Enumeración exacta del folículo en ovarios adultos del ratón

Summary

Aquí, describimos, comparamos, y ponemos en contraste dos diversas técnicas para la cuenta exacta del folículo de tejidos ováricos fijos del ratón.

Abstract

Las hembras que se reproducen sexualmente nacen con su suministro de ovocitos durante toda su vida. Los ovocitos inmaduros y quietos se encuentran dentro de los folículos primordiales, la unidad de almacenamiento de la línea germinal femenina. No son renovables, por lo que su número al nacer y la posterior tasa de pérdida dictan en gran medida la esperanza de vida fértil de la mujer. La cuantificación precisa del número de folículos primordiales en mujeres y animales es esencial para determinar el impacto de los medicamentos y tóxicos en la reserva ovárica. También es necesario para evaluar la necesidad y el éxito de las técnicas de preservación de la fertilidad existentes y emergentes. Actualmente, no existen métodos para medir con precisión el número de folículos primordiales que comprenden la reserva ovárica en las mujeres. Además, la obtención de tejido ovárico de animales grandes o especies en peligro de extinción para la experimentación a menudo no es factible. Por lo tanto, los ratones se han convertido en un modelo esencial para tales estudios, y la capacidad de evaluar los números de folículos primordiales en ovarios enteros de ratón es una herramienta crítica. Sin embargo, los informes de los números absolutos del folículo en ovarios del ratón en la literatura son altamente variables, haciendo difícil comparar y/o replicar datos. Esto se debe a una serie de factores que incluyen la tensión, la edad, los grupos de tratamiento, así como las diferencias técnicas en los métodos de conteo empleados. En este artículo, proporcionamos una guía instructiva paso a paso para preparar secciones histológicas y contar folículos primordiales en ovarios de ratón utilizando dos métodos diferentes: [1] estereología, que se basa en la técnica de fraccionador / disector óptico; y [2] la técnica de conteo directo. Se destacarán algunas de las principales ventajas e inconvenientes de cada método para que se pueda mejorar la reproducibilidad en el campo y para que los investigadores puedan seleccionar el método más adecuado para sus estudios.

Introduction

Los ovocitos inmaduros, meiotically-arrestados almacenados dentro de los folículos primordiales en el ovario son la unidad de almacenamiento para la línea germinal femenina y comprenden la reserva ovárica de por vida de un individuo. Los números de folículos primordiales disminuyen naturalmente con la edad^{de 1,}o alternativamente, pueden agotarse prematuramente después de la exposición a productos químicos exógenos, incluidos algunos productos farmacéuticos y tóxicos ambientales en el aire, los alimentos y el agua^2. Dado que el número de folículos primordiales es finito, la cantidad y calidad de los folículos presentes en el ovario determinan en gran medida la fertilidad femenina y la salud de la descendencia. Así, la cuantificación exacta del número primordial del folículo en mujeres es esencial para evaluar los impactos fuera de la blanco de insultos exógenos en la reserva ovárica.

En las mujeres, el análisis de todo el ovario generalmente no es posible, por lo que las medidas sustitutas no invasivas de la reserva ovárica deben utilizarse en un entorno clínico. La hormona anti-mϋlleriana (AMH) es el biomarcador sustituto más utilizado clínicamente³. Los niveles séricos de AMH a menudo se miden en mujeres de edad materna avanzada, o antes y después del tratamiento del cáncer, como la quimioterapia. Sin embargo, la AMH es producida por folículos en crecimiento y no por folículos primordiales, y por lo tanto, los niveles séricos no informan sobre el número absoluto de folículos primordiales.

Con la ausencia de métodos para determinar con precisión el número de folículos primordiales en mujeres in situ,el recuento de folículos ováricos en modelos animales pequeños, como los roedores, sigue siendo una herramienta de investigación esencial para evaluar el grado en que los insultos exógenos impactan en los folículos primordiales y, por lo tanto, en la fertilidad. Desafortunadamente, sin embargo, los informes a lo largo de la literatura de los números de folículos primordiales en modelos de roedores son altamente^{variables 4}. Una de las principales razones de esto son las diferencias técnicas ampliamente reportadas en el método de conteo empleado. Predominantemente, hay dos técnicas diferentes descritas en la literatura para enumerar folículos primordiales en ratones. Estos incluyen la estereología, que emplea el método de disector óptico del fraccionador, y los recuentos directos de folículos.

La estereología es ampliamente considerada el patrón oro, ya que utiliza el muestreo aleatorio uniforme sistemático^5,por lo que es el método más preciso de cuantificar el número de folículos primordiales en ratones enteros, o ovarios de rata^4,6,7. La estereología es imparcial, ya que explica la estructura tridimensional del objeto de interés⁸. Utilizando un método de disector/fraccionador óptico, se aplican tres niveles de muestreo para cuantificar los folículos primordiales utilizando secciones gruesas de tejido (por ejemplo, 20 μm) dentro de una fracción conocida del ovario total del ratón. En primer lugar, se elige el intervalo de muestreo (por ejemplo, cada^3ª sección) al azar (fracción de muestreo 1, f₁₎^4. Las secciones se muestrea de una manera sistemática y uniforme desde este punto hasta todo el ovario. Luego, un marco de conteo imparcial se superpone sobre la sección ovárica y se mueve progresivamente a lo largo de una cuadrícula de conteo definida y aleatoria (fracción de muestreo 2, f₂₎^8. Por último, se muestrea ópticamente una fracción conocida del espesor de la sección (por ejemplo, 10 μm) y se cuentan los folículos dentro de esta área (fracción de muestreo 3, f₃₎^4. El número de folículos en bruto se multiplica por la inversa de estas fracciones de muestreo para obtener el valor final. Este método requiere capacitación y equipo de expertos, incluido un microscopio con una etapa motorizada impulsada por un software estereológico. Los tejidos deben preservarse en un fijador especializado de Bouin, e incrustarse en resina de glicolmetacrilato para permitir que las secciones gruesas de tejido se corten utilizando un microtome de resina de glicolmetacrilato con un cuchillo de vidrio. Este método está diseñado para explicar la contracción y deformación de los tejidos, para preservar mejor la estructura morfológica tridimensional del ovario y los folículos^9.

El conteo directo de folículos es el método más utilizado para contar folículos¹⁰. Se pueden usar fijadores más comunes (es decir, formol), seguidos de incrustación de cera de parafina y seccionamiento en serie exhaustivo utilizando un microtomo estándar a un espesor de entre 4-6 μm. Los folículos se cuentan sistemáticamente en toda la sección del tejido en un intervalo definido, y luego se multiplican por la inversa del intervalo de muestreo para obtener la estimación del folículo total. Este método es rápido, fácil, se puede realizar usando tejidos archivados, y preparado usando técnicas histológicas estándar. Requiere solamente un microscopio ligero con capacidades estándar de la proyección de imagen. Sin embargo, a pesar de estas ventajas, el conteo directo de folículos carece de la precisión y los parámetros de conteo estrictos de la estereología, lo que lo hace más propenso al sesgo del investigador. Además, los tejidos pueden sufrir contracción y deformación durante el procesamiento, interrumpiendo la integridad y la morfología del ovario y, por lo tanto, dificultando la clasificación y cuantificación del folículo.

El objetivo de este artículo es describir dos métodos de uso común para evaluar cuantitativamente el número de folículos primordiales en los ovarios de ratón: estereología y recuento directo de folículos. Proporcionaremos protocolos detallados para estos dos métodos y destacaremos algunas de sus fortalezas y debilidades, con el fin de mejorar la reproducibilidad en nuestro campo y permitir a los investigadores tomar una decisión informada del método de conteo más apropiado para sus estudios.

Protocol

Los ovarios se recogieron de ratones hembra C57BL6J. Todos los procedimientos y experimentos con animales se realizaron de conformidad con el Código australiano de prácticas para el cuidado y uso de animales de la NHMRC y fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Plataforma de Investigación Animal de Monash. NOTA: Un agente quimioterapéutico demostrado para agotar los ovocitos del folículo primordial, según lo determinado usando la estereología11 y l…

Representative Results

Un modelo bien-caracterizado del agotamiento del folículo fue utilizado, por el que los ratones femeninos adultos jovenes fueran administrados una dosis sola de la quimioterapia del ciclofosfamida, o del control salino del vehículo (n=5/group) y ambos ovarios fueron cosechados de cada animal después de 48 horas. Se preparó un ovario por animal como se describe en el Paso 1 para cada uno de los dos métodos: estereología o recuentos directos. El ovario izquierdo y derecho de cada animal fue asignado aleatoriamente a …

Discussion

Este artículo proporciona un protocolo paso a paso para la técnica del patrón oro para enumerar los folículos primordiales del ratón, la estereología, y el método más comúnmente empleado de cuenta directa del folículo. El tratamiento de quimioterapia fue utilizado para comparar y para contrastar los resultados obtenidos de estos dos diversos métodos dentro del ovario izquierdo y derecho del mismo animal. Ambos métodos revelaron alta variabilidad inter-animal en números primordiales del folículo. Un agotamie…

Materials

1-Butanol (HPLC)	Fisher Chemical	#A383-1
Acid alcohol	Amber Scientific	#ACDL
Bouin’s fixative	Sigma-Aldrich	#HT10132	Picric acid 0.9% (w/v), formaldehyde 9% (v/v), acetic acid 5% (w/v)
Cyclophosphamide	Sigma-Aldrich	#C0768-5G
Dibutylphthalate Polystyrene Xylene (DPX)	Sigma-Aldrich	#06522
Ethanol	Amber Scientific	#ETH	Ethanol 100%
Micro Feather opthalmic scalpel with aluminium handle	Designs for Vision	#FEA-745-SR	Feather blade for dissections (seen in Figure 1)
Formalin fixative	Australian Biostain	#ANBFC
Glass coverslip	Thermo Scientific	#MENCS22501GP	22 mm x 50 mm
Glycomethacrylate resin RM2165 microtome	Leica Microsystems	#RM2165
Glycolmethacrylate DPX	*made in house		*Mix 1.5 L Xylene; 800 g polystyrene pellets; 100mL Dibutyl phthalate for 3 weeks
Histolene	Trajan	#11031
Mayer’s haematoxylin	Amber Scientific	#MH
Olympus BX50 microscope	Olympus	#BX50	Brightfield microscope fitted with 10x dry & 100x oil immersion objective (numerical aperture 1.3)
Olympus immersion oil type-F	Olympus	#IMMOIL-F30CC
Olympus TH4-200 light source	Olympus	#TH4-200
Paraffin wax	Sigma-Aldrich	#03987
Periodic acid	Trajan	#PERI1%	Periodic acid 1%
Rotary Microtome CUT 4060	MicroTec	#4060R/F	Used to cut paraffin sections
Schiff’s reagent	Trajan	#SCHF
Scott's tap water	Amber Scientific	#SCOT	Potassium carbonate, magnesium sulphate, water
StereoInvestigator Stereological System	MBF Bioscience		Includes StereoInvestigator software, multi-control unit, automatic stage and joystick
Superfrost microscope slides	Thermo Scientific	#MENSF41296SP	1 mm, 72 pcs
Technovit 7100 Plastic embedding system	Emgrid Australia	#64709003	500 mL/5 x 1 g/40 mL
Technovit 3040 yellow	Emgrid Australia	#64708805	100 g/80 mL