Summary
Genom düzenlemeden sonra mutant suşları oluşturmak ve sürdürmek için yumurtaların yetiştirilmesi, mikroenjeksiyonu ve ateş aşındırıcı Thermobia domestica'nın verimli çiftleşmesi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Ateş aşındırıcı Thermobia domestica, yeryüzünde başarılı evrimsel radyasyonlarına yol açan böceklerin gelişim mekanizmalarını incelemek için uygun ametabolous, kanatsız bir türdür. Genom düzenleme gibi genetik araçların uygulanması, Evo-Devo yaklaşımında evrimsel geçişlerden sorumlu olan genetik değişiklikleri anlamanın anahtarıdır. Bu yazıda, T. domestica'nınmutant suşlarını üretmek ve sürdürmek için mevcut protokolümüzü açıklıyoruz. Bildirilen ıslak enjeksiyon yöntemine alternatif olarak, enjekte edilen embriyolarda stably yüksek sağkalım oranları elde etmemizi sağlayan bir kuru enjeksiyon yöntemi rapor ediyoruz. Ayrıca yetişkinleri çiftleşmek ve sonraki nesilleri yüksek verimlilikle elde etmek için optimize edilmiş bir ortam ayarı bildiriyoruz. Yöntemimiz, genom düzenleme yöntemlerinin geleneksel olmayan model organizmalara başarılı bir şekilde uygulanması için her türün benzersiz biyolojisini dikkate almanın öneminin altını çizmektedir. Bu genom düzenleme protokollerinin T. domestica'nın bir laboratuvar modeli olarak uygulanmasına ve bu türdeki yararlı genetik araçların geliştirilmesini ve uygulanmasını daha da hızlandırmaya yardımcı olacağını öngörüyoruz.
Introduction
Thermobia domestica, atalardan kalma ametabolöz ve kanatsız bir yaşam döngüsünü koruyan en bazal böcek emirlerinden biri olan Zygentoma'ya aittir. Bu bazal filogenetik pozisyon ve atasal özellikler, bu türü, tanımlanan hayvan türlerinin% 70'inden fazlasını kapsayan Dünyadaki böceklerin başarısının altında kalan mekanizmaları incelemek için çekici bir model olarak belirledi1. T. domestica, nispeten kısa bir yaşam döngüsü (embriyodan üreme yetişkinine 2,5-3,0 ay) gibi laboratuvar modeli olarak uygun özellikleri nedeniyle böcek fizyolojisinin ata özelliklerini incelemek için uzun zamandır kullanılmaktadır; Şekil 1A) ve kolay bir üreme. Son otuz yılda, vücut planı, nöral farklılaşma ve sirkadiyen ritimler 2,3,4gibi çeşitli özelliklerin ata özelliklerini araştırmak için kullanımı genişletilmiştir.
T. domestica'da ileri genetik araçların uygulanması, geniş bir araştırma alanında bu tür katkıları daha da hızlandırabilir. Embriyolarda, nimflerde ve yetişkinlerde başarılı RNA paraziti (RNAi)- aracılı gen devrilmesi T. domestica4, 5,6'da bildirilmiştir. Sistemik RNAi'nin verimliliği hala türlere son derece bağımlıdır — örneğin, genellikle coleoptera'da yüksektir, lepidoptera sırasında ise düşüktür7. T. domestica'daki RNAi nakavtının etkinliği ve süresi henüz değerlendirilmedi. RNAi'ye ek olarak, daha önce T. domestica8'debaşarılı bir CRISPR / Cas9 aracılı gen nakavt bildirdik. CRISPR/Cas sistemi, böceklerde genom düzenlemesi için özellikle hedeflenen gen nakavtları için yaygın olarak uygulanmıştır. Kullanımı, CRISPR/ Cas sisteminin bileşenlerini çekirdek9'ateslim etmek için bir protokol kurulduktan sonra eksojen yapıları devirerek gen muhabiri tahlili, hücre soyu takibi ve transkripsiyonal aktivitenin manipülasyonu gibi diğer uygulamalar için genişletilebilir. Yayınlanan genom derlemesi10ile birlikte, CRISPR/ Cas tabanlı genom düzenlemenin T. domestica'da geniş kullanımı ve daha da geliştirilmesi, böceklerin olağanüstü adaptif başarısının arkasındaki evrimsel mekanizmalara odaklanan çalışmaları kolaylaştıracaktır. Burada, embriyo mikroenjeksiyonu ve CRISPR/Cas9 kullanarak mutant suşu oluşturmak için yetişkin T. domestica'nın çiftleşmesi için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz. Bu yeni yöntemi göz önünde bulundurarak, bu tekniklerin başarılı uygulamaları için geleneksel olmayan model türlerinin benzersiz biyolojisini göz önünde bulundurmanın önemini tartışıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Laboratuvar kolonilerinin bakımı
- Wildtype ve mutant popülasyonlarının bakımı için, düzenli yapay balık maması içeren büyük bir plastik kap (460 mm x 360 mm x 170 mm), üstünde havalandırma deliği bulunan plastik bardaklarda su, böcekleri gizlemek için katlanmış bir kağıt ve yumurta bırakmak için katmanlı pamuk kullanın (Şekil 2A). Tüm T. domestica kültürlerini 37 °C inkübatörlerin içinde tutun ve her kabın içindeki bağıl nemi (RH) %60-%80 olarak ayarlayın.
NOT: T. domestica atmosferden su buharını emdiği için11, doğrudan su kaynağına gerek yoktur. Uygun RH, üstte havalandırma deliği içeren plastik bardaklardan veya her kabın içindeki kapaksız bardaklardan su buharı bulunması nedeniyle korunur. Kültürleri içeren tüm bir inkübatörün içinde nemlendirmeye gerek yoktur. Bu protokolde açıklanan koşul altındaki her gelişim aşamasının yaklaşık süresi Şekil 1'de gösterilmiştir. Gelişim hızı sıcaklık ve/veya RH12değiştirilerek ayarlanabilir. - Periyodik olarak yiyecek ekleyin. Kurumadan önce su ekleyin.
- Yetişkinlerin kirli bir ortamda ve/veya yoğun popülasyonda yumurta bırakmayı bıraktığı göz önüne alındığında, popülasyonları en az 3 ayda bir yeni bir temiz kaba aktarın (bkz. Tartışma).
2. Yumurta toplama ve mikroenjeksiyon
- Kılavuz RNA (gRNA) tasarlama
- Gerekli her hedef için bir gRNA dizisi tasarlayın ve olası hedef dışı tanıma alanlarını kontrol etmek için gRNA dizilerini genom tertibatı ile patlatın.
- GRNA'ları üreticinin talimatlarına göre sentezlemek ve arındırmak8.
NOT: Örnek olarak, ATP bağlayıcı kaset taşıyıcı beyaz geninin hedeflenmesi durumunda, 20 bp hedef dizisi tasarlanmış ve iki sentezlenmiş DNA oligonükleotid 5'-TAATACGACTCACTATAGTAAGTGTTGTGGGAC-3' ve 5'-TTCTAGCTAAACATCGGTCCCACAACACTTA-3' sipariş edilmiştir. DNA şablonu, bu iki oligonükleotid ve ardından PCR amplifikasyonu tavlanarak hazırlandı ve gRNA daha sonra şablondan bir T7 RNA polimeraz ile in vitro olarak yazıldı.
- Yumurta toplama kolonileri hazırlayın
- Yaklaşık 20 erkek ve 20 kadın yetişkini yiyecek, su kaynağı, katlanmış kağıt ve yumurtlama için küçük bir katmanlı pamuk parçası ile orta büyüklükteki bir kaba (200 mm x 150 mm x 90 mm) aktarın(Şekil 2B).
- Genom düzenleme için kullanılacak kısa bir süre içinde çok sayıda aşamalı embriyo elde etmek için birkaç koloni kurun.
NOT: 37 °C'de 8 saat sonra bir koloniden yaklaşık 20-40 yumurta toplanması beklenir. Transfer edilen yetişkinlerin, muhtemelen yeni bir ortama adaptasyon nedeniyle yumurta bırakmaya başlamaları genellikle birkaç gün sürer.
- Enjeksiyon gününde, kapların içindeki pamuğu yenileriyle değiştirin.
- Normal 76 mm x 26 mm cam kaydırağa 76 mm x 5 mm çift taraflı bant yerleştirin.
- Sekiz saat sonra, katmanları kümesleri kullanarak ayırarak yumurtaları katmanlı pamuktan toplayın.
- Yumurtaları ıslak bir boya fırçası kullanarak çift taraflı bantta hizalayın ve yumurtalar arasında 2 mm mesafeyi koruyun. Tüm yumurtalar, bir yumurtanın boyuna ekseni enjeksiyon tarafına bakacak şekilde yönlendirilmelidir (Şekil 3A). Enjeksiyon sırasında sıkıca tutmak için yumurtaları bir boya fırçası ile hafifçe bastırın.
NOT: Bu protokolde mantar, ıslak ve sıcak durumda hasarlı enjekte edilmiş yumurtalarda hızlı büyür. Çapraz kontaminasyonu ve mantarın genişlemesini önlemek için yumurtalar arasındaki mesafeyi korumak önemlidir. - GRNA ve Cas9 proteinini sırasıyla 100 ng/μL ve 500 ng/μL'lik son konsantrasyonda karıştırın. Seyreltme için damıtılmış su kullanın. Ribonucleoprotein kompleks oluşumunu teşvik etmek için karışımı oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın ve ardından karışımı buzda tutun.
NOT: Enjekte edilen miktarı izlemek için enjeksiyon çözeltisine % 1 nihai konsantrasyonda nötr kırmızı eklenebilir. - GRNA/Cas9 çözeltisinin 2 μL'sini bir mikro doldurucu ile cam enjeksiyon kılcal damarı içine yükleyin. Enjeksiyondan önce çözeltide hava kabarcıkları olmadığından emin olun. Gerekirse, kabarcıkları çıkarmak için iğneye dokunun.
NOT: Bu deneyde, ince bir iğne ucu elde etmek için hazır bir iğne kullanılır (Şekil 3B). Bunun yerine benzer şekle sahip ev yapımı bir iğne kullanılabilir. - Daha önce gRNA/Cas9 çözeltisi ile yüklenen cam enjeksiyon kılcal damarını manipülatörle donatılmış bir tutucuya sabitleyin ve tutucuyu elektronik bir mikroinjektöre bağlayın.
- Bir dizi enjeksiyon boyunca tıkanmasını ve daha iyi dayanıklılık elde edilmesini önlemek için iğne ucunun şeklini biraz kırarak optimize edin (Şekil 3C'deuygun bir iğne örneği gösterilmiştir).
NOT: Bir iğne tıkandığında değiştirilmesi önerilir. Yine tokalarla kırılırsa aynı iğne ile enjekte etmeye devam etmek mümkündür, ancak daha geniş bir uç daha fazla yumurta hasarına yol açar ve hayatta kalma oranını düşürür. T. domestica yumurtaları yumuşak ve kırılgan olduğundan, ince bir iğne ucu tutmak enjeksiyondan sonra yüksek hayatta kalma oranına sahip olmak için anahtardır. - İğneyi bir yumurtanın boyuna ekseninin orta noktasına yerleştirin ve çözeltinin hafif bir miktarını enjekte edin (enjeksiyon miktarına referans için Şekil 3D-H'ye bakın). İğne ucunun şekline bağlı olarak enjeksiyon sırasında elektronik mikroenjektörün konfigürasyonunu ayarlayın.
NOT: Enjeksiyon sırasında sabit bir basınç uygulanması önerilir, aksi takdirde yapışkan yumurta içeriği cam iğneye kolayca akabilir ve tıkayabilir. Çözüm, enjekte edilen sıvı miktarına bağlı olarak kısa bir basınç darbesi veya sabit bir basınçla enjekte etmek olabilir. Bir iğne ucu geniş bir açıklığa sahip olduğunda, bir yumurtaya çok fazla çözelti enjekte edildiğini ve bunun ölümcülliğe neden olduğunu unutmayın (Şekil 3F-H). Bu durumda, sabit basınçla sabit bir sıvı akışı sağlayın, ardından iğneyi bir yumurtaya yerleştirin ve hemen çekin. Çok fazla taşma veya yumurta patlamasına neden olursa, iğneyi değiştirin. - Enjekte edilen yumurtaları% 60-80 RH ve 37 ° C ile enjekte edilen yumurta sayısına uygun boyutta bir kapta tutun (<20 yumurta: küçük tabak; >20 yumurta: orta boy kap).
3. Çiftleşme
- Enjekte edilen yumurtaları periyodik olarak kontrol edin ve mantar büyümesini önlemek için hasarlı yumurtaları tokmaklarla atın (Şekil 3I,J). Bir yumurtada çok fazla mantar yetişmesi durumunda, yumurtanın yüzeyini% 70 EtOH ile temizleyin.
- Kuluçkadan önce (yumurtlamadan sonra 37 °C'de yaklaşık 10 gün), çift taraflı bandın yüzeyini kaplamak için enjekte edilen yumurtalarla cam kaydırağı talk tozuna batırın. Bu, yumurtadan çıkmış nimflerin istiflenerek önlenmesini önleyecektir. Toz kaplı cam slaytları, böceklerin saklanması için yiyecek, su ve katlanmış bir kağıt içeren orta büyüklükte bir kaba aktarın.
- Nimfler yumurtadan çıktıktan sonra cam slaytları çıkarın. Yetişkinliğe ulaşana kadar periyodik olarak yiyecek tedarik edin.
NOT: Bireylerin yumurtadan çıktıktan sonra yetişkinliğe ulaşması yaklaşık 2,0-2,5 ay sürer (Şekil 1A). Yetişkin aşaması kadınlarda iyi gelişmiş bir ovipozitöre göre değerlendirilmektedir (Şekil 1B). - Bireyleri çiftleşmek için, bir laboratuvar kolonisinden orta büyüklükteki kaba gerektiği kadar wildtype kadın yetişkin aktarın ve bakir olduklarından emin olmak için 37 ° C'de en az 14 gün kuluçkaya yatırın.
NOT: Bir laboratuvar kolonisinden bakire dişileri toplamak gerekli değildir, çünkü yetişkin T. domestica"üreme ve kalıplama döngüsü" adı verilen tekrarlanan bir kalıplama ve çiftleşme döngüsüne sahiptir, bu sırada dişiler her eriyikle spermleri atar ve bir sonraki döllenme döngüsünde tekrar çiftleşir13. - Enjekte edilmiş bir yumurta ve wildtype yetişkin(ler) ile geliştirilen bir erkek veya dişi G0 yetişkinini yiyecek, katlanmış kağıt ve G1 yumurtalarını döşemek için küçük bir pamuk parçası(Şekil 2C'; çiftleşme kabı) ile küçük bir plastik tabağa aktarın. Çiftleşme yemeklerini% 60-% 80 RH (Şekil 2C)ile daha büyük bir kapta tutun.
NOT: Bire bir eşleştirme ile yüksek başarı oranları elde edilmiş olmasına rağmen, başarılı çiftleşme şansını artırmak için bir yemeğe birden fazla wildtype yetişkin dahil edilebilir.
4. Genotipleme
- GRNA tarafından hedeflenen siteyi içeren 100-200 bp'lik bir ürünü yükseltmek için her gRNA için PCR astar çiftleri tasarlayın. Özgüllüğünü kontrol etmek için genom tertibatının her astar dizisini PATLATIN (Şekil 4A'da beyaz genin hedeflenmesi için bir örnek gösterilmiştir).
- G0 yetişkinlerinin mikrop çizgisi dönüşümlerini kontrol edin.
- Yumurtalar bırakıldıktan beş gün sonra, her G0 yetişkin çiftinden ayrı G1 yumurtalarını 0,2 mL tüplere toplayın (tüp başına bir yumurta; toplanan örnekleri uzun süreli bir depolama için -20 ° C'de saklayın). Yumurtaları toplamak için pamuk katmanlarını ayırın.
NOT: Germline iletiminin başarısını değerlendirmek için her çiftleşme çiftinden en az 12 G1 nimf genotiplenmesi önerilir (bkz. Temsili Sonuçlar). - Her tüpe 15 μL 0,25 mg/mL Proteinaz K çözeltisi (Tris-EDTA tamponunda çözünmüş) ekleyin, örnekleri kürdanla kısaca homojenize edin ve 55 °C'de 3 ila 16 saat kuluçkaya yatırın.
- Numuneleri 10 dakika boyunca 95 °C'ye yerleştirerek Proteinaz K'yi devre dışı bırak.
- Her tüpe 90 μL damıtılmış su ekleyin ve iyice karıştırın. Adım 4.1'de tasarlanan astarları içeren 10 μL PCR reaksiyon karışımında 2 μL süpernatant kullanın.
NOT: Yeterli PCR amplifikasyonuna ulaşmak için ham şablonlar için optimize edilmiş bir DNA polimerazının kullanılması önerilir. - PCR ürünlerini analiz etmek için mikroçip elektroforez sistemi ile heteroduplex hareketlilik tahlili (HMA) gerçekleştirin (Şekil 3B; bkz. Ohde vd., 2018)8.
NOT: Mutasyonlar iki alternatif yöntemle değerlendirilebilir: (1) %8 poliakrilamid14gibi standart jel polimerli HMA; (2) T7 endonucleaz ile PCR ürünlerinin sindirimi ve ardından agarose jel elektroforez15. - Sadece mikroplarında mutasyon içeren G0 yetişkinlerinden kaynaklanan G1 nimflerini saklayın ve diğerlerini atın.
- Yumurtalar bırakıldıktan beş gün sonra, her G0 yetişkin çiftinden ayrı G1 yumurtalarını 0,2 mL tüplere toplayın (tüp başına bir yumurta; toplanan örnekleri uzun süreli bir depolama için -20 ° C'de saklayın). Yumurtaları toplamak için pamuk katmanlarını ayırın.
- G1 nimflerinin/yetişkinlerinin bireysel genotiplemi
- G1 nimflerini bir aspiratör veya boya fırçası ile 24 kuyulu plakalarda izole edin. %60–80 RH(Şekil 1D)tutmak için 24 kuyu plakalarını yukarıda açıklandığı gibi su kaynağı olan daha büyük bir kaba (örneğin, bu protokolde kullanılan orta büyüklükteki kap) yerleştirin. Yapay düzenli balık yemi tedarikini koruyun(Şekil 1D').
NOT: Bu adım nem ve yetişkin aşamalarının herhangi bir noktasında yapılabilmesine rağmen, yetişkinliğe ulaştıktan sonra ve eşleştirmeden hemen önce (enjeksiyondan 2,5 ay sonra) yapılması önerilir; Şekil 1B) çünkü ateş aşındırıcıları büyük bir kapta tutmak daha kolaydır. Aşağıdaki adımlarda her G1 nimfinin genotipini izlemek için bireysel yetiştirme gereklidir. Aynı G0 yetişkininden G1 nimfleri farklı mutasyonlara sahip olabilir. - Cerci ve kaudal filamenti forseps kullanarak bir nimf / yetişkinden kıstırın ve çekin ve 50 μL EtOH içeren 0,2 mL'lik bir tüpe toplayın (toplanan numuneleri uzun süreli bir depolama için -20 ° C'de saklayın).
NOT: Doku örnekleri EtOH'da toplanır, çünkü statik elektrik nedeniyle bu küçük numunelerin kaybını önler. Böceklerin hareketini durdurması gerekiyorsa, doku örnekleri alırken nemsiz / yetişkini buz üzerinde uyuşturun. T. domestica buz üzerinde uzun süreli soğudktan sonra hayatta kalamayacağından, onları bir dakikadan fazla uyuşturmayın ve hemen oda sıcaklığına geri taşıyın. Cerci ablasyon ve kaudal filament mortalite artışına neden olmaz. - EtOH'u buharlaşmak için kapakları açık olan numune tüplerini 70 °C'de 15 dakika boyunca bir termal blok üzerine yerleştirin.
- Genotipleme için 4.2.2–4.2.5 adımlarını yineleyin.
- Mutant bant deseninin gözlendiği PCR ürünlerini standart bir Sanger sıralama hizmetine gönderin.
- G1 nimflerini/yetişkinlerini istenen mutasyonlarla tutun ve diğerlerini atın (temsili bir sıralama sonucu için Şekil 4C'ye bakın).
- G1 nimflerini bir aspiratör veya boya fırçası ile 24 kuyulu plakalarda izole edin. %60–80 RH(Şekil 1D)tutmak için 24 kuyu plakalarını yukarıda açıklandığı gibi su kaynağı olan daha büyük bir kaba (örneğin, bu protokolde kullanılan orta büyüklükteki kap) yerleştirin. Yapay düzenli balık yemi tedarikini koruyun(Şekil 1D').
- Bir çiftleşme kabında istenen mutasyonları içeren yetişkinleri geçin ve homozigöz bir mutant suşu oluşturmak için sonraki nesilleri elde edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Elimizde, yeterli ipucuna sahip olduğunda yaklaşık 100 yumurta tek bir enjeksiyon kılcal damarı ile iyi enjekte edilebilir (Şekil 3C). Yumurtlamadan sonraki ilk 8 saat içinde embriyolarda gRNA/Cas9 ribononiklioprotein kompleksi enjeksiyonu gRNA hedefli bölgede indels ile sonuçlanır. Bu, enjekte edilen neslin (G0) bazı hücrelerinde biallelik mutasyonlara neden olur ve bu nedenle mutant mozaik fenotipleri genellikle G0'de elde edilir. Örneğin, bu protokol beyaz geni hedeflemek için tasarlanmış bir gRNA enjekte etmek için kullanıldığında, G0 nimflerinin% 32,6'sı bileşik gözlerinde ve dorsal bölgelerinde kısmi pigmentasyon kaybı gösterir (Şekil 5)8.
Şu anda açıklanan kuru enjeksiyon yöntemini kullanarak, 80-120 yumurta enjekte edildiğinde enjekte edilen embriyoların hayatta kalma oranı% 40-% 60 kadar yüksektir. Bu, yumurtaların bir agarose plakasına enjekte edildiği ve muhafaza edildiği önceki ıslak enjeksiyon yönteminin aksine, bazen% 10'dan daha az bir hayatta kalma oranına neden olabilir.
G0 yetişkinlerinin ve mutasyona uğramış G1 bireylerinin germline dönüşümünün değerlendirilmesi genomik PCR ve ardından HMA tarafından yapıldı. HMA'da, wildtype ve mutant alelleri her olası kombinasyonda tavlar, bu da tipik olarak bir jel elektroforezi (iki homodüks ve iki heterodüks) üzerinde dört farklı bantla sonuçlanır14. G1 örneklerinde, wildtype ve mutasyona uğramış numuneler arasındaki diferansiyel bant desenleri açıkça ayırt edilebilir (Şekil 4B). Beyaz geni hedeflediğimizde G0 yetişkinlerinin% 39.1'inde germline dönüşümü bulundu8. Deneyimlerimize göre, G1 perilerindeki mutasyona uğramış bireylerin tek bir G0 çiftinden yüzdesi% 25 ila% 100 arasında değişmektedir.
Çiftleşme ortamımızın çiftleşme başarısı üzerindeki etkisini değerlendirmek için bir çiftleşme kabında wildtype yetişkinleri geçtik ve %95,8 (23/24 çift) başarı oranı elde ettik.
Şekil 1: T. domestica'nın yaşam döngüsü. (A) T. domestica'dakiher gelişim aşamasının yaklaşık süresi . (B) Yetişkin bir dişinin dorsal görünümü. Ok ucu iyi gelişmiş bir ovipozitör gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Bu protokolde kullanılan yapay ortamlar. (A) Laboratuvar kolonisi için büyük bir kap, (B) yumurta toplama için orta boy bir kap, (C) büyük bir kapta su kaynakları ile çiftleşme yemekleri, (C ') bir çiftleşme kabı, (D) orta boy kapta su kaynağı olan 24 kuyulu bir tabak. Kutulu bölge, bir T. domestica bireyi göstermek için (D') içinde büyütüldü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: T. domestica yumurtalarının kuru enjeksiyonu. (A) Cam bir kaydırağa hizalanmış yumurtalar. Siyah ok, iğnenin yerleştirildiği noktayı gösterir. (B) Enjeksiyon için kullanılan cam iğne ucu şekli. (C) Ucu kırmadan önce (üstte) ve sonra (altta) aynı cam iğne. İğneler% 1 nötr kırmızı ile dolduruldu. Ok ucu iğnenin ucunu gösterir. Ölçek çubuğu 1 mm'dir. (D) Uninjected yumurta. (E) Bir enjeksiyonun iyi bir örneği. Ok enjeksiyon noktasını gösterir. (F–H) Çözelti enjekte edilen bölgeden (F) veya enjekte edilen yumurtanın karşı tarafından (G) taşar; çok fazla enjeksiyon hacmi patlamaya neden oldu (H). Ok ucu taşan yumurta içeriğini gösterir. (I) Normalde geç embriyo gelişti. Ok ucu renkli bileşik gözü gösterir. (J) Enjeksiyondan 3 gün sonra küçülmüş hasarlı yumurta. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: G1 bireylerinin genotiplem. (A) PCR astarları, gRNA hedef bölgesini içeren 120 bp genomik bölgeyi güçlendirmek için tasarlanmıştır. (B) Mutasyona uğramış örneklerde birden fazla homodükplex ve heterodüks DNA bandı tespit edilirken, tek bantlar mutasyona uğramamış örneklerde görülür. L: DNA merdiveni, U: mutasyona uğramamış örnekler, M: mutasyona uğramış örnekler. (C) PCR ürünlerinin wildtype ve heterozipöz mutant örneklerinden doğrudan sıralanarak temsili sonucu. Wildtype ve mutant ( 
) alele dizileri üstte gösterilir. (A) olarak gösterilen ileri astar, sıralama astarı olarak kullanılmıştır. Heterozygous mutant (altta) dizisi, tahmin edilen bölünme bölgesinden (ok) üst üste binen iki dizi ile gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: GRNA/Cas9 protein enjeksiyonu ile beyaz geni hedefledikten sonra bileşik gözlerde ve dorsal bölgede mozaik pigmentasyon kaybı. (A) Wildtype ve (B) beyaz gRNA / Cas9 protein enjekte ilk instar perileri. Gözlerde (ok ucu) ve sırt bölgesinde (ok) siyah ve pembe pigmentasyonların kısmi kaybı endikedir. Ölçek çubuğu 200 μm'dir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CRISPR/Cas9 ile istenen T. domestica mutantının başarılı bir şekilde üretilmesi için öncelikle enjeksiyon için yeterli sayıda aşamalı embriyo toplanması önemlidir. Yeterli sayıda T. domestica yumurtasının sürekli toplanması için anahtar, daha düşük bir nüfus yoğunluğuna sahip olmak için kabın uygun bir boyutunu seçmektir, çünkü her yetişkin eriyikten sonra tekrarlanan bir dizi karmaşık çiftleşme davranışının başarılı bir şekilde tamamlanmasına yardımcı olur13. Erkek bir T. domestica yetişkin spermini dolaylı olarak bir spermatophore yoluyla bir dişiye aktarır. Sweetman (1938), erkek yetişkinlerin çiftleşme davranışının başlatılmasından spermatophore 12 yerleştirilmesine kadar20ila 35 dakika sürdüğünü bildirdi. Bir çiftleşme çifti arasındaki etkileşimin diğer bireyler tarafından bozulmasının, yoğun bir ortamda daha sık gerçekleşebilecek başarılı döllenmeyi önlemesi muhtemeldir.
Her ne kadar yumurtalar, protokolümüzde yeterli yumurta toplamak için bir kabın içindeki pamuğu değiştirdikten 8 saat sonra toplansa da, enjekte edilen malzemelerin büyük oranda çekirdeklere teslim etme şansı daha fazla olduğunda, yumurtaların toplanması ve daha kısa sürede (örneğin, yumurtlamadan sonra 4 saat) enjekte edilmesiyle genom düzenlemenin daha yüksek verimine ulaşılabilir. Daha kısa sürede yeterli sayıda yumurtaya enjeksiyon, (1) alan izin veriyorsa kapların sayısını veya boyutunu artırarak veya (2) yeterli sayıda enjekte edilmiş yumurta elde etmek için aynı prosedürü tekrarlayarak yapılabilir.
Enjeksiyon bölgesi genellikle böceklerde başarılı germline dönüşümü için önemli olarak kabul edilir. T. domestica yumurtaları genellikle elipsoidal şeklindedir ve boyuna eksenlerinin bir kutbunda bir mikrop bandı içerir. T. domestica yumurtasının değişken şekli nedeniyle erken embriyolarda mikrop bandının oluştuğu kutbu tanımlamak zor olduğu için gRNA/Cas9 karışımının yumurta boyuna ekseninin orta noktasına enjekte edilmesi önerilir. GRNA/Cas9 çözeltisi doğrudan mikrop bandı oluşumunun bulunduğu bölgeye enjekte edilmemese de, G0 yetişkinlerinin % 39,1'i kadar yüksek mikrop dönüşümü sağladık8.
Yumurtaların mikroenjeksiyon sırasında, diğer hayvan modelleri için olduğu gibi, yüksek bir hayatta kalma oranı elde etmek için ince bir iğne ucu kullanmak önemlidir. Hazır iğnelerle enjeksiyondan sonra T. domestica yumurtalarında ev yapımı cam iğneler kullanmaktan daha yüksek bir sağkalım oranı elde ettik. Bununla birlikte, benzer şekilde yüksek bir sağkalım oranı, ince iğne şeklini ev yapımı iğnelerle çoğaltarak elde edilebilir (Şekil 3B,C'degösterildiği gibi). Deneyimlerimize göre, kuru enjeksiyon yöntemi daha önce bildirilen ıslak enjeksiyon yönteminden daha yüksek bir sağkalım oranı ile sonuçlanır8. T. domestica yumurtalarının ve erken nimflerin kurumaya karşı dirençli olmasından yararlanarak, kuru bir ortamda yumurta inkübasyonunun bu iyileşme için anahtar olduğunu gördük. Bu, bu türün özellikle erken gelişim aşamalarında kuru bir ortamı tercih ettiğini ve ıslak bir ortamın bile zararlı olabileceğini öne süren önceki raporlara uygundur16. Plastik bir plaka yerine, yumurtaların hızlı bir şekilde hizalanması için bir agarose jeli kullanılabilir; bununla birlikte, enjekte edilen yumurtaların kuru bir yüzeye aktarılması daha yüksek bir sağkalım oranına yol açar.
Sonuç olarak, yöntemimiz başarılı bir genom düzenlemesi için T. domestica'nın benzersiz biyolojisini dikkate almanın öneminin altını çizmektedir: yeterli sayıda yumurta toplamak için seyrek bir ortam ve enjekte edilen embriyoların daha yüksek hayatta kalma oranına sahip olmak için kuru bir ortam tutmak. Burada bildirilen enjeksiyon, çiftleşme ve kültür bakımı için temel protokoller sadece genom düzenleme ile mutant suşları üretmek için değil, aynı zamanda RNAi ve transgenez gibi diğer genetik araçların uygulamaları için de kullanılır ve böceklerin erken evriminin altında kalan mekanizmaların anlaşılmasına yardımcı olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
TO ve TD, sırasıyla JSPS KAKENHI hibe numaraları 19H02970 ve 20H02999 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plate | Corning | 83-3738 | |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3, 100 µg | Integrated DNA Technologies | 1081060 | |
| Anti-static cleaner | Hozan | Z-292 | for removing static electricity from a 24-well plate |
| Barrier Box 20.7L | AS ONE | 4-5606-01 | Large container |
| FemtoJet 4i | Eppendorf | 5252000013 | Electronic microinjector |
| Femtotip II, injection capillary | Eppendorf | 5242957000 | Glass injection capillary |
| High Pack 2440mL | AS ONE | 5-068-25 | Middle-sized container |
| Incubator | Panasonic | MIR-554-PJ | for 37 °C incubation. No need to humidify inside the incubator. |
| KOD Fx Neo | Toyobo | KFX-101 | PCR enzyme for genotyping. Optimized for an amplification from crude templates. |
| Magnetic stand | Narishige | GJ-8 | for holding the micromanipulator |
| Microloader | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micromanipulator | Narishige | MM-3 | |
| Microscope | Olympus | SZX12 | for microinjection. More than 35X magnification is sufficient for the microinjection |
| MultiNA | Shimadzu | MCE-202 | Microchip electrophoresis system |
| NiceTac | Nichiban | NW-5 | Double-sided tape to place eggs on a glass slide |
| Paint brush (horse hair) | Pentel | ZBS1-0 | |
| Plant culture dish | SPL Life Sciences | 310100 | Mating dish and water supplies for a large and middle-sized containers |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade Lyophilizate from Pichia pastoris | Roche | 3115836001 | |
| SZX 12 microscope | Olympus | SZX 12 | More than 35X magnification is sufficient for the microinjection |
| Talcum powder | Maruishi | 877113 | |
| Tetra Goldfish Gold Growth | Spectrum Brands | Artificial regular fish food |
References
- Species 2000, ITIS Catalogue of Life, 2019 Annual Checklist. Roskov, Y., et al. , Available from: http://www.catalogueoflife.org/annual-checklist/2019 (2019).
- Peterson, M. D., Rogers, B. T., Popadić, A., Kaufman, T. C. The embryonic expression pattern of labial, posterior homeotic complex genes and the teashirt homologue in an apterygote insect. Development Genes and Evolution. 209, 77-90 (1999).
- Farris, S. M. Developmental organization of the mushroom bodies of Thermobia domestica (Zygentoma, Lepismatidae): Insights into mushroom body evolution from a basal insect. Evolution and Development. 7, 150-159 (2005).
- Kamae, Y., Tanaka, F., Tomioka, K. Molecular cloning and functional analysis of the clock genes, Clock and cycle, in the firebrat Thermobia domestica. Journal of Insect Physiology. 56, 1291-1299 (2010).
- Ohde, T., Masumoto, M., Yaginuma, T., Niimi, T. Embryonic RNAi analysis in the firebrat, Thermobia domestica: Distal-less is required to form caudal filament. Journal of Insect Biotechnology and Sericology. 105, 99-105 (2009).
- Ohde, T., Yaginuma, T., Niimi, T. Nymphal RNAi analysis reveals novel function of scalloped in antenna, cercus and caudal filament formation in the firebrat, Thermobia domestica. Journal of Insect Biotechnology and Sericology. 108, 101-108 (2012).
- Bellés, X. Beyond Drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects. Annual Review of Entomology. 55, 111-128 (2010).
- Ohde, T., Takehana, Y., Shiotsuki, T., Niimi, T. CRISPR/Cas9-based heritable targeted mutagenesis in Thermobia domestica: A genetic tool in an apterygote development model of wing evolution. Arthropod Structure and Development. 47, 362-369 (2018).
- Nji, C., et al. CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns. Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).
- Brand, P., et al. The origin of the odorant receptor gene family in insects. eLife. 7, 1-13 (2018).
- Noble-Nesbitt, J. Water balance in the firebrat, Thermobia domestica (Packard). Exchanges of water with the atmosphere. Journal of Experimental Biology. 50, 745-769 (1969).
- Sweetman, H. L. Physical ecology of the firebrat, Thermobia domestica (Packard). Ecological Monographs. 8, 285-311 (1938).
- Nijhout, H. F. Insect Hormones. , Princeton University Press. Princeton, NJ. (1994).
- Chen, J., et al. Efficient detection, quantification and enrichment of subtle allelic alterations. DNA Research. 19, 423-433 (2012).
- Mashal, R. D., Koontz, J., Sklar, J. Detection of mutations by cleavage of DNA heteroduplexes with bacteriophage resolvases. Nature Genetics. 9, 177-183 (1995).
- Adams, J. A. Biological notes upon the firebrat, Thermobia domestica Packard. Journal of the New York Entomological Society. 41, 557-562 (1933).
