을 통해 지역 분포에 대한 다른 기도 형상의 효과를 결정하는 공간 분석을 허용하지 않습니다. 추가적으로, 이 시험은 해부학적으로 정확한 폐 기하학이 결여되어, 연구원은 증착 단면도5에중요한 영향을 미칠 수 있는 보여주었습니다. 상부 기도의 추가를 통해 시험 프로토콜에 환자 특정 폐 기하학을 통합하기 위하여 몇몇 노력이 이루어졌습니다; 그러나, 이들 접근법의 대부분은 각 폐로가 아닌 다양한 세대의폐로 에어로졸전달을 6,7,8로시료한다. 다음 프로토콜은 폐9의5개의 엽 각각에서 상대 입자 증착을 정량화할 수 있는 능력을 가진 환자 특이적 폐 모델을 생성하는 고처리량 방법을 제시한다.
해부학적으로 정확한 모형 폐는 3D 프린팅 환자 계산단층 촬영 (CT) 검사에 의해 생성됩니다. 쉽게 조립된 유동 시스템과 함께 사용될 때, 각 모델 폐의 엽을 통한 상대유량은 독립적으로 제어되고 다른 환자 인구 통계 및/또는 질병 상태의 것을 모방하도록 맞춤화될 수 있다. 이 방법을 통해 연구원은 관련 폐 기하학에서 잠재적 인 치료 방법의 효능을 테스트하고 각 방법의 성능을 병들게 형태의 진행과 상관 관계를 맺을 수 있습니다. 여기서, 우리의 실험실에서 개발된 2개의 장치 디자인은 입 또는 기관에서 에어로졸 방출의 위치를 통제하여 원하는 폐 엽에 있는 증착을 증가하는 그들의 기능에 대한 시험됩니다. 이 프로토콜은 또한 환자의 CT 스캔 데이터에 특정한 모형 폐에 있는 처리 효험의 급속한 예측을 촉진해서 환자를 위한 개인화한 절차의 발달에 현저하게 영향을 미칠 가능성이 있습니다.
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Protocol
1. 3D 인쇄 실험 부품의 준비
참고: 프로토콜에 사용되는 모든 소프트웨어는 재료 표에표시됩니다. 또한 활용되는 슬라이싱 소프트웨어는 재료 표에나열된 3D 프린터에 특정합니다. 그러나 이 프로토콜은 광범위한 스테레오리소그래피(SLA) 3D 프린터로 확장할 수 있습니다.
- 환자 CT 스캔을 3D 개체(.stl 파일)로 변환합니다.
참고: 이러한 연구에서 사용되는 특정 폐 모델의 기하학적 특징에 대한 보다 자세한 설명은 Feng 외5를참조하십시오.- CT 스캔 소프트웨어를 사용하여 CT 스캔을 3D 개체로 렌더링합니다(재료 표참조). CT 스캔을 열고 -800에서 -1000 범위의 설정이 있는 임계값 도구를 사용하여 영공에서 마스크를 만듭니다. 3D 미리 보기 도구를 사용하여 3D 렌더링을 보고 개체(파일| 내보내기는.stl 파일로 내보냅니다.
- 파일을 메시 편집 소프트웨어로 가져오기(재료 표참조), 선택 도구를 사용하여 들쭉날쭉한 피쳐를 제거합니다(조각| 브러쉬: "수축/매끄러운" | 속성: 강도 (50), 크기 (10), 깊이 (0)). 표면을 부드럽게(Ctrl +a | 변형 | 부드러운 | 스무딩(0.2), 스무딩 스케일 (1)).
- 메시 편집 소프트웨어에서 이러한 개체의 벽을2mm(Ctrl+A | 확장합니다. | 편집 오프셋)을허용하고 벽만 유지되도록 내부 개체가 비어 있는 상태로 유지되도록 합니다. 오브젝트슬라이스(| 선택 | 편집 평면 절단)기관에서 입구를 형성하고 개체가 각 로브에 분기하는 세대 2 또는 3에서 콘센트를 만들 수 있습니다(그림 1A).
참고: 재료 표에 나열된 3D 프린터 제조업체에서 지정한 허용 가능한 피쳐 크기에 따라 2mm의 두께가 선택되었습니다. 이 두께는 모델의 내부 형상이 유지되는 경우 사용 가능한 3D 프린터의 사양에 따라 조정할 수 있습니다.
- 환자 폐 모델 출구 형상을 수정하여 재료 표에 나열된 이전에 설계된 로브 콘센트 캡 구성요소(그림 1B, C)와호환되도록 합니다.
- 내부에 CT 스캔을 복제하는 3D 객체를 가져오면 벽 두께가 2mm이며 입구및 콘센트에서 3D 모델링 소프트웨어(재료 표참조)로 열립니다(자료 표 참조)로 솔리드 바디(Open| 메시 파일 | 옵션 | 솔리드 바디).
- 각 콘센트의 면을 기반으로 평면만들기(삽입 | 참조 형상 | 평면). 접합 도구를 사용하여 평면의 스케치에서 콘센트의 내부 벽과 외부 벽을추적합니다(스케치 | 스프라인).
- 모델의 내부 및 외부 벽에 연결하는 실린더(OD 18.5mm, ID 12.5mm, H 15.15mm)를 로프트하여 각 로브에서 균일하게 콘센트를 확장합니다(특징| 로프트 보스/베이스). 캡과 일치하도록 콘센트 가장자리 주위에 노치를추가합니다(특징 | 압출 컷 | 오프셋).
참고:캡(도 1D)은콘센트의 치수를 일치시키고 모델 콘센트의 노치와 상호 연결되는 선반을 갖는 중공 실린더입니다. 캡의 한쪽 끝은 ID가 부품의 나머지 부분보다 작도록 차단되어, 이것은 가시 튜브연결(도 1E)주위에단단히 끼울 수 있도록 한다. 가시 튜브 연결은 가시 콘 모양으로 바빙이 캡의 개구부를 통해 잘 어울리지만 나머지 부분은 그렇지 않으므로 튜브 연결이 캡에 단단히 맞도록 합니다. 따라서 캡은 가시 튜브 연결과 폐 모델(도1F, G)에모두 밀접하게 맞습니다. - 원하는 실험 조건에 따라 폐 모델의 입구를 수정합니다. 목과 글로탈 부위는 스스로 호흡할 수 있는 환자를 모방하기 위해 포함될 수있다(도 1B). 기관 위의 영역은 환기 기밀에 관관된 환자를 모방하기 위해 압출 된 컷을 사용하여 제거 할 수 있습니다(특징 | 압출 컷)(도 1C).
- 3D 프린터 제조업체에서 제공하는 슬라이싱 소프트웨어의 실험 구성 요소를 방향과 지원합니다.
- 3D 부품 파일을 3D 프린터 슬라이싱 소프트웨어로 가져오고 적절한 수지를 선택합니다. 단단한 수지를 사용하여 폐 모델과 가시 튜브 연결을 인쇄하고 부드러운 수지로 캡을 인쇄합니다.
참고: 캡인쇄에 사용되는 수지에는 로브 콘센트 위로 뻗어 밀폐 씰을 만들 수 있도록 탄성 특성이 있어야 합니다. - "섬"과 발명되지 않은 볼륨이 최소화될 수 있도록 부품 방향을 설정합니다. 폐 모델에 가장 적합한 방향은 인쇄 플랫폼에서 멀리 향하는 로브 콘센트입니다. 가시 튜브 연결과 캡 모두 인쇄 플랫폼을 향한 더 넓은 부분을 확보하십시오.
참고: 개별 슬라이스를 볼 수 있으며 부품의 본문에 연결되지 않고 슬라이스에 처음 나타나는 부품의 "섬"의 모양을 확인할 수 있습니다. 검토 함수는 사용되지 않은 볼륨이 있는 슬라이스를 확인하는 데 사용할 수 있으며, 인쇄 하는 동안 처리되지 않은 수지가 부품 내부에 갇힐 수 있는 영역입니다. "섬"과 발명되지 않은 볼륨 모두 인쇄 품질을 저하시키고 인쇄 실패로 이어질 수 있습니다. - 각 슬라이스를 개별적으로 보고 부품의 나머지 "섬"과 상당한 오버행이 있는 영역에 지원을 추가합니다. 인쇄의 슬라이스를 내보내고 보고 모든 영역이 제대로 지원되는지 확인합니다.
- 3D 부품 파일을 3D 프린터 슬라이싱 소프트웨어로 가져오고 적절한 수지를 선택합니다. 단단한 수지를 사용하여 폐 모델과 가시 튜브 연결을 인쇄하고 부드러운 수지로 캡을 인쇄합니다.
- 제조업체 지침에 따라 실험 구성 요소를 인쇄하고 완전한 후처리를 완료합니다.
참고: 아래에 설명된 모든 후처리 단계는 재료 표에나열된 3D 프린터에 만릅니다. 대체 프린터 나 재료를 활용하는 경우 제조업체 지침을 반영하도록 다음 단계를 조정합니다.- 소프트 수지로 인쇄된 부품의 경우 제조업체 사양에 따라 8시간 동안 대류 오븐에서 과도한 경화되지 않은 수지 및 열 경화를 제거하기 위해 ≥99% 순도 이소프로필 알코올(IPA)으로 세척하십시오.
참고: 부드러운 수지로 인쇄된 부품은 인쇄 직후 매우 섬세할 수 있으므로 청소 단계에서는 특별한 주의를 기울여야 합니다. IPA에 노출은 부품 분해를 방지하기 위해 재료의 용매 노출 제한 이하로 유지되어야 합니다. - 단단한 수지로 인쇄된 부품의 경우 IPA로 세척하여 과도한 경화되지 않은 수지와 UV 오븐(5-10mW/cm2의365nm 라이트)에서 1분 동안 치료하십시오.
참고: 3D 인쇄 된 복제본의 정확도를 평가하기 위해 인쇄 된 부품의 μCT 스캔 및 CT 스캔 소프트웨어를 사용하여 원래 3D 렌더링과 3D 인쇄 복제본 사이의 변형을 정량적으로 비교하는 것이 좋습니다.
- 소프트 수지로 인쇄된 부품의 경우 제조업체 사양에 따라 8시간 동안 대류 오븐에서 과도한 경화되지 않은 수지 및 열 경화를 제거하기 위해 ≥99% 순도 이소프로필 알코올(IPA)으로 세척하십시오.
2. 유량 제어를 위한 튜브 시스템 조립
- 나사 1/4" 가시 튜브 피팅은 6포트(그림2A-6)와3/8" 가시 튜브를 나머지 포트에 장착하여 매니폴드 의 측면에 끼어 있습니다.
- 원하는 길이로 1/4"튜브를 자르고 푸시 투 커넥트 밸브(그림2A-5)의각 끝에 삽입합니다. 각 밸브를 매니폴드에 삽입된 1/4" 피팅 중 하나에 부착합니다.
- 각 밸브의 다른 쪽 끝에 유량계(그림2A-4)를연결합니다.
- 매니폴드의 싱글 3/8" 피팅이 보드 가장자리를 지나 확장될 수 있도록 튜브 시스템을 나무 판 위에 놓습니다. 제자리에 고정하려면 나무 판의 측면에 두 개의 나사를 추가하고 와이어를 사용하여 나사에 매니폴드를 부착하십시오.
- 각 밸브와 유량계 주위에 배치된 4개의 나사를 추가하고 와이어를 사용하여 각각의 나사를 나무 판에 고정시합니다(그림2E).
- 3/8인치 ID 튜브의 약 6"를 사용하여 매니폴드를 인라인 0.1 μm 모공 크기 진공 등급 필터에 연결합니다. 필터의 다른 끝을 3/8인치 ID 튜브의 6"을 사용하여 흐름 컨트롤러에 연결
참고: 튜빙 시스템은 한 번만 조립하면 됩니다.
3. 환자 폐 모델로 로브 콘센트 캡의 조립
참고: 프로토콜의 이 부분은 모든 실험 실행 전에 완료되어야 합니다.
- 캡 베이스의 개구부를 통해 노즐이 튀어나와 캡에 가시 튜브 연결을 삽입합니다. 먼저 타원형 가시 튜브 연결 베이스의 한쪽 끝을 캡에 삽입합니다. 그런 다음 타원형 베이스의 다른 쪽 끝에 유연한 캡을 조심스럽게 스트레칭하여 얇은 베이스를 깨지 않도록 특별한주의를 기울입니다.
참고: 새로 인쇄된 캡은 원하는 것보다 딱딱할 수 있으며 캡 내부를 따라 두 손가락을 실행하여 뻗을 수 있습니다. - 10 μm 필터 용지를 잘라 콘센트 영역보다 약간 큽수 있도록 합니다. 필터 용지를 로브 콘센트 위에 접어 한 손으로 제자리에 고정합니다.
- 반면에 핀셋을 사용하여 콘센트 위에 가시 튜브 연결을 사용하여 캡을 늘이시합니다. 캡의 노치가 로브 콘센트의 해당 노치와 일치할 때까지 캡을 아래로 누릅니다(그림2C).
참고: 이 단계에서 필터 용지를 리핑하면 결과가 무효화될 수 있으므로 캡을 콘센트에 누를 때 과도한 힘을 피하기 위해 특별한 주의를 기울여야 합니다. - 남은 모든 로브콘센트(그림 2D)에대해 반복합니다.
4. 임상적으로 관련된 공기 흐름 프로파일의 생성
참고: 프로토콜의 이 부분은 모든 실험 실행 전에 완료되어야 합니다.
- 각 폐 모델 로브 콘센트를 해당 유량 계측기 및 밸브의 튜브에 연결하여 가시 튜브 연결에 너무 많은 측면 압력을 가하지 않도록 주의하십시오. 폐 모델에 대한 총 공기 유량을 측정하기 위해 전자 유량계를 폐 모델 입 입구에 부착합니다.
- 유동컨트롤러(그림 2A-7)및 진공 펌프(그림2A-8)를켭니다. 유량 컨트롤러에"테스트 설정"설정을 선택하고 전자 유량 계가 원하는 총 유량을 표시할 때까지 유량을 천천히 늘립니다.
- 밸브(도 2E-5)를사용하여 오른쪽 위어(RU), 오른쪽 중간(RM), 오른쪽 하부(RL), 왼쪽 어퍼(LU), 왼쪽 하부(LL) 등 5개의 폐로를 통해 유량을 조절한다. 유량계에 표시된 로브 유량(도2E-4)이원하는 값으로 안정되면 전자 유량 계에 다시 전체 유량으로 확인하여 시스템에 누출이 없는지 확인합니다.
- 총 유량에 불일치가 있는 경우 유량 컨트롤러를 사용하여 유량을 낮추고 모든 밸브를 완전히 열린 구성으로 설정하고 4.2 및 4.3 단계를 반복합니다.
참고: 여기서 제시된 결과는 Sul et al.10에 의해 보고된 데이터를 기반으로 공기 흐름 단면도를 사용하여 얻어졌다. 10 이 로바 흐름 분획은 각 폐 엽의 부피의 상대적인 변경을 비교하고 완전한 영감과 만료에 환자 폐의 박슬라이스 계산 단층 촬영 심상을 사용하여 계산되었다. 결과는 1 L/min의 전체 입구 유량모두에서 두 개의 뚜렷한 유동 조건에 대해 제시됩니다. 건강한 폐엽 출구 유동 프로파일은 유입 흐름의 다음 비율로 각 출구에 분포된다: LL-23.7%, LU-23.7%, RL-18.7%, RM-14.0%, RU-20.3%. COPD 로브 출구 흐름 프로파일은 유입 흐름의 다음 비율로 각 출구 사이에 분포된다: LL-10.0%, LU-29.0%, RL-13.0%, RM-5.0%, RU-43.0%9,10.
- 총 유량에 불일치가 있는 경우 유량 컨트롤러를 사용하여 유량을 낮추고 모든 밸브를 완전히 열린 구성으로 설정하고 4.2 및 4.3 단계를 반복합니다.
- 유동 컨트롤러의"테스트 설정"기능을 종료하지만 진공 펌프를 켜십시오.
참고: 유량을 설정하고 증착 실험을 수행하는 사이에 진공 펌프를 끄면 생성된 유량 프로파일의 부정확성이 발생할 수 있습니다. 에어로졸 증착 테스트를 완료하기 위해 원하는 유량이 설정되면 진공 펌프를 그대로 두는 것이 좋습니다.
5. 폐 모델에 에어로졸전달
참고: 분무기에 의해 생성된 에어로졸에 대한 노출을 최소화하기 위해 새시가 닫힌 연기 후드에서 실험을 수행해야 합니다.
- 바람직한 형광 입자의 용액으로 분무기를 채우고(도 2A-1)폐 모델 입구에 연결(도 2B).
참고: 여기에 제시된 결과는 메탄올에 있는 1 μm 형광 폴리스티렌 입자의 1:100 희석의 30 mL를 사용하여 얻어졌다.- 실험 용 설치의 유효성을 검사하려면 분무기를 표적 장치없이 폐 모델 입구에 직접 연결합니다.
- 표적 장치의 효능을 측정하려면 분무기를 장치에 연결하고 장치를 폐 모델에 삽입합니다.
- 압축 공기 라인을 분무기에 연결하고 연기 후드 띠를 가능한 한 닫습니다.
- 흐름 컨트롤러를 10s 평가판에 대해 실행하도록 설정합니다. 시동을 시작하기 전에 압축 공기 밸브를 약간 열어 분무기 내에서 에어로졸을 생성합니다.
- 유량 컨트롤러에서 시작한 후 압축 공기 밸브를 완전히 엽니다. 유동 컨트롤러가 약 9s에 도달하면 압축 공기 밸브를 닫기 시작합니다.
- 압축 공기 밸브가 완전히 닫히면 압축 공기 라인에서 분무기를 분리하고 연기 후드 띠를 완전히 닫고 진공 펌프를 차단하고 연기 후드에서 에어로졸을 약 10 분 동안 꺼지게하십시오.
참고: 튜브 시스템 내에서 진공이 쌓이는 것을 방지하기 위해 실행을 완료한 후 진공 펌프를 끄는 것이 중요합니다. - 충분한 시간을 기다린 후, 관빙 시스템에서 폐 모델을 분리하여 가시 튜브 연결을 해독하지 않도록 특별한주의를 기울입니다.
- 캡 의 가장자리 아래에 핀셋 한 쌍을 실행하고 부드럽게 폐 모델에서 들어 올려 로브 콘센트 캡을 제거합니다.
- 캡에서 필터 용지를 제거하고 플레이트의 우물을 향한 바닥에 증착된 입자가 측면에 있는 24웰 플레이트에 놓습니다. 나머지 콘센트에 대해 반복하고 각 로브에 해당하는 우물에 레이블을 지정합니다.
참고: 잔류 입자 증착이 후속 실험에 영향을 미치지 않도록 하기 위해 폐 모델과 캡 성분을 IPA 또는 실행 사이에 적절한 용매로 헹구는 것이 중요합니다. 이를 수집하고 원하는 대로 분석에 포함할 수 있습니다. 또한 사용되는 모든 복제본이 부품 무결성을 유지하기 위해 IPA에 최소한의 노출되었는지 확인하기 위해 로그를 보관하고 사용 전에 시각적 부품 검사를 권장합니다.
6. 콘센트 필터 종이 이미징
- 웰 플레이트를 디지털 형광 현미경에 넣고 현미경을 4배 배율 및 적절한 형광 채널로 설정합니다.
- 어떤 로브의 필터 용지가 가장 많은 양의 파티클 증착을 가지고 있는지 시각적으로 식별하고"자동 노출"기능을 사용합니다. 결과 노출 및 통합 시간 값을 기록합니다.
- 이 노출을 실행을 위한 모든 필터에 적용하고 설정이 필터의 모든 높은 증착 영역에 대해 만족스러운 이미지를 생성하는지 여부를 평가합니다.
참고: 포커스 설정을 필터에서 필터로 변경할 수 있습니다. 그러나 지정된 실행에 대한 모든 필터는 동일한 노출 설정에서 분석해야 합니다. 한 번에 하나의 초점 프레임을 가질 수 있으므로 필터 용지의 구부리거나 눈물로 인해 뷰에 있는 모든 증착된 입자가 초점을 맞추는 것을 방지할 수 있습니다. 필터 용지가 웰 플레이트의 바닥에 평평하도록 하여 이를 방지할 수 있습니다. - 임의의 위치에서 각 로브의 필터 용지의 적어도 세 개의 이미지를 가져와 .tiff 서 파일로 저장합니다.
7. 입자 증착의 정량화
- 지정된 실행이 ImageJ 세션으로 실행되도록 모든 필터 용지 사진을 가져옵니다.
- 이미지 | 선택하여 각 이미지의 유형을 8비트로 변경합니다. | 유형 8 비트.
- 가장 높은 형광으로 그림을 열고 이미지 | 선택합니다. 조정 | 임계값 창을 여는 임계값입니다. 임계값값을 조정하여 필터 용지의 배경 신호를 최소화하고 파티클의 가장자리를 명확하게 정의합니다. 품질이 좋고 품질이 좋지 못한 임계값을 묘사할 수 있는 그림 3을 참조하십시오.
참고: 높은 수준의 증착을 가진 필터의 경우, 필터 용지 섬유에 의한 빛의 회절로 인한 형광의 "코로나"는 입자의 큰 그룹 주위에 관찰될 수 있다. 이러한 이미지의 임계값을 조정할 때 너무 큰 범위에는 그림 3의"불량" 임계값 이미지에서 관찰된 대로 이러한 그룹 주위에 작은 점 또는 "깃털 모양" 모양이 표시됩니다. 이는 필터 용지 섬유로부터의 신호가 입자 자체로부터 신호를 가리지 않고 최소화될 때까지 임계값의 하한을 점진적으로 증가시킴으로써 개선될 수 있다. - 가장 높은 형광 이미지에 대한 임계값 설정을 다른 모든 이미지에 전파합니다.
- 분석 | 선택하여 입자 수와 총 형광 면적을 정량화합니다. 파티클 분석.
참고: 데이터 세트는 Sidak의 다중 비교 테스트와 양방향 ANOVA를 사용하여 비교됩니다. 또한, 관심있는 로브의 증착은 동등한 차이를 가정하는 학생 T 테스트를 사용하여 비교됩니다.
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Representative Results
이 크기 범위(1-5 μm) 및 유량 조건(1-10 L/min)의 입자는 이론적 스토크스 수와 생체 내 데이터를 모두 기반으로 유체 스트림 라인을 따릅니다. 따라서 표적 전달 장치가 없는 경우 폐 모델로 방출되는 입자는 각 로브로 전환된 총 공기 흐름의 비율에 따라 예치될 것으로 예상됩니다. 각 로브에 대한 입자 전달의 상대적 양은 환자 특이적 고해상도 컴퓨터 단층 촬영(HRCT) 스캔10을분석하여 얻어진 임상 엽 유량 데이터와 비교될 수 있다. 검증된 실험 셋업은 임상 공기 흐름 프로파일과 통계적으로 유의한 차이가 없는 비표적 입자 증착 프로파일을 생성합니다. 검증 데이터는 건강한폐(도 4A)에서1 L/min과 COPD(도4B)에의해 영향을 받는 폐에서 1 L/min의 두 가지 뚜렷한 유동 조건에 대해 제시된다. 이 두 조건 하에서, 실험적으로 결정된 증착 프로파일은 임상 데이터와 통계적으로 다르지 않았으며, 셋업이 각 폐 엽에 대한 공기 흐름의 분포를 정확하게 모방한다는 것을 입증하였다. 이러한 기준증착 프로파일은 표적 입자 증착 프로파일을 비교하는 제어 역할을 했습니다.
이 프로토콜의 지역 폐 증착 의 변화를 정량화하는 능력을 설명하기 위해, 데이터는 두 개의 다른 표적 장치의 테스트에 포함되었다: 수정된 엔노트라힐(ET)튜브(도 5B)및 동심 실린더 장치(그림5E). 이 두 장치 모두 대상 파티클 릴리스에 사용할 수 있는 위치가 있는 2mm ID 콘센트가 특징입니다. 변형된 ET 튜브는 좌측 하부(LL) 로브 및 오른쪽 하부(RL) 로브 모두에 입자 증착을 표적으로 하는 능력에 대한 관관폐 모델로 평가되었다. 비표적 입자 증착 프로파일과 비교하여, 이 장치는 왼쪽 폐로 전달된 입자의 96% 이상을 우회하는 것 외에도 LL Lobe 전달(T-test p=0.004, n=3)에서 거의 4배 증가(T-test p=0.0001, n=3)를 생성하였다(그림5A). RL Lobe를 대상으로 릴리스 위치 설정을 변경하여 이 장치는 RL Lobe(T-test p=0.02, n=3)로 입자 전달을 두 배 이상 생성하고 전달된 입자의 94%를 오른쪽 폐로 전환(T-test p=0.0005, n=3)(그림 5C). 이는 장치가 의도된 증착 프로파일 변조를 생성하는 데 매우 성공했음을 나타냅니다. 동심 실린더 장치는 왼쪽 어퍼(LU) 로브의 의도된 표적을 가진 전체 폐 모델에서 시험되었다. 비표적 입자 증착 프로파일과 비교하여, 이 장치는 왼쪽 폐로 전달된 입자의 87% 이상을 우회하는 것 외에도 LU Lobe 전달(T-test p=0.0003, n=3)의 거의 3배 증가를 일으켰습니다(T-test p=0.002, n=3)(그림 5D). 표적 화보 필터의 이미지를 다른 콘센트 필터와 비교하여 타게팅 효율도 질적으로 관찰할 수 있다. 도 3에설명된 바와 같이, 가장 효과적인 타겟팅 방법은 나머지 로브 콘센트에서 의도된 관심 엽및 낮은 증착에서 높은 입자 증착을 산출합니다. 이 프로토콜의 기능에 대한 추가 데모는 Kolewe 외9에서수행한 실험을 참조하십시오.
그림 1: 3D 인쇄 실험 구성 요소. (A)환자 CT 스캔은 CT 스캔 및 메시 편집 소프트웨어를 사용하여 3D 부품 파일로 변환됩니다. (B)메쉬 편집 및 3D 모델링 소프트웨어로 만들어진 로브 콘센트 변형을 가진 폐 모델. (C)관관 환자를 반영하기 위해 3D 모델링 소프트웨어에서 수정된 입구를 가진 폐 모델. (D)가시 튜브 연결 및(E)캡은 3D 모델링 소프트웨어로 설계되었습니다. (F)캡 및 가시 튜브 연결과 폐 모델 콘센트의 연동 특성을 묘사하는 3D 모델의 단면. (G) 폐 모델 콘센트 캡 어셈블리의 폭발적인 뷰. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 실험 설정의 어셈블리. (A)(1) 분무기, (2) 폐 모델, (3) 출구 캡, (4) 유량계, (5) 밸브, (6) 매니폴드, (7) 유량 컨트롤러 및 (8) 진공 펌프를 포함하는 실험 용 설정의 회로도. (B)완전히 조립된 설정. (C)조립 된 캡으로 로브 콘센트의 클로즈업. (D)모든 캡이 추가된 폐 모델. (E)로브 출구 유량 설정을 위한 튜브 네트워크 클로즈업. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 용지 이미지 처리를 필터링합니다. 제시된 원시 심상은 건강한 호흡 단면도에서 1 L/min에서 1 μm 형광 폴리스티렌 입자를 사용하여 좌측 폐를 표적으로 하는 실험 중에 수집되었다. "높음" 및 "낮은" 증착 이미지는 LL 및 RU Lobe 필터를 각각 묘사합니다. 43~255개의 범위로 적용된 "양호한" 임계값은 개별 입자 간의 정의된 모서리를 유지하고 필터 용지 섬유의 검출을 방지합니다. 17~255개의 범위로 적용된 "가난한" 임계값은 개별 입자 테두리를 모호하게 하고 필터의 형광 영역을 과대 평가합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 실험 설정 유효성 검사입니다. (A)건강한 환자에 대한 검증 결과 및(B)1 L/min에서 COPD 환자. 제시된 모든 데이터는 3개의 복제를 가진 ± SD를 의미합니다 (임상 COPD 데이터를 제외하고, 단 1명의 환자만 보고된). 건강 및 COPD 환자를 위한 임상 기준 데이터는 Sul, et al10로부터수득되었다. 데이터 집합은 Sidak의 다중 비교 테스트를 사용하여 비교되었으며 모든 차이점은 중요하지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 실험 타겟팅을 위한 예제 데이터입니다. (A)왼쪽 하부 로브 및(C)오른쪽 하부 로브 타겟팅을 사용하여 달성(B)수정 ET 튜브 전달 시스템. (D)상류엽 타겟팅을 사용하여 달성하였다(E) 동심 관 전달 시스템. 세 가지 데이터 세트 모두에 대해, 내부 링은 설정 유효성 검사 중에 얻어진 비표적 증착 프로파일을 나타내고, 외부 링은 표시된 타겟팅 디바이스를 추가하여 생성된 증착 프로파일을 나타낸다. 각 설정에 대해 세 가지 복제수단이 표시됩니다. 데이터 세트는 Sidak의 다중 비교 테스트와 학생 T-테스트를 사용하여 동일한 분산을 가정하여 비교했습니다. 세 가지 설정 모두 관심 있는 로브에 대한 납품이 크게 증가했습니다: LL Lobe (T-test p=0.004, n=3), RL 로브 (T 테스트 p=0.02, n=3), LU Lobe (T-test p=0.0003, n=3). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
완전한 흡입 용량의 폐 약제학적 시험을 위한 현재의 최첨단 장치는 에어로졸4의공기역학적 직경을 측정하는 차세대 발전기 임펙터(NGI)이다. 이러한 크기 조정 데이터는 건강한 성인남성(11)을위해 개발된 상관관계에 기초하여 에어로졸이 입금되는 폐 생성을 예측하는 데 사용된다. 불행하게도, 이 방법은 지역 폐 증착의 차이를 평가하고, 약제학적 전달에 대한 질병 상태의 영향을 결정하고, 다양한 연령집단, 인종 및 성별에 대한 증착 프로파일을 예측하는 능력이 제한되어 있다12,13,14. 여기에 설명된 프로토콜은 연구원이 이전에 전산 모델3,5,15에서입증된 유체 유동 거동을 기반으로 로브 수준에서 상대 적 증착을 정량화할 수 있는 능력을 가진 튜닝가능하고해부학적으로 정확한 폐 모델을 생성할 수 있게 함으로써 이러한 테스트 요구를 충족시킬 수 있는 능력을 가지고 있다. 이 방법을 사용하여, 약제학적 투여량 및 전달은 임상 시험에 들어가기 전에 소아 및 병이 있는 폐 기하학에 대해 더 잘 평가될 수 있다.
그림 4 및 도 5에도시된 바와 같이, 로브 레벨 증착은 표적 및 비표적 흡입 에어로졸 모두에 대해 정확하고 신속하게 측정될 수 있다. 표적 장치가 없는 경우, 이 크기 범위(1-5 μm)와 유량 조건(1-10 L/min)의 입자는 유체 유선형 및 각 로브로 전환된 총 기류 프로파일을 따릅니다(도4). 특히, 다양한 흡입기 장치 및 ET 튜브 부착물은 흡입약을 제어된 엽 위치에 집중하도록 개발될 수 있다. 당사의 최근 작업 및 다른 이들의 작업과 같이 흡입기 장치, 흐름 프로파일 및 기도 형상의 많은 특징은 표적 증착 동작2,3,9,16에기여한다. 일반적으로 당사의 고유한 체외 모델에 의해 입증된 효율적인 지역 타겟팅은 기관 내에 특별히 발견되는 기도 난류를 피하기 위해 좁은 에어로졸 크기 분포와 낮은 흡입 유량이 필요합니다. 시험관 내 전체 기도를 포함하면 하류 로브 레벨 분포9에영향을 미치는 것으로 알려진 이러한 기류 패턴을 정확하게 재현할 수 있습니다. 이러한 복잡한 흐름으로 인해 최근 작업에서는 글로티스9아래에서 타겟팅이 증가하는 것으로 입증되었습니다. 그림 5의 결과는 특히 ET 튜브 어댑터를 사용하여 glottis 아래 방출에서 개별 엽을 지역적으로 표적으로 하는 이점을 강조하고, 전체 투여량의 62-74%에 이르는 효율에서 좌우 폐의 엽에 대해 효과적인 로브 별 타겟팅이 표시됩니다. 이는 이전에 실험적으로 보고된 군산 지역 타겟팅 효율성에 비해 증가를 나타내며 이 접근법9의임상 구현을 위한 중요한 길이다. 중요 한 것은, 프로토콜은 여기에 입증 된 것 넘어 잠재적인 지역 타겟팅 장치의 넓은 범위에서 완전 한 제약 복용량의 실험 적인 lobe 분포 측정을 허용 합니다.
CT 스캔만으로 환자 특이적 폐 모델은 잠재적인 치료 전달 방법을 테스트하기 위해 신속하게 3D 프린팅될 수 있습니다. 이 프로토콜은 새로운 흡입기 장치의 설계를 지원하는 실험적인 실험실 규모의 접근 방식을 제공할 뿐만 아니라 임상 실습에서 주문형 맞춤형 흡입 장치를 위한 기회를 창출할 것입니다. 이 프로토콜에 사용되는 하드 수지 비용은 ~$0.12/mL; 따라서 기존 3D 프린팅 인프라를 갖춘 병원은17개의 재료에 15달러에 불과한 폐 모델을 인쇄하고 하루 안에 맞춤형 기도를 조립할 수 있습니다. 특히 적산 제조의 인쇄 시간과 재료 비용은 계속 급격히 감소하여 이 접근법의 전반적인 타당성을 높이고 있습니다. 당사의 실험 용 셋업은 도 4에도시된 실험 검증에 따라 다른 폐 모델 또는 공기 흐름 분포 설정을 활용하여 다수의 기류 조건을 반영하도록 쉽게 수정할 수 있다. 연령, 인종 및 성별과 같은 특성으로 인한 폐 흐름 프로파일 및 기하학의 차이는 문학에 잘 문서화되어 있으며18,19,20의모델링 접근 방식에 쉽게 통합될 수 있다. 구체적으로, 폐 모델의 후두, 인두 및 기관의 기하학적 변화는 이 프로토콜이 검출할 수 있는 공기 흐름 및 후속 지역 증착패턴(15,21,22)에상당한 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 이러한 개인화된 모델링 접근법의 편입은 맞춤형 흡입 치료제의 개발에 큰 영향을 미칠 것으로 기대된다.
여기서, 엽 유량은 하부엽(도 4B)으로의공기 흐름을 감소하는 것을 특징으로 하는 COPD 질환 상태의 이를 반영하도록 변경되었지만, COPD 환자 유래 CT 스캔은 병들인 폐 건축및 가능한장애물(23)을보다 정확하게 모방하는 데 사용될 수 있다. 환자 폐 모델 및 유량 프로파일 라이브러리를 통해 질병 진행이 전달 효율에 미치는 영향을 조사할 수 있습니다. 국립보건원(NIH)과 암 영상아카이브(TCIA)24등조직에서 다양한 오픈소스 스캔이 가능합니다. 이러한 모델은 현재 로브 레벨 분포를 적절히 측정하기 위해 환자 형상을 2세대 또는 3세대까지만 복제할 수 있지만, 보다 상세한 분석을 위해 하부 기도를 통합할 수 있는 수정을 개발하기 위한 작업이 진행 중입니다. 이 프로토콜은 도 5B에묘사된 ET 튜브와 같은 임상적으로 관련된 약물 전달 장치를 통합할 수도 있다. 연구원은 치료 효율을 증가하거나 감소시킬 수 있는 특성을 밝히기 위하여 다중 납품 장치를 평가할 수 있습니다. 예를 들어, 포팅 효과는 관관폐모델(도 5)과반대로 전체 폐 모델에서 시도될 때 감소된다. 이 차이는 글로탈 영역을 우회하면 타겟팅 능력이 저하되는 난류 혼합 영역을 피한다는 것을 나타냅니다.
이 프로토콜은 생물학적 공기-액체 인터페이스를 정확하게 모방할 수 없다는 데 의해 제한됩니다. 그 결과, 일반적으로 관성 결에 의해 침전되는 에어로졸은 대신 폐모델(25)의단단한 벽에서 튀어나올 수 있다. 이를 개선하기 위해, 미래의 방향은 폐 상피의 점막 층을 모방하기 위해 표면 수정 및 코팅을 탐구하는 것을 포함한다. 실리콘 오일 및 글리세린과 같은 코팅은 NGI에서 입자 바운스방지를 위해 조사되었으며 3D 인쇄폐모델(26)에쉽게 통합될 수 있다. 3D 인쇄 모델에 대한 생체 인쇄 및 배양 세포와 같은 다른 기술은프로토콜(27)에세포 반응을 통합하는 능력에 대해 조사되고 있다. 또한 이 프로토콜은 1-15 L/min의 유량에 최적화된 장비를 사용합니다. 미래에는 30-60 L/min의 높은 유량, 피크 피망 유량의 정상 범위, 원하는 유량 범위28,29에적합한 컨트롤 밸브 및 유량 계를 전환하여 사용될 수 있다. 유동 컨트롤러 모델을 사용하면 전체 주기적 호흡 주기가 아닌 영감을 모델링할 수 있습니다. 환기기 또는 보다 복잡한 유량 시스템을 사용하여 일시적인 호흡 패턴을 통합하면 입자 증착효율(30)과관련하여 실험 결과의 정확도를 향상시킬 가능성이 있다. 마지막으로, 증착 실험은 1-5 μm의 크기에 이르는 단일 분산 형광 폴리스티렌 구체로만 수행되었습니다. 증착 정량화는 에어로졸 형광에 의존하므로 비형광 에어로졸을 사용한 이 프로토콜을 사용하면분석(31)을위해 형광이이소(FITC)와 같은 형광 라벨의 통합이 필요할 수 있다. 그러나, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 및 질량 분석과 같은 에어로졸 조성물에 따라 필터를 분석하기 위해 추가적인 분석 기술을 적용할 수 있다.
우리의 프로토콜은 환자 특정 폐 기하학에서 lobular 폐 증착을 정량화할 수 있는 기능을 가진 최초의 시험관 내 실험 설정을 보여줍니다. 제어 된 엽 수준의 분포를 달성하는 것은 흡입 치료의 치료 효능을 증가시킬 것으로 예상된다, 이는 체외 전체 용량 측정의 발전을 통해 달성 될 것이다. 개인화된 의학에 대한 관심이 증가함에 따라, 이 프로토콜은 잠재적인 치료 효능의 보다 정확한 예측을 허용함으로써 새로운 표적 폐 요법의 개발을 촉진할 가능성이 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
저자들은 유펑 교수, 제나 브리델 박사, 이안 우드워드, 루카스 아티아 교수에게 도움이 되는 토론에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/4" Plastic Barbed Tube Fitting | McMaster Carr | 5372K111 | |
| 10 um Filter Paper | Fisher | 1093-110 | |
| 1um Fluorescent Polystyrene Particles | Polysciences | 15702-10 | |
| 1um Non-Fluorescent Polystyrene Particles | Polysciences | 8226 | |
| 2-Propanol | Fisher | A516-4 | Referred to in protocol as "IPA" |
| 3/8" Plastic Barbed Tube Fitting | McMaster Carr | 5372K117 | |
| Air Flow Meter (1 - 280 mL/min) | McMaster Carr | 41695K32 | Referred to in protocol as "flow meter" |
| Carbon M1 3D Printer | Carbon 3D | https://www.carbon3d.com/, Associated software referred to in protocol as "slicing software" | |
| Collison Jet Nebulizer | CH Technologies | ARGCNB0008 (CN-25) | 6 Jet MRE style horizontal collision with glass jar, Referred to in protocol as "nebulizer", http://chtechusa.com/Manuals/MRE_Collison_Manual.pdf |
| Convection Oven | Yamato | DKN602 | |
| Copley Critical Flow Controller TPK2000 Reve 120V | MSP Corp | 0001-01-9810 | Referred to in protocol as "flow controller" |
| Copley High Capacity Pump Model HCP5 | MSP Corp | 0001-01-9982 | Referred to in protocol as "vacuum pump" |
| Cytation | BioTek | CYT5MPV | Multifunctional Spectrophotometer/Fluorescent imager equiped with 4x/20x/40x objectives and DAPI/GFP/TexasRed laser/filter cubes |
| EPU40 Resin | Carbon 3D | https://www.carbon3d.com/materials/epu-elastomeric-polyurethane/, Referred to in protocol as "soft resin" | |
| Filter for vacuum pump | Whatman | 6722-5000 | |
| Flow Meter Model DFM 2000 | MSP Corp | 0001-01-8764 | Referred to in protocol as "electronic flow meter" |
| ImageJ Software | ImageJ | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| Inline Air Flow Control Valve (Push-to-Connect) | McMaster Carr | 62005K333 | Referred to in protocol as "valve" |
| Inline Filter Devices | Whatman | WHA67225000 | |
| Marine-Grade Plywood Sheet | McMaster Carr | 62005K333 | Referred to in protocol as "wooden board" |
| Materialise Mimics Software | Materialise | https://www.materialise.com/en/medical/mimics-innovation-suite, Referred to in protocol as "CT scan software" | |
| Meshmixer Software | Autodesk | http://www.meshmixer.com/, Referred to in protocol as "mesh editing software" | |
| Methanol | Fisher | A454-4 | |
| Opticure LED Cube | APM Technica | 102843 | Referred to in protocol as "UV oven" |
| PR25 Resin | Carbon 3D | https://www.carbon3d.com/materials/uma-urethanemethacrylate, /Referred to in protocol as "hard resin" | |
| PVC Tube for Chemicals | McMaster Carr | 5231K161 | 1/4" ID |
| Screws | |||
| SolidWorks Software | Dassault Systèmes SolidWorks Corporation | https://www.solidworks.com/, Referred to in protocol as "3D modeling software" | |
| Straight Flow Rectangular Manifold | McMaster Carr | 1125T31 | |
| Tubing to Flow Controller | McMaster Carr | 5233K65 | 3/8" ID |
| Wire |
References
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