השתלה תוך-שרירית של הידרוג'ל להזרקה בטעינת MSC לאחר אוטם שריר הלב במודל מורין
Summary
טיפול מבוסס תאי גזע התפתח כאסטרטגיה יעילה לתיקון רקמות לב פגועות לאחר אוטם שריר הלב. אנו מספקים יישום vivo אופטימלי להשתלת תאי גזע באמצעות הידרוג’לים ג’לטין המסוגלים להיות מקושרים אנזימטית.
Abstract
אחת הבעיות העיקריות הניצבות בפני טיפולים נוכחיים בתאי גזע לב למניעת אי ספיקת לב לאחר לידה היא שיעורי ההחזקה וההישרדות הנמוכים של תאים מושתלים בתוך שריר הלב הפגוע, המגבילים את יעילותם הטיפולית. לאחרונה, השימוש ביו-חומרים פיגומים צברה תשומת לב לשיפור ומקסום הטיפול בתאי גזע. מטרת פרוטוקול זה היא להציג טכניקה פשוטה וישירה להשתלת תאי גזע mesenchymal נגזר מח עצם (MSCs) באמצעות חומצה הידרוקסיפניל propionic להזרקה (GH) הידרוג’לים; הידרוג’לים הם חיוביים כפלטפורמת אספקת תאים עבור יישומים הנדסת רקמת לב בשל יכולתם להיות מקושרים במקום תאימות ביולוגית גבוהה. אנו מציגים שיטה פשוטה לפברק הידרוג’לים GH טעינת MSC (MSC / הידרוג’לים) ולהעריך את הישרדותם והתפשטותם בתרבות תלת מימדית (3D) במבחנה. בנוסף, אנו מדגימים טכניקה להשתלה תוך-שרירית של MSC/הידרוג’ל בעכברים, המתארת הליך כירורגי כדי לגרום לאוטם שריר הלב (MI) באמצעות קשירת עורקים כלילית קדמית שמאלית (LAD) והשתלת MSC/הידרוגלס לאחר מכן.
Introduction
טיפול בתאי גזע לב התפתח כגישה פוטנציאלית לתיקון שריר הלב והתחדשות1,2. למרות התוצאות החיוביות האחרונות במודלים של בעלי חיים וניסויים קליניים, היישום של טיפול מבוסס תאי גזע לתיקון שריר הלב מוגבל עקב שימור נמוך והישרדות לקויה של תאים מוזרקים ברקמות הלב האוטמות3,4. כתוצאה מכך, השימוש בהנדסת רקמות מבוססות תאים, כולל ביו-חומריםלהזרקה 5, מדבקות לב6, ויריעות תאים7, נחקר באופן אינטנסיבי כדי לשפר את שימור התא ואינטגרציה בתוך שריר הלב המארח.
בין הגישות הפוטנציאליות השונות לתיקון רקמת לב bioengineered, הידרוג’לים להזרקה בשילוב עם סוגי תאים מתאימים, כגון תאי גזע mesenchymal (MSCs), תאי גזע עובריים (ESCs), ותאי גזע פלוריפוטנטי המושרה (iPSCs), הם אפשרות אטרקטיבית ביעילות לספק תאים לאזורים שריר הלב8,9. ג’לטין, פולימר טבעי ידוע, יכול לשמש כמטריצה להזרקה בשל תאימות ביולוגית גדולה שלה, מתכלות ניכרת, אימונוגניות מופחתת בהשוואה למגוון רחב של ביו-חומרים המשמשים ביישומים ביו-רפואיים. למרות פלטפורמות להזרקה מבוססי ג’לטין יש פוטנציאל גדול, הישימות שלהם vivo נשאר מוגבל מבוסס על נוקשות מכנית נמוכה שלהם השפלה קלה בסביבה הפיזיולוגית.
כדי להתגבר על מגבלות אלה, עיצוב חדשני ופשוט של הידרוג’לים מבוססי ג’לטין המורכבים מחומצה הידרוקסיפניל פרופיונית הוצע עבור יישומי vivo. ג’לטין-hydroxyphenyl propionic חומצה (GH) מצומדים יכול להיות מקושר באתרו בנוכחות אנזים, חזרת peroxidase (HRP), ולאחר מכן לתמצת תרופות שונות, biomolecules, או תאים בתוך הידרוג’ל, מה שמרמז על פוטנציאל גדול ביישומים הנדסתרקמות 10,11,12,13,14. בנוסף, חקרנו לאחרונה את ההשפעות הטיפוליות של הידרוג’לים GH המכילים MSCs encapsulated והדגים את השימוש בהם תיקון לב מוצלח והתחדשות לאחר MI במודל מורין15. בפרוטוקול זה, אנו מתארים טכניקה פשוטה עבור אנקפסולציה במבחנה תלת מימדית (3D) התפשטות של MSCs בתוך הידרוג’לים GH. אנו גם מציגים הליך כירורגי שנועד ליצור מודל MI מורין באמצעות קשירת עורקים כליליים והשתלה תוך שרירית של הידרוג’ל GH טעינת MSC לתוך הלב האוטם.
Protocol
Representative Results
Discussion
הידרוג’לים GH להזרקה יש פוטנציאל גדול עבור יישומי in vivo בגלל היכולת שלהם לשלב הומוגנית סוכנים טיפוליים מגוונים באתרו. יתר על כן, התכונות הפיזיות והביוכימיות שלהם ניתן לתפעל בקלות בהתבסס על דרישות תלויות מחלה. במובן זה, הידרוג’לים להזרקה הוצעו כדי להתמודד עם המגבלות העיקריות בטיפול הנוכחי בת…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי תוכנית מחקר מדעי בסיסי באמצעות קרן המחקר הלאומית של קוריאה (NRF) במימון משרד החינוך (NRF-2018R1D1A1A02049346)
Materials
| 4 % paraformaldehyde (PFA) | Intron | IBS-BP031-2 | |
| 5-0 silk suture | AILEE | SK534 | |
| 8-0 polypropylene suture | ETHICON | M8732H | |
| 8-well chamber slide | Nunc LAB-TEK | 154534 | |
| Angiocath Plus (22GA) catheter | BD Angiocath Plus | REF382423 | |
| Antibiotic-antimyocotic | Gibco | 15240-062 | |
| Centrifuge | GYROGEN | 1582MGR | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 | |
| Cover slipe | MARIENFELD | 101242 | |
| Deluxe High Temperature Cautery kit | Bovie | QTY1 | |
| DMEM | Gibco | 11995-065 | |
| DPBS | Gibco | 14040-133 | |
| Dual-syringe | |||
| EOSIN | SIGMA-ALDRICH | HT110116 | |
| Ethanol | EMSURE | K49350783 739 | |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| Fechtner conjunctiva forceps titanium | WORLD PRECISISON INSTRUMENTS | WP1820 | |
| Fluorescein isothiocyanate isomer I (FITC) | SIGMA-ALDRICH | F7250 | |
| Forcep | HEBU | HB0458 | |
| Hair removal cream | Ildong Pharmaceutical | ||
| Heating pad | Stoelting | 50300 | Homeothermic Blanket System |
| 50301 | Replacement Heating Pad for 50300 (10 X 12.5cm) | ||
| Hematoxylin | SIGMA-ALDRICH | HHS80 | |
| Horseradish peroxide (HRP; 250-330 U/mg) | SIGMA-ALDRICH | P8375 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2; 30 wt % in H2O) | SIGMA-ALDRICH | 216763 | |
| Iodine | Green Pharmaceutical | ||
| LIVE/DEAD cell staining kit | Thermo Fisher | R37601 | |
| Mechanical ventilator | Harvard Apparatus | ||
| Micro centrifuge | HANIL | Micro 12 | |
| Micro needle holder | KASCO | 37-1452 | |
| Micro scissor | HEBU | HB7381 | |
| Microscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| MT staining kit | SIGMA-ALDRICH | HT1079-1SET | Weigert’s iron hematoxylin solution |
| HT15-1KT | Trichrome Stain (Masson) Kit | ||
| Paraffin | LK LABKOREA | H06-660-107 | |
| PBS buffer | Gibco | 10010-023 | |
| PHK26 staining kit | SIGMA-ALDRICH | MINI26 | |
| Slide scanner | Leica | SCN400 | |
| Surgical scissor | HEBU | HB7454 | |
| Surgical tape | 3M micopore | 1530-1 | |
| Tissue cassette | Scilab Korea | Cas3003 | |
| Transducer gel | SUNGHEUNG | SH102 | |
| Trout-Barraquer needle holder curved | KASCO | 50-3710c | |
| Ultrasound system | Philips | Affiniti 50 | |
| Xylene | JUNSEI | 25175-0430 |
References
- Jhund, P. S., McMurray, J. J. Heart failure after acute myocardial infarction: a lost battle in the war on heart failure. Circulation. 118 (20), 2019-2021 (2008).
- Cahill, T. J., Kharbanda, R. K. Heart failure after myocardial infarction in the era of primary percutaneous coronary intervention: Mechanisms, incidence and identification of patients at risk. World Journal of Cardiology. 9 (5), 407-415 (2017).
- Cambria, E., et al. Translational cardiac stem cell therapy: advancing from first-generation to next-generation cell types. npj Regenerative Medicine. 2, 17 (2017).
- Lemcke, H., Voronina, N., Steinhoff, G., David, R. Recent Progress in Stem Cell Modification for Cardiac Regeneration. Stem Cells International. 2018, 1909346 (2018).
- Alagarsamy, K. N., Yan, W., Srivastava, A., Desiderio, V., Dhingra, S. Application of injectable hydrogels for cardiac stem cell therapy and tissue engineering. Reviews in Cardiovascular Medicine. 20 (4), 221-230 (2019).
- Gaetani, R., et al. Epicardial application of cardiac progenitor cells in a 3D-printed gelatin/hyaluronic acid patch preserves cardiac function after myocardial infarction. Biomaterials. 61, 339-348 (2015).
- Gao, L., et al. Myocardial Tissue Engineering With Cells Derived From Human-Induced Pluripotent Stem Cells and a Native-Like, High-Resolution, 3-Dimensionally Printed Scaffold. Circualtion Research. 120 (8), 1318-1325 (2017).
- Hasan, A., et al. Injectable Hydrogels for Cardiac Tissue Repair after Myocardial Infarction. Advanced Science. 2 (11), 1500122 (2015).
- Wu, R., Hu, X., Wang, J. Concise Review: Optimized Strategies for Stem Cell-Based Therapy in Myocardial Repair: Clinical Translatability and Potential Limitation. Stem Cells. 36 (4), 482-500 (2018).
- Lee, Y., et al. In situ forming gelatin-based tissue adhesives and their phenolic content-driven properties. Journal of Materials Chemistry B. 1 (18), 2407-2414 (2013).
- Lee, Y., Bae, J. W., Lee, J. W., Suh, W., Park, K. D. Enzyme-catalyzed in situ forming gelatin hydrogels as bioactive wound dressings: effects of fibroblast delivery on wound healing efficacy. Journal of Materials Chemistry B. 2 (44), 7712-7718 (2014).
- Lee, S. H., et al. In situ Crosslinkable Gelatin Hydrogels for Vasculogenic Induction and Delivery of Mesenchymal Stem Cells. Advanced Functional Materials. 24 (43), 6771-6781 (2014).
- Jung, B. K., et al. A hydrogel matrix prolongs persistence and promotes specific localization of an oncolytic adenovirus in a tumor by restricting nonspecific shedding and an antiviral immune response. Biomaterials. 147, 26-38 (2017).
- Kim, G., et al. Tonsil-derived mesenchymal stem cell-embedded in situ crosslinkable gelatin hydrogel therapy recovers postmenopausal osteoporosis through bone regeneration. PLoS One. 13 (7), 0200111 (2018).
- Kim, C. W., et al. MSC-Encapsulating in situ Cross-Linkable Gelatin Hydrogels To Promote Myocardial Repair. ACS Applied Bio Materials. 3 (3), 1646-1655 (2020).
- Meirelles Lda, S., Nardi, N. B. Murine marrow-derived mesenchymal stem cell: isolation, in vitro expansion, and characterization. Br J Haematol. 123 (4), 702-711 (2003).
- Ojha, N., et al. Characterization of the structural and functional changes in the myocardium following focal ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 294 (6), 2435-2443 (2008).
- Takagawa, J., et al. Myocardial infarct size measurement in the mouse chronic infarction model: comparison of area- and length-based approaches. Journal of Applied Physiology. 102 (6), 2104-2111 (2007).
- Terrovitis, J., et al. Noninvasive Quantification and Optimization of Acute Cell Retention by In vivo Positron Emission Tomography After Intramyocardial Cardiac-Derived Stem Cell Delivery. Journal of the American College of Cardiology. 54 (17), 1619-1626 (2009).
- Dib, N., Khawaja, H., Varner, S., McCarthy, M., Campbell, A. Cell Therapy for Cardiovascular Disease: A Comparison of Methods of Delivery. Journal of Cardiovascular Translational Research. 4 (2), 177-181 (2011).
