Transplante intramial de hidrogéis injetáveis de carregamento de MSC após infarto do miocárdio em um modelo murino
Summary
A terapia baseada em células-tronco emergiu como uma estratégia eficiente para reparar tecidos cardíacos feridos após o infarto do miocárdio. Fornecemos uma aplicação in vivo ideal para transplante de células-tronco usando hidrogéis de gelatina que são capazes de ser enzimaticamente intercessos.
Abstract
Um dos principais problemas enfrentados pelas atuais terapias de células-tronco cardíacas para prevenir a insuficiência cardíaca pós-infarto é a baixa retenção e as taxas de sobrevivência das células transplantadas dentro do miocárdio ferido, limitando sua eficácia terapêutica. Recentemente, o uso de biomateriais de andaimes ganhou atenção para melhorar e maximizar a terapia com células-tronco. O objetivo deste protocolo é introduzir uma técnica simples e simples para transplantar células-tronco mesenquimais derivadas da medula óssea (MSCs) utilizando hidrogéis de ácido propínico hidroxifenil injetável (GH); os hidrogéis são favoráveis como uma plataforma de entrega de células para aplicações de engenharia de tecidos cardíacos devido à sua capacidade de estar intercingo in situ e alta biocompatibilidade. Apresentamos um método simples para fabricar hidrogéis GH de carregamento de MSC (MSC/hidrogéis) e avaliar sua sobrevivência e proliferação na cultura in vitro tridimensional (3D). Além disso, demonstramos uma técnica para transplante intramialárdio de MSC/hidrogéis em camundongos, descrevendo um procedimento cirúrgico para induzir o infarto do miocárdio (MI) através da ligadura da artéria coronária descendente anterior (LAD) e posterior transplante de MSC/hidrogéis.
Introduction
A terapia com células-tronco cardíacas emergiu como uma abordagem potencial para reparação e regeneração do miocárdio1,2. Apesar dos resultados positivos recentes em modelos animais e ensaios clínicos, a aplicação de terapia baseada em células-tronco para reparação do miocárdio é limitada devido à baixa retenção e má sobrevivência das células injetadas nos tecidos cardíacos infartados3,4. Como resultado, o uso de engenharia de tecidos baseados em células, incluindo biomateriais injetáveis5, patches cardíacos6e folhas de células7, tem sido intensamente estudado para melhorar a retenção e integração celular dentro do miocárdio hospedeiro.
Entre as várias abordagens potenciais para a reparação de tecidos cardíacos bioengenharia, hidrânis injetáveis combinados com tipos de células apropriadas, como células-tronco mesenquimais (MSCs), células-tronco embrionárias (ESCs) e células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs), são uma opção atraente para efetivamente entregar células nas regiões miocárdias8,9. A gelatina, um polímero natural bem conhecido, pode ser usada como uma matriz injetável devido à sua grande biocompatibilidade, biodegradabilidade considerável e imunogenicidade reduzida quando comparada com uma ampla gama de biomaterias usados em aplicações biomédicas. Embora as plataformas injetáveis à base de gelatina tenham grande potencial, sua aplicabilidade in vivo permanece limitada com base em sua baixa rigidez mecânica e fácil degradabilidade no ambiente fisiológico.
Para superar essas limitações, foi proposto um design novo e simples de hidrogéis à base de gelatina, compostos por ácido propiônico hidroxifenil. Os conjugados de ácido propiônico gelatino-hidroxifenil (GH) podem ser interligados in situ na presença de uma enzima, peroxidase de rabanete (HRP) e, posteriormente, encapsular várias drogas, biomoléculas ou células dentro do hidrogel, sugerindo grande potencial nas aplicações de engenharia de tecidos10,11,12,13,14. Além disso, recentemente investigamos os efeitos terapêuticos dos hidrogéis GH contendo MSCs encapsulados e demonstramos seu uso em reparo e regeneração cardíaca bem-sucedido após a MI em um modelo murino15. Neste protocolo, descrevemos uma técnica simples para o encapsulamento e a proliferação tridimensional in vitro (3D) de MSCs dentro de hidrogéis GH. Também introduzimos um procedimento cirúrgico projetado para gerar um modelo mi murina através da ligadura da artéria coronária e transplante intramocárdio de hidrogéis GH que carregam MSC no coração infartado.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os hidrogéis GH injetáveis têm grande potencial para aplicações in vivo devido à sua capacidade de incorporar homogêneo agentes terapêuticos in situ. Além disso, suas propriedades físicas e bioquímicas podem ser facilmente manipuladas com base em requisitos dependentes de doenças. Nesse sentido, hidrogéis injetáveis têm sido propostos para abordar as principais limitações na atual terapia de células-tronco cardíacas dificultadas pela má sobrevida e retenção celular (ou seja, < 10% dentro de 24h apó…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa é apoiada pelo Programa de Pesquisa em Ciência Básica através da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF) financiada pelo Ministério da Educação (NRF-2018R1D1A1A02049346)
Materials
| 4 % paraformaldehyde (PFA) | Intron | IBS-BP031-2 | |
| 5-0 silk suture | AILEE | SK534 | |
| 8-0 polypropylene suture | ETHICON | M8732H | |
| 8-well chamber slide | Nunc LAB-TEK | 154534 | |
| Angiocath Plus (22GA) catheter | BD Angiocath Plus | REF382423 | |
| Antibiotic-antimyocotic | Gibco | 15240-062 | |
| Centrifuge | GYROGEN | 1582MGR | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 | |
| Cover slipe | MARIENFELD | 101242 | |
| Deluxe High Temperature Cautery kit | Bovie | QTY1 | |
| DMEM | Gibco | 11995-065 | |
| DPBS | Gibco | 14040-133 | |
| Dual-syringe | |||
| EOSIN | SIGMA-ALDRICH | HT110116 | |
| Ethanol | EMSURE | K49350783 739 | |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| Fechtner conjunctiva forceps titanium | WORLD PRECISISON INSTRUMENTS | WP1820 | |
| Fluorescein isothiocyanate isomer I (FITC) | SIGMA-ALDRICH | F7250 | |
| Forcep | HEBU | HB0458 | |
| Hair removal cream | Ildong Pharmaceutical | ||
| Heating pad | Stoelting | 50300 | Homeothermic Blanket System |
| 50301 | Replacement Heating Pad for 50300 (10 X 12.5cm) | ||
| Hematoxylin | SIGMA-ALDRICH | HHS80 | |
| Horseradish peroxide (HRP; 250-330 U/mg) | SIGMA-ALDRICH | P8375 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2; 30 wt % in H2O) | SIGMA-ALDRICH | 216763 | |
| Iodine | Green Pharmaceutical | ||
| LIVE/DEAD cell staining kit | Thermo Fisher | R37601 | |
| Mechanical ventilator | Harvard Apparatus | ||
| Micro centrifuge | HANIL | Micro 12 | |
| Micro needle holder | KASCO | 37-1452 | |
| Micro scissor | HEBU | HB7381 | |
| Microscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| MT staining kit | SIGMA-ALDRICH | HT1079-1SET | Weigert’s iron hematoxylin solution |
| HT15-1KT | Trichrome Stain (Masson) Kit | ||
| Paraffin | LK LABKOREA | H06-660-107 | |
| PBS buffer | Gibco | 10010-023 | |
| PHK26 staining kit | SIGMA-ALDRICH | MINI26 | |
| Slide scanner | Leica | SCN400 | |
| Surgical scissor | HEBU | HB7454 | |
| Surgical tape | 3M micopore | 1530-1 | |
| Tissue cassette | Scilab Korea | Cas3003 | |
| Transducer gel | SUNGHEUNG | SH102 | |
| Trout-Barraquer needle holder curved | KASCO | 50-3710c | |
| Ultrasound system | Philips | Affiniti 50 | |
| Xylene | JUNSEI | 25175-0430 |
References
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