Stamcelgebaseerde therapie is naar voren gekomen als een efficiënte strategie om gewonde hartweefsels te herstellen na een myocardinfarct. Wij bieden een optimale in vivo toepassing voor stamceltransplantatie met behulp van gelatinehydrogels die enzymatisch met elkaar verbonden kunnen zijn.
Een van de belangrijkste problemen waarmee de huidige hartstamceltherapieën worden geconfronteerd om postinfarct hartfalen te voorkomen, is de lage retentie en overlevingskansen van getransplanteerde cellen in het gewonde myocardium, waardoor hun therapeutische werkzaamheid wordt beperkt. Onlangs heeft het gebruik van steigerbiomaterialen aandacht gekregen voor het verbeteren en maximaliseren van stamceltherapie. Het doel van dit protocol is om een eenvoudige en eenvoudige techniek in te voeren voor het transplanteren van mesenchymale stamcellen (MSC’s) met behulp van injecteerbare hydroxyfenylpropionzuur (GH) hydrogels; de hydrogels zijn gunstig als een celafgifteplatform voor hartweefsel engineering toepassingen vanwege hun vermogen om cross-linked in situ en hoge biocompatibiliteit. We presenteren een eenvoudige methode om MSC-loading GH hydrogels (MSC/hydrogels) te fabriceren en hun overleving en proliferatie in driedimensionale (3D) in vitro cultuur te evalueren. Daarnaast demonstreren we een techniek voor intramyocardtransplantatie van MSC/hydrogels bij muizen, waarbij we een chirurgische ingreep beschrijven om myocardinfarct (MI) op te wekken via linker voorste aflopende (LAD) coronaire slagader ligatie en daaropvolgende MSC/hydrogels transplantatie.
Cardiale stamceltherapie is ontstaan als een mogelijke benadering voor myocardherstel en regeneratie1,2. Ondanks de recente positieve resultaten in diermodellen en klinische studies, is de toepassing van stamcelgebaseerde therapie voor myocardherstel beperkt als gevolg van lage retentie en slechte overleving van geïnjecteerde cellen in de ingefarcteerde hartweefsels3,4. Als gevolg hiervan is het gebruik van celgebaseerde weefseltechnologie, waaronder injecteerbare biomaterialen5, hartpleisters6en celbladen7, intensief bestudeerd om de celretentie en integratie binnen het gastheer myocardium te verbeteren.
Onder de verschillende mogelijke benaderingen van bio-ingenieur hartweefselherstel zijn injecteerbare hydrogels in combinatie met geschikte celtypen, zoals mesenchymale stamcellen (MSC’s), embryonale stamcellen (ECC’s) en geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC’s), een aantrekkelijke optie om cellen effectief in myocardiale regio’s te leveren8,9. Gelatine, een bekend natuurlijk polymeer, kan worden gebruikt als een injecteerbare matrix vanwege de grote biocompatibiliteit, aanzienlijke biologische afbreekbaarheid en verminderde immunogeniciteit in vergelijking met een breed scala aan biomaterialen die worden gebruikt in biomedische toepassingen. Hoewel gelatine-gebaseerde injecteerbare platforms een groot potentieel hebben, blijft hun toepasbaarheid in vivo beperkt op basis van hun lage mechanische stijfheid en gemakkelijke afbreekbaarheid in de fysiologische omgeving.
Om deze beperkingen te overwinnen, is een nieuw en eenvoudig ontwerp van hydrogels op basis van gelatine, bestaande uit hydroxyfenylpropionzuur, voorgesteld voor in vivo toepassingen. Gelatine-hydroxyfenylpropionzuur (GH) conjugaten kunnen ter plaatse worden gekruist in aanwezigheid van een enzym, mierikswortelperoxidase (HRP), en vervolgens verschillende geneesmiddelen, biomoleculen of cellen in de hydrogel inkapselen, wat wijst op een groot potentieel in weefseltechnologietoepassingen10,11,12,13,14. Daarnaast hebben we onlangs de therapeutische effecten onderzocht van GH-hydrogels die ingekapselde MSC’s bevatten en hebben we aangetoond dat ze worden gebruikt bij succesvol hartherstel en regeneratie na MI in een murine model15. In dit protocol beschrijven we een eenvoudige techniek voor de inkapseling en in vitro driedimensionale (3D) proliferatie van MSC’s binnen GH-hydrogels. We introduceren ook een chirurgische procedure die is ontworpen om een murine MI-model te genereren via coronaire slagader ligatie en intramyocardtransplantatie van MSC-ladende GH-hydrogels in het ingefarct hart.
Injecteerbare GH hydrogels hebben een groot potentieel voor in vivo toepassingen vanwege hun vermogen om verschillende therapeutische middelen homogeen in situ op te nemen. Bovendien kunnen hun fysische en biochemische eigenschappen gemakkelijk worden gemanipuleerd op basis van ziekteafhankelijke vereisten. In dit verband zijn injecteerbare hydrogels voorgesteld om de belangrijkste beperkingen in de huidige hartstamceltherapie aan te pakken die worden belemmerd door een slechte overleving en celretentie (d.w.z. < 10% bin…
The authors have nothing to disclose.
Dit onderzoek wordt ondersteund door het Basic Science Research Program via de National Research Foundation of Korea (NRF) gefinancierd door het Ministerie van Onderwijs (NRF-2018R1D1A1A02049346)
4 % paraformaldehyde (PFA) | Intron | IBS-BP031-2 | |
5-0 silk suture | AILEE | SK534 | |
8-0 polypropylene suture | ETHICON | M8732H | |
8-well chamber slide | Nunc LAB-TEK | 154534 | |
Angiocath Plus (22GA) catheter | BD Angiocath Plus | REF382423 | |
Antibiotic-antimyocotic | Gibco | 15240-062 | |
Centrifuge | GYROGEN | 1582MGR | |
Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 | |
Cover slipe | MARIENFELD | 101242 | |
Deluxe High Temperature Cautery kit | Bovie | QTY1 | |
DMEM | Gibco | 11995-065 | |
DPBS | Gibco | 14040-133 | |
Dual-syringe | |||
EOSIN | SIGMA-ALDRICH | HT110116 | |
Ethanol | EMSURE | K49350783 739 | |
FBS | Gibco | 16000-044 | |
Fechtner conjunctiva forceps titanium | WORLD PRECISISON INSTRUMENTS | WP1820 | |
Fluorescein isothiocyanate isomer I (FITC) | SIGMA-ALDRICH | F7250 | |
Forcep | HEBU | HB0458 | |
Hair removal cream | Ildong Pharmaceutical | ||
Heating pad | Stoelting | 50300 | Homeothermic Blanket System |
50301 | Replacement Heating Pad for 50300 (10 X 12.5cm) | ||
Hematoxylin | SIGMA-ALDRICH | HHS80 | |
Horseradish peroxide (HRP; 250-330 U/mg) | SIGMA-ALDRICH | P8375 | |
Hydrogen peroxide (H2O2; 30 wt % in H2O) | SIGMA-ALDRICH | 216763 | |
Iodine | Green Pharmaceutical | ||
LIVE/DEAD cell staining kit | Thermo Fisher | R37601 | |
Mechanical ventilator | Harvard Apparatus | ||
Micro centrifuge | HANIL | Micro 12 | |
Micro needle holder | KASCO | 37-1452 | |
Micro scissor | HEBU | HB7381 | |
Microscope | OLYMPUS | SZ61 | |
MT staining kit | SIGMA-ALDRICH | HT1079-1SET | Weigert’s iron hematoxylin solution |
HT15-1KT | Trichrome Stain (Masson) Kit | ||
Paraffin | LK LABKOREA | H06-660-107 | |
PBS buffer | Gibco | 10010-023 | |
PHK26 staining kit | SIGMA-ALDRICH | MINI26 | |
Slide scanner | Leica | SCN400 | |
Surgical scissor | HEBU | HB7454 | |
Surgical tape | 3M micopore | 1530-1 | |
Tissue cassette | Scilab Korea | Cas3003 | |
Transducer gel | SUNGHEUNG | SH102 | |
Trout-Barraquer needle holder curved | KASCO | 50-3710c | |
Ultrasound system | Philips | Affiniti 50 | |
Xylene | JUNSEI | 25175-0430 |