ספירה מדויקת של זקיקים בשחלות עכברים למבוגרים
Summary
כאן, אנו מתארים, להשוות, ולהשוות שתי טכניקות שונות לספירת זקיק מדויקת של רקמות השחלות עכבר קבוע.
Abstract
יונקים נקביים המתרבים מינית נולדים עם כל אספקת ביציות לכל החיים שלהם. ביציות לא בוגרות ורגיעה נמצאות בתוך זקיקים ראשוניים, יחידת האחסון של הנבט הנשי. הם אינם מתחדשים, ולכן מספרם בלידה ושיעור האובדן שלאחר מכן מכתיב במידה רבה את תוחלת החיים הפורייה הנשית. כימות מדויק של מספרי זקיקים ראשוניים אצל נשים ובעלי חיים חיוני לקביעת ההשפעה של תרופות ורעילים על שמורת השחלות. כמו כן, יש צורך להעריך את הצורך, ואת ההצלחה של, טכניקות שימור פוריות קיימות ומתפתחות. נכון לעכשיו, אין שיטות קיימות כדי למדוד במדויק את מספר הזקיקים הקדמוניים המרכיבים את עתודת השחלות אצל נשים. יתר על כן, קבלת רקמת השחלות מבעלי חיים גדולים או מינים בסכנת הכחדה לניסויים היא לעתים קרובות לא ריאלי. לכן, עכברים הפכו מודל חיוני עבור מחקרים כאלה, ואת היכולת להעריך מספרי זקיק ראשוני בשחלות עכבר שלמות הוא כלי קריטי. עם זאת, דיווחים על מספרי זקיקים מוחלטים בשחלות העכבר בספרות הם משתנים מאוד, מה שמקשה על השוואה ו/או שכפול נתונים. זאת בשל מספר גורמים, כולל מתח, גיל, קבוצות טיפול, כמו גם הבדלים טכניים בשיטות הספירה המועסקים. במאמר זה, אנו מספקים מדריך הדרכה שלב אחר שלב להכנת מקטעים היסטולוגיים ולספירת זקיקים ראשוניים בשחלות עכבר בשתי שיטות שונות: [1] סטריאולוגיה, המסתמכת על טכניקת מפרק השבר/אופטי; ו[2] טכניקת הספירה הישירה. חלק מהיתרונות והחסרונות המרכזיים של כל שיטה יודגשו כך שניתן יהיה לשפר את השחזור בתחום ולאפשר לחוקרים לבחור את השיטה המתאימה ביותר למחקריהם.
Introduction
הביציות הלא בוגרות, שנעצרו באופן מיוטי, המאוחסנות בתוך זקיקים ראשוניים בשחלה, הן יחידת האחסון של הנבט הנשי ומהוות את שמורת השחלות לכל החיים של הפרט. מספרי זקיק ראשוני לרדת באופן טבעי עם גיל1, או לחילופין, יכול להיות מדולדל בטרם עת בעקבות חשיפה לכימיקלים אקסוגני, כולל כמה תרופות רעילים סביבתיים באוויר, מזון ומים2. בהינתן שמספר הזקיק הקדמוני הוא סופי, כמות ואיכות הזקיקים הנמצאים בשחלה קובעות במידה רבה את פוריות הנשית ואת בריאות הצאצאים. לכן, כימות מדויק של מספר זקיק ראשוני אצל נשים חיוני להערכת ההשפעות מחוץ ליעד של עלבונות אקסוגני על עתודת השחלות.
אצל נשים, ניתוח של השחלה כולה הוא בדרך כלל לא אפשרי, ולכן אמצעים פונדקאיים לא פולשניים של עתודת השחלות חייב להיות מנוצל בסביבה קלינית. הורמון אנטי Mϋllerian (AMH) הוא הסמן הביולוגי הפונדקאי הנפוץ ביותר קלינית3. רמות AMH בסרום נמדדות לעתים קרובות אצל נשים בגיל אימהי מתקדם, או לפני ואחרי טיפול בסרטן, כגון כימותרפיה. עם זאת, AMH מופק על ידי זקיקים גדל ולא על ידי זקיקים ראשוניים, ולכן, רמות הסרום אינם מודיעים על מספר זקיק ראשוני מוחלט.
עם היעדר שיטות כדי לקבוע במדויק את מספר הזקיק הקדמוני אצל נשים באתרו, ספירת זקיקי השחלות במודלים בעלי חיים קטנים, כגון מכרסמים, נשאר כלי מחקר חיוני כדי להעריך את המידה שבה עלבונות אקסוגני להשפיע על זקיקים ראשוניים ובכך, פוריות. למרבה הצער, דיווחים לאורך הספרות של מספרי זקיק ראשוניים במודלים מכרסמים הם משתנים מאוד4. סיבה מרכזית לכך היא הבדלים טכניים שדווחו בהרחבה בשיטת הספירה שננקטה. בעיקר, ישנן שתי טכניקות שונות המתוארות בספרות לספירת זקיקים ראשוניים בעכברים. אלה כוללים סטריאולוגיה, אשר משתמשת בשיטת מפרק אופטי שבר, וספירת זקיק ישירה.
סטריאולוגיה נחשבת תקן הזהב כפי שהוא משתמש דגימה אקראית אחידה שיטתית5, מה שהופך אותו השיטה המדויקת ביותר של כימות מספר זקיק ראשוני בעכבר כולו, או שחלותעכברוש 4,6,7. הסטריאולוגיה אינה משוחדת, שכן היא מהווה את המבנה התלת מימדי של מושא העניין8. בשיטת מפרק/שבר אופטי, מוחלות שלוש רמות דגימה כדי לכמת זקיקים ראשוניים באמצעות מקטעי רקמה עבים (למשל, 20 מיקרומטר) בתוך שבר ידוע של השחלה הכוללת של העכבר. ראשית, מרווח הדגימה נבחר (למשל, כל מקטע3) בהתחלה אקראית (דגימת שבר 1, f1)4. לאחר מכן נדגמים חלקים באופן שיטתי ואחיד מנקודה זו דרך השחלה כולה. לאחר מכן, מסגרת ספירה לא משוחדת מודבקת על החלק השחלתי ומוזזת בהדרגה לאורך רשת ספירה מוגדרת ואקראית (דגימת שבר 2, f2)8. לבסוף, חלק ידוע של עובי המקטע נדגם אופטית (למשל, 10 מיקרומטר) וזקיקים בתוך אזור זה נספרים (דגימת שבר 3, f3)4. מספר הזקיק הגולמי מוכפל בהיפוך של שברי דגימה אלה כדי להשיג את הערך הסופי. שיטה זו דורשת הכשרה וציוד מומחים, כולל מיקרוסקופ עם שלב ממונע המונע על ידי תוכנה סטריאולוגית. רקמות צריך להישמר בתיקון של Bouin מיוחד, מוטבע שרף glycolmethacrylate כדי לאפשר מקטעי רקמה עבה להיחתך באמצעות microtome שרף glycolmethacrylate עם סכין זכוכית. שיטה זו נועדה להסביר הצטמקות רקמות ועיוות, כדי לשמר בצורה הטובה ביותר את המבנה המורפולוגי התלת מימדי של השחלה וזקיקים9.
ספירת זקיקים ישירה היא השיטה הנפוצה ביותר לספירת זקיקים10. קיבועים נפוצים יותר (כלומר, פורמלין) ניתן להשתמש, ואחריו הטמעת שעווה פרפין וסעיף סדרתי ממצה באמצעות microtome סטנדרטי בעובי של בין 4-6 מיקרומטר. זקיקים נספרים באופן שיטתי במקטע הרקמה כולו במרווח מוגדר, ולאחר מכן מוכפלים בהיפוך של מרווח הדגימה כדי להשיג את הערכת הזקיק הכוללת. שיטה זו היא מהירה, קלה, ניתן לבצע באמצעות רקמות בארכיון, ומוכן באמצעות טכניקות היסטולוגיות סטנדרטיות. זה דורש רק מיקרוסקופ אור עם יכולות הדמיה סטנדרטיות. עם זאת, למרות יתרונות אלה, ספירת זקיקים ישירה חסרה את הדיוק ואת הפרמטרים ספירה קפדנית של סטריאולוגיה, מה שהופך אותו נוטה יותר הטיה החוקר. בנוסף, רקמות עלולות לעבור הצטמקות ועיוות במהלך העיבוד, לשבש את השלמות והמורפולוגיה של השחלה ובכך להקשות על סיווג זקיק וכימות.
מטרת מאמר זה היא לתאר שתי שיטות נפוצות להערכת כמותית של מספר זקיק ראשוני בשחלות עכבר: סטריאולוגיה וספירת זקיקים ישירה. אנו נספק פרוטוקולים מפורטים לשתי שיטות אלה ונדגיש כמה מהחוזקות והחולשות שלהם, על מנת לשפר את הרבייה בתחום שלנו ולאפשר לחוקרים לקבל החלטה מושכלת של שיטת הספירה המתאימה ביותר למחקריהם.
Protocol
Representative Results
Discussion
מאמר זה מספק פרוטוקול שלב אחר שלב עבור טכניקת תקן הזהב לספירת זקיקים ראשוניים של העכבר, סטריאולוגיה, ואת השיטה הנפוצה יותר של ספירת זקיקים ישירה. טיפול כימותרפי שימש כדי להשוות ולהשוות את התוצאות שהתקבלו משתי שיטות שונות אלה בתוך השחלה השמאלית והימנית מאותה חיה. שתי השיטות חשפו שונות גבוה…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו התאפשרה באמצעות תמיכה ממשלתית ויקטוריאנית בתשתיות תפעוליות וממשלת אוסטרליה NHMRC IRIISS ונתמכה על ידי מימון המועצה הלאומית לבריאות ומחקר רפואי (ALW #1120300) ומועצת המחקר האוסטרלית (KJH #FT190100265). המחברים רוצים להכיר בתמיכה הטכנית של פלטפורמת המחקר בבעלי חיים מונאש, פלטפורמת היסטולוגיה מונאש ומתקן הדמיה מיקרו מונאש.
Materials
| 1-Butanol (HPLC) | Fisher Chemical | #A383-1 | |
| Acid alcohol | Amber Scientific | #ACDL | |
| Bouin’s fixative | Sigma-Aldrich | #HT10132 | Picric acid 0.9% (w/v), formaldehyde 9% (v/v), acetic acid 5% (w/v) |
| Cyclophosphamide | Sigma-Aldrich | #C0768-5G | |
| Dibutylphthalate Polystyrene Xylene (DPX) | Sigma-Aldrich | #06522 | |
| Ethanol | Amber Scientific | #ETH | Ethanol 100% |
| Micro Feather opthalmic scalpel with aluminium handle | Designs for Vision | #FEA-745-SR | Feather blade for dissections (seen in Figure 1) |
| Formalin fixative | Australian Biostain | #ANBFC | |
| Glass coverslip | Thermo Scientific | #MENCS22501GP | 22 mm x 50 mm |
| Glycomethacrylate resin RM2165 microtome | Leica Microsystems | #RM2165 | |
| Glycolmethacrylate DPX | *made in house | *Mix 1.5 L Xylene; 800 g polystyrene pellets; 100mL Dibutyl phthalate for 3 weeks | |
| Histolene | Trajan | #11031 | |
| Mayer’s haematoxylin | Amber Scientific | #MH | |
| Olympus BX50 microscope | Olympus | #BX50 | Brightfield microscope fitted with 10x dry & 100x oil immersion objective (numerical aperture 1.3) |
| Olympus immersion oil type-F | Olympus | #IMMOIL-F30CC | |
| Olympus TH4-200 light source | Olympus | #TH4-200 | |
| Paraffin wax | Sigma-Aldrich | #03987 | |
| Periodic acid | Trajan | #PERI1% | Periodic acid 1% |
| Rotary Microtome CUT 4060 | MicroTec | #4060R/F | Used to cut paraffin sections |
| Schiff’s reagent | Trajan | #SCHF | |
| Scott's tap water | Amber Scientific | #SCOT | Potassium carbonate, magnesium sulphate, water |
| StereoInvestigator Stereological System | MBF Bioscience | Includes StereoInvestigator software, multi-control unit, automatic stage and joystick | |
| Superfrost microscope slides | Thermo Scientific | #MENSF41296SP | 1 mm, 72 pcs |
| Technovit 7100 Plastic embedding system | Emgrid Australia | #64709003 | 500 mL/5 x 1 g/40 mL |
| Technovit 3040 yellow | Emgrid Australia | #64708805 | 100 g/80 mL |
References
- Stringer, J. M., Winship, A., Liew, S. H., Hutt, K. The capacity of oocytes for DNA repair. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (15), 2777-2792 (2018).
- Winship, A. L., Stringer, J. M., Liew, S. H., Hutt, K. J. The importance of DNA repair for maintaining oocyte quality in response to anti-cancer treatments, environmental toxins and maternal ageing. Human Reproduction Update. 24 (2), 119-134 (2018).
- Broer, S. L., Broekmans, F. J., Laven, J. S., Fauser, B. C. Anti-Mullerian hormone: ovarian reserve testing and its potential clinical implications. Human Reproduction Update. 20 (5), 688-701 (2014).
- Myers, M., Britt, K. L., Wreford, N. G., Ebling, F. J., Kerr, J. B. Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary. Reproduction. 127 (5), 569-580 (2004).
- Boyce, R. W., Dorph-Petersen, K. A., Lyck, L., Gundersen, H. J. Design-based stereology: introduction to basic concepts and practical approaches for estimation of cell number. Toxicologic Pathology. 38 (7), 1011-1025 (2010).
- Ristic, N., et al. Maternal dexamethasone treatment reduces ovarian follicle number in neonatal rat offspring. Journal of Microscopy. 232 (3), 549-557 (2008).
- Soleimani Mehranjani, M., Mansoori, T. Stereological study on the effect of vitamin C in preventing the adverse effects of bisphenol A on rat ovary. International Journal of Reproductive Biomedicine (Yazd). 14 (6), 403-410 (2016).
- Brown, D. L. Bias in image analysis and its solution: unbiased stereology. Journal of Toxicologic Pathology. 30 (3), 183-191 (2017).
- Hasselholt, S., Lykkesfeldt, J., Overgaard Larsen, J. Thick methacrylate sections devoid of lost caps simplify stereological quantifications based on the optical fractionator design. Anatomical Record (Hoboken). 298 (12), 2141-2150 (2015).
- Tilly, J. L. Ovarian follicle counts–not as simple as 1, 2, 3. Reproductive Biology and Endocrinology. 1, 11 (2003).
- Nguyen, Q. N., et al. Loss of PUMA protects the ovarian reserve during DNA-damaging chemotherapy and preserves fertility. Cell Death and Disease. 9 (6), 618 (2018).
- Meirow, D., Assad, G., Dor, J., Rabinovici, J. The GnRH antagonist cetrorelix reduces cyclophosphamide-induced ovarian follicular destruction in mice. Human Reproduction. 19 (6), 1294-1299 (2004).
- Winship, A. L., et al. The PARP inhibitor, olaparib, depletes the ovarian reserve in mice: implications for fertility preservation. Human Reproduction. , (2020).
- Meirow, D., Lewis, H., Nugent, D., Epstein, M. Subclinical depletion of primordial follicular reserve in mice treated with cyclophosphamide: clinical importance and proposed accurate investigative tool. Human Reproduction. 14 (7), 1903-1907 (1999).
- Nguyen, Q. N., et al. Cisplatin- and cyclophosphamide-induced primordial follicle depletion is caused by direct damage to oocytes. Molecular Human Reproduction. , (2019).
- Gundersen, H. J., Jensen, E. B. The efficiency of systematic sampling in stereology and its prediction. Journal of Microscopy. 147, 229-263 (1987).
- Olesen, M. V., Needham, E. K., Pakkenberg, B. The Optical Fractionator Technique to Estimate Cell Numbers in a Rat Model of Electroconvulsive Therapy. Journal of Visualized Experiments. (125), e55737 (2017).
- Findlay, J. K., Hutt, K. J., Hickey, M., Anderson, R. A. How Is the Number of Primordial Follicles in the Ovarian Reserve Established. Biology of Reproduction. 93 (5), 111 (2015).
- Omari, S., et al. Mcl-1 is a key regulator of the ovarian reserve. Cell Death and Disease. 6, 1755 (2015).
- Winship, A. L., Bakai, M., Sarma, U., Liew, S. H., Hutt, K. J. Dacarbazine depletes the ovarian reserve in mice and depletion is enhanced with age. Scientific Reports. 8 (1), 6516 (2018).
- Miller, P. B., Charleston, J. S., Battaglia, D. E., Klein, N. A., Soules, M. R. An accurate, simple method for unbiased determination of primordial follicle number in the primate ovary. Biology of Reproduction. 56 (4), 909-915 (1997).
- Miller, P. B., Charleston, J. S., Battaglia, D. E., Klein, N. A., Soules, M. R. Morphometric analysis of primordial follicle number in pigtailed monkey ovaries: symmetry and relationship with age. Biology of Reproduction. 61 (2), 553-556 (1999).
- Charleston, J. S., et al. Estimating human ovarian non-growing follicle number: the application of modern stereology techniques to an old problem. Human Reproduction. 22 (8), 2103-2110 (2007).
- Hansen, K. R., Craig, L. B., Zavy, M. T., Klein, N. A., Soules, M. R. Ovarian primordial and nongrowing follicle counts according to the Stages of Reproductive Aging Workshop (STRAW) staging system. Menopause. 19 (2), 164-171 (2012).
- Hansen, K. R., et al. A new model of reproductive aging: the decline in ovarian non-growing follicle number from birth to menopause. Human Reproduction. 23 (3), 699-708 (2008).
- Sonigo, C., et al. High-throughput ovarian follicle counting by an innovative deep learning approach. Scientific Reports. 8 (1), 13499 (2018).
- McKey, J., Cameron, L. A., Lewis, D., Batchvarov, I. S., Capel, B. Combined iDISCO and CUBIC tissue clearing and lightsheet microscopy for in toto analysis of the adult mouse ovarydagger. Biology of Reproduction. 102 (5), 1080-1089 (2020).
- Kagami, K., Shinmyo, Y., Ono, M., Kawasaki, H., Fujiwara, H. Three-dimensional evaluation of murine ovarian follicles using a modified CUBIC tissue clearing method. Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 72 (2018).
