زرع داخل القلب من هيدروجيلات هيدروجيل القابلة للحقن MSC التحميل بعد احتشاء عضلة القلب في نموذج مورين
Summary
وقد برز العلاج القائم على الخلايا الجذعية كاستراتيجية فعالة لإصلاح أنسجة القلب المصابة بعد احتشاء عضلة القلب. نحن نقدم الأمثل في تطبيق vivo لزرع الخلايا الجذعية باستخدام هيدروجيلات الجيلاتين التي هي قادرة على أن تكون الأنزيمية عبر الارتباط.
Abstract
واحدة من القضايا الرئيسية التي تواجه العلاجات الحالية للخلايا الجذعية القلبية لمنع فشل القلب بعد الأنف هو انخفاض معدلات الاحتفاظ والبقاء على قيد الحياة من الخلايا المزروعة داخل عضلة القلب المصابة، والحد من فعاليتها العلاجية. في الآونة الأخيرة ، اكتسب استخدام المواد الحيوية السقالات الاهتمام لتحسين وتعظيم العلاج بالخلايا الجذعية. الهدف من هذا البروتوكول هو إدخال تقنية بسيطة ومباشرة لزرع الخلايا الجذعية النخاعية النخاعية المشتقة من نخاع العظم (MSCs) باستخدام هيدروكسيفينيل هيدروجيل (GH) هيدروجيل. الهيدروجيل مواتية كمنصة تسليم الخلايا لتطبيقات هندسة الأنسجة القلبية بسبب قدرتها على أن تكون مشتركة مرتبطة في الموقع وارتفاع التوافق الحيوي. نقدم طريقة بسيطة لاصطناق هيدروجيلات GH تحميل MSC (MSC / hydrogels) وتقييم بقائها وانتشارها في ثلاثي الأبعاد (3D) في الثقافة المختبرية. بالإضافة إلى ذلك ، نبرهن على تقنية لزراعة MSC / hydrogels داخل القلب في الفئران ، واصفين إجراءً جراحيًا للحث على احتشاء عضلة القلب (MI) عبر ربط الشريان التاجي السفلي (LAD) الخلفي وزرع MSC / hydrogels اللاحقة.
Introduction
وقد برز العلاج بالخلايا الجذعية القلبية كمقاربة محتملة لإصلاح عضلة القلب وتجديد1,2. على الرغم من النتائج الإيجابية الأخيرة في النماذج الحيوانية والتجارب السريرية، فإن تطبيق العلاج القائم على الخلايا الجذعية لإصلاح عضلة القلب محدود بسبب انخفاض الاحتفاظ بالخلايا المحقونة وسوء بقائها على قيد الحياة في أنسجة القلب المُفرَّجة3،4. ونتيجة لذلك، استخدام هندسة الأنسجة القائمة على الخلايا، بما في ذلك المواد الحيوية عن طريق الحقن5، بقع القلب6، والأوراق الخلوية7، وقد درست بشكل مكثف لتحسين الاحتفاظ بالخلايا والتكامل داخل عضلة القلب المضيف.
من بين مختلف النهج المحتملة لإصلاح أنسجة القلب الهندسة الحيوية، والهيدروجين القابلة للحقن جنبا إلى جنب مع أنواع الخلايا المناسبة، مثل الخلايا الجذعية mesenchymal (MSCs)، والخلايا الجذعية الجنينية (ESCs)، والخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs)، هي خيار جذاب لتسليم الخلايا بفعالية في المناطق عضلة القلب8،9. الجيلاتين، وهو بوليمر طبيعي معروف، يمكن استخدامه كمصفوفة قابلة للحقن بسبب قدرتها البيولوجية الكبيرة، والتحلل الحيوي الكبير، وانخفاض المناعة بالمقارنة مع مجموعة واسعة من المواد الحيوية المستخدمة في التطبيقات الطبية الحيوية. على الرغم من أن منصات حقن الجيلاتين القائمة لديها إمكانات كبيرة, لا تزال تطبيقها في الجسم الحي محدودة على أساس صلابة الميكانيكية المنخفضة وسهولة التحلل في البيئة الفسيولوجية.
للتغلب على هذه القيود، تم اقتراح تصميم رواية وبسيطة من الهيدروجيلات القائم على الجيلاتين تتكون من حمض البرروبيونيك هيدروكسي فينيل لتطبيقات في الجسم الحي. يمكن أن تكون الدعامات اليليباتية-هيدروكسيفينيل بروبيونيك (GH) مترافقات عبر مرتبطة في الموقع في وجود إنزيم، بيروكسيديز الفجل (HRP)، وتغليف في وقت لاحق مختلف الأدوية، الجزيئات الحيوية، أو الخلايا داخل الهيدروجيل، مما يشير إلى إمكانات كبيرة في تطبيقات هندسة الأنسجة10،11،13،14. وبالإضافة إلى ذلك، قمنا مؤخرا بالتحقيق في الآثار العلاجية للHGH الهيدروجيل التي تحتوي على MSCs مغلفة وأظهرت استخدامها في إصلاح القلب الناجح وتجديد بعد MI في نموذج مورين15. في هذا البروتوكول، نحن وصف تقنية بسيطة للتغليف وفي المختبر ثلاثي الأبعاد (3D) انتشار MSCs داخل الهيدروجيلات GH. كما نقدم إجراءً جراحيًا مصممًا لتوليد نموذج murine MI عن طريق ربط الشريان التاجي وزراعة القلب داخل القلب من الهيدروجيل GH الذي يتم تحميله MSC في القلب المُهذب.
Protocol
Representative Results
Discussion
حقن هيدروجيلس GH لديها إمكانات كبيرة في التطبيقات في الجسم الحي بسبب قدرتها على دمج متجانسة العوامل العلاجية المتنوعة في الموقع. وعلاوة على ذلك، يمكن التلاعب بسهولة بخواصها الفيزيائية والبيوكيميائية استنادا إلى المتطلبات التي تعتمد على الأمراض. في هذا الصدد، وقد اقترح هيدروجيلس عن طريق ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم هذا البحث من قبل برنامج بحوث العلوم الأساسية من خلال مؤسسة البحوث الوطنية في كوريا (NRF) الممولة من وزارة التربية والتعليم (NRF-2018R1D1A02049346)
Materials
| 4 % paraformaldehyde (PFA) | Intron | IBS-BP031-2 | |
| 5-0 silk suture | AILEE | SK534 | |
| 8-0 polypropylene suture | ETHICON | M8732H | |
| 8-well chamber slide | Nunc LAB-TEK | 154534 | |
| Angiocath Plus (22GA) catheter | BD Angiocath Plus | REF382423 | |
| Antibiotic-antimyocotic | Gibco | 15240-062 | |
| Centrifuge | GYROGEN | 1582MGR | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 | |
| Cover slipe | MARIENFELD | 101242 | |
| Deluxe High Temperature Cautery kit | Bovie | QTY1 | |
| DMEM | Gibco | 11995-065 | |
| DPBS | Gibco | 14040-133 | |
| Dual-syringe | |||
| EOSIN | SIGMA-ALDRICH | HT110116 | |
| Ethanol | EMSURE | K49350783 739 | |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| Fechtner conjunctiva forceps titanium | WORLD PRECISISON INSTRUMENTS | WP1820 | |
| Fluorescein isothiocyanate isomer I (FITC) | SIGMA-ALDRICH | F7250 | |
| Forcep | HEBU | HB0458 | |
| Hair removal cream | Ildong Pharmaceutical | ||
| Heating pad | Stoelting | 50300 | Homeothermic Blanket System |
| 50301 | Replacement Heating Pad for 50300 (10 X 12.5cm) | ||
| Hematoxylin | SIGMA-ALDRICH | HHS80 | |
| Horseradish peroxide (HRP; 250-330 U/mg) | SIGMA-ALDRICH | P8375 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2; 30 wt % in H2O) | SIGMA-ALDRICH | 216763 | |
| Iodine | Green Pharmaceutical | ||
| LIVE/DEAD cell staining kit | Thermo Fisher | R37601 | |
| Mechanical ventilator | Harvard Apparatus | ||
| Micro centrifuge | HANIL | Micro 12 | |
| Micro needle holder | KASCO | 37-1452 | |
| Micro scissor | HEBU | HB7381 | |
| Microscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| MT staining kit | SIGMA-ALDRICH | HT1079-1SET | Weigert’s iron hematoxylin solution |
| HT15-1KT | Trichrome Stain (Masson) Kit | ||
| Paraffin | LK LABKOREA | H06-660-107 | |
| PBS buffer | Gibco | 10010-023 | |
| PHK26 staining kit | SIGMA-ALDRICH | MINI26 | |
| Slide scanner | Leica | SCN400 | |
| Surgical scissor | HEBU | HB7454 | |
| Surgical tape | 3M micopore | 1530-1 | |
| Tissue cassette | Scilab Korea | Cas3003 | |
| Transducer gel | SUNGHEUNG | SH102 | |
| Trout-Barraquer needle holder curved | KASCO | 50-3710c | |
| Ultrasound system | Philips | Affiniti 50 | |
| Xylene | JUNSEI | 25175-0430 |
References
- Jhund, P. S., McMurray, J. J. Heart failure after acute myocardial infarction: a lost battle in the war on heart failure. Circulation. 118 (20), 2019-2021 (2008).
- Cahill, T. J., Kharbanda, R. K. Heart failure after myocardial infarction in the era of primary percutaneous coronary intervention: Mechanisms, incidence and identification of patients at risk. World Journal of Cardiology. 9 (5), 407-415 (2017).
- Cambria, E., et al. Translational cardiac stem cell therapy: advancing from first-generation to next-generation cell types. npj Regenerative Medicine. 2, 17 (2017).
- Lemcke, H., Voronina, N., Steinhoff, G., David, R. Recent Progress in Stem Cell Modification for Cardiac Regeneration. Stem Cells International. 2018, 1909346 (2018).
- Alagarsamy, K. N., Yan, W., Srivastava, A., Desiderio, V., Dhingra, S. Application of injectable hydrogels for cardiac stem cell therapy and tissue engineering. Reviews in Cardiovascular Medicine. 20 (4), 221-230 (2019).
- Gaetani, R., et al. Epicardial application of cardiac progenitor cells in a 3D-printed gelatin/hyaluronic acid patch preserves cardiac function after myocardial infarction. Biomaterials. 61, 339-348 (2015).
- Gao, L., et al. Myocardial Tissue Engineering With Cells Derived From Human-Induced Pluripotent Stem Cells and a Native-Like, High-Resolution, 3-Dimensionally Printed Scaffold. Circualtion Research. 120 (8), 1318-1325 (2017).
- Hasan, A., et al. Injectable Hydrogels for Cardiac Tissue Repair after Myocardial Infarction. Advanced Science. 2 (11), 1500122 (2015).
- Wu, R., Hu, X., Wang, J. Concise Review: Optimized Strategies for Stem Cell-Based Therapy in Myocardial Repair: Clinical Translatability and Potential Limitation. Stem Cells. 36 (4), 482-500 (2018).
- Lee, Y., et al. In situ forming gelatin-based tissue adhesives and their phenolic content-driven properties. Journal of Materials Chemistry B. 1 (18), 2407-2414 (2013).
- Lee, Y., Bae, J. W., Lee, J. W., Suh, W., Park, K. D. Enzyme-catalyzed in situ forming gelatin hydrogels as bioactive wound dressings: effects of fibroblast delivery on wound healing efficacy. Journal of Materials Chemistry B. 2 (44), 7712-7718 (2014).
- Lee, S. H., et al. In situ Crosslinkable Gelatin Hydrogels for Vasculogenic Induction and Delivery of Mesenchymal Stem Cells. Advanced Functional Materials. 24 (43), 6771-6781 (2014).
- Jung, B. K., et al. A hydrogel matrix prolongs persistence and promotes specific localization of an oncolytic adenovirus in a tumor by restricting nonspecific shedding and an antiviral immune response. Biomaterials. 147, 26-38 (2017).
- Kim, G., et al. Tonsil-derived mesenchymal stem cell-embedded in situ crosslinkable gelatin hydrogel therapy recovers postmenopausal osteoporosis through bone regeneration. PLoS One. 13 (7), 0200111 (2018).
- Kim, C. W., et al. MSC-Encapsulating in situ Cross-Linkable Gelatin Hydrogels To Promote Myocardial Repair. ACS Applied Bio Materials. 3 (3), 1646-1655 (2020).
- Meirelles Lda, S., Nardi, N. B. Murine marrow-derived mesenchymal stem cell: isolation, in vitro expansion, and characterization. Br J Haematol. 123 (4), 702-711 (2003).
- Ojha, N., et al. Characterization of the structural and functional changes in the myocardium following focal ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 294 (6), 2435-2443 (2008).
- Takagawa, J., et al. Myocardial infarct size measurement in the mouse chronic infarction model: comparison of area- and length-based approaches. Journal of Applied Physiology. 102 (6), 2104-2111 (2007).
- Terrovitis, J., et al. Noninvasive Quantification and Optimization of Acute Cell Retention by In vivo Positron Emission Tomography After Intramyocardial Cardiac-Derived Stem Cell Delivery. Journal of the American College of Cardiology. 54 (17), 1619-1626 (2009).
- Dib, N., Khawaja, H., Varner, S., McCarthy, M., Campbell, A. Cell Therapy for Cardiovascular Disease: A Comparison of Methods of Delivery. Journal of Cardiovascular Translational Research. 4 (2), 177-181 (2011).
