Einzelzellige optische Aktionspotentialmessung in human induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten
Summary
Hier beschreiben wir die optische Erfassung und Charakterisierung von Aktionspotentialen aus induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten mit einem modularen Hochgeschwindigkeits-Photometriesystem.
Abstract
Herkömmliche intrazelluläre Mikroelektrodentechniken zur Quantifizierung der Kardiomyozyten-Elektrophysiologie sind extrem komplex, arbeitsintensiv und werden typischerweise bei niedrigem Durchsatz durchgeführt. Die schnelle und kontinuierliche Expansion der Technologie der induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) stellt einen neuen Standard in der kardiovaskulären Forschung dar, und alternative Methoden sind jetzt notwendig, um den Durchsatz elektrophysiologischer Daten auf Einzelzellebene zu erhöhen. VF2.1Cl ist ein kürzlich abgeleiteter spannungsempfindlicher Farbstoff, der eine schnelle einkanalige, hohe Reaktion auf Schwankungen des Membranpotentials bietet. Es verfügt über eine Kinetik, die der anderer vorhandener Spannungsindikatoren überlegen ist, und stellt funktionale Daten zur Verfügung, die denen herkömmlicher Mikroelektrodentechniken entsprechen. Hier demonstrieren wir eine vereinfachte, nicht-invasive Charakterisierung des Aktionspotentials in extern beschleunigten menschlichen iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten mit einem modularen und äußerst erschwinglichen Photometriesystem.
Introduction
Die elektrophysiologische Modellierung von Kardiomyozyten und der Aufbau effizienter Plattformen für das kardiale Arzneimittelscreening sind essentiell für die Entwicklung therapeutischer Strategien für eine Vielzahl von Arrhythmusstörungen. Die rasche Expansion der Technologie der induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) hat vielversprechende Fortschritte in der Modellierung menschlicher Krankheiten und pharmakologischen Untersuchungen mit isolierten patientenbasierten Kardiomyozyten (iPSC-CM) ermöglicht. “Goldstandard” -Techniken zur elektrophysiologischen Charakterisierung dieser Zellen durch Patch-Clamp (Strom-Clamp) können die Morphologie und Dauer des Aktionspotentials (AP) quantifizieren, diese Methode ist jedoch unglaublich komplex und langsam und nicht gut für die Datenerfassung mit hohem Durchsatz geeignet1. Es wird regelmäßig berichtet, dass iPSC-CMs im Vergleich zu adulten nativen Kardiomyozyten ein erhöhtes diastolisches Membranpotenzial und einen erhöhten Ableitstrom aufweisen2. Es wird vermutet, dass eine kleinere Zellgröße und eine reduzierte Membrankapazität, die in iPSC-CMs beobachtet werden, bei der Verwendung der Strom-Klemm-Technik zu systematischen Fehlern führen können, was vielleicht diese Abweichungen erklärt3. Um die Nützlichkeit einer iPSC-CM-Plattform zu maximieren, ist eine zusätzliche Methode wertvoll, um den Durchsatz zu erhöhen und die Datengenauigkeit bei der Charakterisierung von Transmembranspannungsänderungen auf Einzelzellenebene in iPSC-CMs sicherzustellen.
Spannungsempfindliche Farbstoffe (VSD) sind seit langem eine vorgeschlagene Methode, um eine schnellere, nicht-invasive und gleichwertige Analyse der kardialen AP-Kinetik im Vergleich zu denen herkömmlicher Techniken zu ermöglichen4. Eine aktuelle Studie hat die Eignung der ratiometrischen spannungsempfindlichen Sondenphotometrie zur genauen Quantifizierung des kardialen AP5nachgewiesen. Darüber hinaus verleiht die Fähigkeit, optische Photometrieansätze leicht zu skalieren, diese Technik für groß angelegte Kardiotoxizitätsbildschirme, die für die Entwicklung therapeutischer Medikamente (z. B. CiPA) von entscheidender Bedeutung sind. Die Entwicklung standardisierter Kardiotoxizitätsprotokolle in einer verblindeten Multi-Site-Studie unter Verwendung von Mikroelektrodenarrays und optischen Spannungssensoren hat den Schlüsselwert dieses Ansatzes gezeigt6.
Viele potentiometrische Farbstoffe sind kommerziell erhältlich, und die laufende synthetische Entwicklung neuer Sonden zeigt ein aufregendes Potenzial, ihre Wirksamkeit über eine Vielzahl von kardialen und neuronalen Konstrukten hinweg zu rationalisieren. Der ideale VSD hat eine erhöhte Kinetik und Empfindlichkeit und zeigt gleichzeitig eine verminderte kapazitive Belastung, Photobleaching und Zytotoxizität. Das kürzlich synthetisierte VF2.1Cl (FluoVolt) drückt viele dieser vorteilhaften Eigenschaften aus, hauptsächlich aufgrund seiner neuartigen drahtbasierten Molekülstruktur, die von anderen Mitgliedern der neuen VoltageFluor (VF) -Familie geteilt wird7. Im Gegensatz zu herkömmlichen elektrochromen VSDs, bei denen einfache Sonden molekular und elektrisch mit der Plasmamembran konjugieren, besteht dieser Farbstoff aus einem passiv eingefügten, membranübergreifenden synthetischen Draht, der einen elektronenreichen Donor mit einem modifizierten Fluoreszeinfluorophor (FITC) paart. Mechanistische Details sind in Abbildung 1 dargestellt. Dieser Farbstoff zeigt eine ausgezeichnete Empfindlichkeit gegenüber Membranspannungsschwankungen und zeigt eine Änderung der Emissionsintensität um 27% pro 100 mV im Gegensatz zu ~ 10% bei anderen gängigen Sonden bei vergleichbaren Geschwindigkeiten7. Darüber hinaus interagieren drahtbasierte PeT-Systeme nicht direkt mit dem zellulären elektrischen Feld, was zu minimalen elektrischen Störungen und vernachlässigbaren Änderungen der zellulären kapazitiven Last führt.
Abbildung 1: Chemische, spektrale und mechanistische Parameter des VF2.1Cl-Farbstoffs. (A) Chemische Struktur von VF2.1Cl. Zu den zu beachtenen molekularen Merkmalen gehören mehrere Alkylgruppen innerhalb des molekularen Phenylenvinylendrahtes, die das Einsetzen in die Plasmamembran erleichtern. Eine negativ geladene Sulfonsäuregruppe, die mit der FITC-Sonde konjugiert ist, sorgt für eine Fluorophorstabilisierung auf der extrazellulären Oberfläche und unterstützt die nahezu senkrechte Insertion relativ zum elektrischen Feld der Lipiddoppelschicht. (B) Vereinfachtes Schema der senkrechten VF2.1Cl-Einbettung in die Plasmamembran einer Zielzelle. (C) Absorptions- und Emissionsspektren des VF2.1Cl-Farbstoffs. Spectra ist identisch mit denen von Standard-FITC- und GFP-Sonden. (D) Darstellung der mechanistischen Wirkungsweise von VF2.1Cl. Unter Ruhebedingungen (hyperpolarisiert) treiben negative intrazelluläre Spannungen freie Elektronen in Richtung des rostralen Fluorophors. Die Elektronenhäufigkeit stellt sicher, dass der photoinduzierte Elektronentransfer (PeT) als Weg aus dem angeregten Zustand nach der optischen Anregung bevorzugt wird, wodurch die Fluoreszenz effektiv abgeschreckt wird. Im Gegensatz dazu beeinflusst ein depolarisiertes Membranpotential die Elektronenbewegung nach unten und begünstigt die Fluoreszenz bei optischer Anregung. Die resultierende Fluoreszenzantwort ist linear mit der Membranspannung verbunden und kann präzise genutzt werden, um detaillierte zeitliche Informationen über die zelluläre elektrophysiologische Kinetik zu sammeln. (E) Repräsentative Hellfeld- (obere) und Fluoreszenzaufnahmen bei 470 nm (unten) von Leporin-Kardiomyozyten, die mit VF2.1Cl. (F) Z-Stapel eines einzelnen geladenen Kardiomyozyten beladen sind. Pfeile zeigen Bereiche mit klarer Lokalisation von VF2.1Cl auf der Zellmembran an. Die Bilder wurden mit einem konfokalen System mit rotierender Scheibe aufgenommen, das aus einem konfokalen X-lightv3-Spinnscheibenkopf mit einem 50 μm-Lochmuster besteht. LDI-7 Beleuchtung; Prime95B Kamera und ein PlanApo Lambda 100x Objektiv. Maßstabsleiste: 20 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Die mit VF2.1Cl konjugierte FITC-Sonde stellt sicher, dass sie effektiv unter Standard- und GFP-Filterkonfigurationen eingesetzt werden kann und nur ein Einkanalerfassungssystem benötigt, die beide gemeinsame Merkmale von fluoreszierenden Bildgebungsplattformen sind. Die Analyse dichter menschlicher iPSC-CM-Monoschichten mit diesem Farbstoff wurde kürzlich berichtet8,9,10,11. Unser Protokoll unterscheidet sich von diesen Studien aufgrund unserer Untersuchung einzelner, isolierter iPSC-CMs, die von den elektrischen und parakrinen Einflüssen dichter synzytriler Monoschichten unbeirrt sind, und unserer Verwendung eines erschwinglichen und anpassbaren Photometriesystems im Gegensatz zu komplexen konfokalen oder Weitfeld-Bildgebungsanordnungen.
Hier beschreiben wir unser Protokoll zur schnellen Erfassung und Analyse robuster optischer APs aus isolierten humanen iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten und nativen Kardiomyozyten (siehe Ergänzungsdatei). Wir verwenden VF2.1Cl in Verbindung mit einer anpassbaren State-of-the-Art-Plattform für Einzelzell-Photometrie-Messungen. Diese Versuchsprotokolle wurden von der Ethikkommission der Universitätsmedizin Göttingen genehmigt (Nr. 09.10.15).
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschreiben wir ein grundlegendes Protokoll, um auf einfache Weise detaillierte AP-Profile von isolierten iPSC-CMs zu erfassen, die für die elektrophysiologische Modellierung und das kardiale Drogenscreening geeignet sind. Wir erkennen regelmäßige, robuste APs aus unseren spärlich gesäten iPSC-CMs, was sowohl auf Indikatorfunktionalität als auch auf methodische Genauigkeit hindeutet.
Aufgrund des breiten Spektrums kommerzieller Methoden für die iPSC-Reprogrammierung und der fehlend…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Cairn Research Ltd. für ihren freundlichen finanziellen Beitrag, der die Produktionskosten dieser Veröffentlichung gedeckt hat. Darüber hinaus danken wir Frau Ines Mueller und Frau Stefanie Kestel für die hervorragende technische Unterstützung.
Die Forschung der Autoren wird vom Deutschen Zentrum für Herz-Kreislauf-Forschung (DZHK), der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG, Vo 1568/3-1, IRTG1816 RP12, SFB1002 TPA13 und im Rahmen der Exzellenzstrategie – EXC 2067/1- 390729940) und der Else-Kröner-Fresenius Stiftung (EKFS 2016_A20) unterstützt.
Materials
| Reagents | |||
| 0.25 Trypsin EDTA | Gibco | 25200056 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
| CaCl2 | Carl Roth | HN04.2 | |
| D(+)-Glucose anhydrous BioChemica | ITW Reagents | A1422 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| FluoVolt Membrane Potential Kit | Invitrogen | F10488 | |
| HEPES | Carl Roth | HN77.4 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 6781.1 | |
| Lamanin | Sigma-Aldrich | 114956-81-9 | |
| Matrigel | BD | 354230 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 9265.2 | |
| Nifedipine | Sigma-Aldrich | 21829-25-4 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| ROCK Inhibitor Y27632 | Stemolecule | 04-0012-10 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 61870010 | |
| Versene EDTA | Gibco | 15040033 | |
| Equipment | |||
| 495LP Dichroic Beamsplitter | Chroma Technology | ||
| Axopatch 200B Amplifier | Molecular Devices | ||
| Circle Coverslips, Thickness 0 | Thermo Scientific | CB00100RA020MNT0 | |
| Digidata 1550B | Molecular Devices | ||
| Dual OptoLED Power Supply | Cairn Research | ||
| ET470/40x Excitation Filter | Chroma Technology | ||
| ET535/50m | Chroma Technology | ||
| Etched Neubauer Hemacytometer | Hausser Scientific | ||
| Filter Cubes | Cairn Research | ||
| IX73 Inverted Microscope | Olympus | ||
| MonoLED | Cairn Research | ||
| Multiport Adaptors | Cairn Research | ||
| Myopacer Cell Stimulator | IonOptix | ||
| Optomask Shutter | Cairn Research | ||
| Optoscan System Controller | Cairn Research | ||
| PH-1 Temperature Controlled Platform | Warner Instruments | ||
| Photomultiplier Detector | Cairn Research | ||
| PMT Amplifier Insert | Cairn Research | ||
| PMT Supply Insert | Cairn Research | ||
| RC-26G Open Bath Chamber | Warner Instruments | ||
| SA-OLY/2AL Stage Adaptor | Olympus | ||
| T565lpxr Dichroic Beamsplitter | Chroma Technology | ||
| T660lpxr Dichroic Beamsplitter | Chroma Technology | ||
| TC-20 Dual Channel Temperature Controller | npi Electronic | ||
| UPLFLN 40X Objective | Olympus | ||
| USB 3.0 Colour Camera | Imaging Source | ||
| Software | |||
| Clampex 11.1 | Molecular Devices | ||
| Clampfit 11.1 | Molecular Devices | ||
| IC Capture 2.4 | Imaging Source | ||
| Prism 8 | Graphpad |
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