यहां हम एक उच्च गति मॉड्यूलर फोटोमेट्री सिस्टम का उपयोग करके प्रेरित pluripotent स्टेम सेल व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स से कार्रवाई क्षमता के ऑप्टिकल अधिग्रहण और लक्षण वर्णन करते हैं।
कार्डियोमायोसाइट इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी की मात्रा निर्धारित करने के लिए पारंपरिक इंट्रासेलुलर माइक्रोइलेक्ट्रोड तकनीक बेहद जटिल, श्रम गहन हैं, और आम तौर पर कम थ्रूपुट में किए जाते हैं। प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (आईपीएससी) प्रौद्योगिकी के तेजी से और चल रहे विस्तार हृदय अनुसंधान में एक नया मानक प्रस्तुत करता है और वैकल्पिक तरीकों अब एक ही सेल के स्तर पर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल डेटा के थ्रूपुट को बढ़ाने के लिए आवश्यक हैं । VF2.1Cl हाल ही में व्युत्पन्न वोल्टेज संवेदनशील डाई है जो एक तेजी से एकल चैनल, झिल्ली क्षमता में उतार-चढ़ाव के लिए उच्च परिमाण प्रतिक्रिया प्रदान करता है। इसमें अन्य मौजूदा वोल्टेज संकेतकों से बेहतर गतिज होती है और पारंपरिक माइक्रोइलेक्ट्रोड तकनीकों के बराबर कार्यात्मक डेटा उपलब्ध होता है। यहां, हम मॉड्यूलर और अत्यधिक किफायती फोटोमेट्री सिस्टम का उपयोग करके बाहरी रूप से पुस्तक वाले मानव आईपीएससी व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स में सरलीकृत, गैर-आक्रामक कार्रवाई संभावित लक्षण वर्णन प्रदर्शित करते हैं।
कार्डियोमायोसाइट्स के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल मॉडलिंग और कार्डियक ड्रग स्क्रीनिंग के लिए कुशल प्लेटफार्मों का निर्माण विभिन्न प्रकार के अतालता विकारों के लिए चिकित्सीय रणनीतियों के विकास के लिए आवश्यक है। प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (आईपीएससी) प्रौद्योगिकी के तेजी से विस्तार अलग रोगी व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स (आईपीएससी-सीएम) का उपयोग कर मानव रोग मॉडलिंग और औषधीय जांच में आशाजनक पैठ का उत्पादन किया है । पैच-क्लैंप (वर्तमान-क्लैंप) के माध्यम से इन कोशिकाओं के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल लक्षण वर्णन के लिए “गोल्ड स्टैंडर्ड” तकनीक कार्रवाई क्षमता (एपी) आकृति विज्ञान और अवधि की मात्रा निर्धारित कर सकती है, हालांकि, यह विधि अविश्वसनीय रूप से जटिल और धीमी है, और उच्च थ्रूपुट डेटा अधिग्रहण 1 के लिए अच्छीतरहसे अनुकूल नहीं है। आईपीएससी-सीएम को नियमित रूप से वयस्क देशी कार्डियोमायोसाइट्स2की तुलना में डायस्टोलिक झिल्ली की क्षमता और रिसाव में वृद्धि की संभावना बताई जाती है। यह सुझाव दिया जाता है कि आईपीएससी-सीएम में देखी गई छोटी कोशिका आकार और कम झिल्ली क्षमता वर्तमान क्लैंप तकनीक का उपयोग करते समय कुछ व्यवस्थित त्रुटि पैदा कर सकती है, शायद इन विचलन3को समझा सकती है। एक आईपीएससी-सीएम प्लेटफॉर्म की उपयोगिता को अधिकतम करने के लिए, आईपीएससी-सीएम में एक सेल स्तर पर ट्रांसमेम्ब्रान वोल्टेज परिवर्तन की विशेषता होने पर थ्रूपुट बढ़ाने और डेटा सटीकता सुनिश्चित करने के लिए एक अतिरिक्त विधि मूल्यवान है।
वोल्टेज संवेदनशील रंगों (वीएसडी) लंबे समय से पारंपरिक तकनीकों के मुकाबले हृदय एपी काइनेटिक्स के तेज, गैर-आक्रामक और समकक्ष विश्लेषण प्रदान करने के लिए एक प्रस्तावित विधि रही है4। हाल ही में हुए एक अध्ययन में कार्डियक एपी5को सही ढंग से निर्धारित करने के लिए रेशेट्रिक वोल्टेज सेंसिटिव प्रोब फोटोमेट्री की उपयुक्तता का प्रदर्शन किया गया है । इसके अलावा, ऑप्टिकल फोटोमेट्री दृष्टिकोण को आसानी से स्केल करने की क्षमता इस तकनीक को चिकित्सीय दवा विकास (जैसे, सिपा) में महत्वपूर्ण बड़े पैमाने पर कार्डियोटॉक्सीसिटी स्क्रीन पर उधार देती है। माइक्रोइलेक्ट्रोड सरणी और वोल्टेज-सेंसिंग ऑप्टिकल तकनीकों का उपयोग करके एक अंधे बहु-साइट अध्ययन में मानकीकृत कार्डियोटॉक्सिसिटी प्रोटोकॉल के विकास ने इस दृष्टिकोण6के प्रमुख मूल्य का प्रदर्शन किया है।
कई शक्तिशाली उपकरणों व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, और नए जांच के चल रहे सिंथेटिक विकास हृदय और तंत्रिका निर्माण की एक किस्म भर में अपनी प्रभावशीलता को व्यवस्थित करने के लिए रोमांचक क्षमता दिखाते हैं । आदर्श वीएसडी में कम कैपेसिटिव लोड, फोटोब्लेचिंग और साइटोटॉक्सिकिटी प्रदर्शित करते हुए काइनेटिक्स और संवेदनशीलता में वृद्धि होगी। हाल ही में संश्लेषित VF2.1Cl (FluoVolt) इन लाभकारी गुणों में से कई काफी हद तक अपने उपन्यास तार आधारित आणविक संरचना के कारण व्यक्त करता है, जो नए वोल्टेजफ्लूर (वीएफ) परिवार7के अन्य सदस्यों द्वारा साझा किया गया है । आम इलेक्ट्रोक्रोमिक वीएसडी के विपरीत जिसमें प्लाज्मा झिल्ली के लिए आणविक और विद्युत रूप से संविलियन सरल जांच की जाती है, इस डाई में निष्क्रिय रूप से डाला गया, झिल्ली-फैले सिंथेटिक तार होते हैं जो एक इलेक्ट्रॉन-समृद्ध दाता को संशोधित फ्लोरोसिन फ्लोरोफोर (फिटसी) के साथ जोड़ते हैं। मशीनी विवरण चित्र 1में प्रदान किए गए हैं । यह डाई झिल्ली वोल्टेज में उतार-चढ़ाव के प्रति उत्कृष्ट संवेदनशीलता को दर्शाता है, जो तुलनात्मक गति 7 पर अन्य सामान्य जांच में देखे गए ~ 10% के विपरीत प्रति 100 एमवी उत्सर्जन तीव्रता में27%परिवर्तन प्रदर्शित करता है। इसके अलावा, वायर-आधारित पीईटी सिस्टम सीधे सेलुलर इलेक्ट्रिक फील्ड के साथ बातचीत नहीं करते हैं जो सेलुलर कैपेसिटिव लोड में न्यूनतम विद्युत हस्तक्षेप और नगण्य परिवर्तन पैदा करता है।
चित्रा 1: VF2.1Cl डाई के रासायनिक, स्पेक्ट्रल और मशीनी पैरामीटर। (A)VF2.1Cl. आणविक सुविधाओं की रासायनिक संरचना नोट करने के लिए फेनिलीन विनाइलीन आणविक तार के भीतर कई एल्किल समूहों को शामिल किया गया है जो प्लाज्मा झिल्ली में सम्मिलन की सुविधा प्रदान करते हैं । एक नकारात्मक आवेशित सल्फोनिक एसिड समूह फिटसी जांच के लिए संयुग्मित लिपिड बाइलेयर के विद्युत क्षेत्र के सापेक्ष लंबवत प्रविष्टि के पास बाहृशल सतह और एड्स पर फ्लोरोफोर स्थिरीकरण सुनिश्चित करता है। (ख)एक लक्ष्य कोशिका के प्लाज्मा झिल्ली में एम्बेडिंग लंबवत VF2.1Cl की एक सरलीकृत योजनाबद्ध । (ग)वीएफ 2.1सीएल डाई का अवशोषण और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा। स्पेक्ट्रा मानक फिटसी और जीएफपी जांच के समान है। (घ)VF2.1Cl की कार्यनीतता के यंत्रवादी तरीके का चित्रण। आराम की स्थिति (हाइपरपोलराइज्ड) में, नकारात्मक इंट्रासेलुलर वोल्टेज रोस्ट्रल फ्लोरोफोर की ओर मुफ्त इलेक्ट्रॉनों को ड्राइव करते हैं। इलेक्ट्रॉन बहुतायत सुनिश्चित करता है फोटो प्रेरित इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण (पीईटी) ऑप्टिकल उत्तेजन के बाद उत्तेजित राज्य से बाहर एक मार्ग के रूप में इष्ट है, प्रभावी ढंग से फ्लोरेसेंस शमन । इसके विपरीत, एक डीपोलराइज्ड झिल्ली क्षमता ऑप्टिकल एक्सिलिएशन पर फ्लोरेसेंस के पक्ष में नीचे इलेक्ट्रॉन आंदोलन को प्रभावित करती है। परिणामस्वरूप फ्लोरोसेंट प्रतिक्रिया झिल्ली वोल्टेज से संबंधित है और सेलुलर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल काइनेटिक्स पर विस्तृत लौकिक जानकारी इकट्ठा करने के लिए ठीक से उपयोग किया जा सकता है। (ई)प्रतिनिधि ब्राइटफील्ड (ऊपरी) और फ्लोरेसेंस पर 470 एनएम (लोअर) वीएफ 2.1सीएल से भरे लेपोरीन कार्डियोमायोसाइट्स की छवियां।(एफ)जेड स्टैक एक लोडेड कार्डियोमायोसाइट के। तीर सेलुलर झिल्ली के लिए VF2.1Cl के स्पष्ट स्थानीयकरण के क्षेत्रों का संकेत देते हैं। छवियों को एक कताई डिस्क कॉन्फोकल सिस्टम के साथ अधिग्रहीत किया गया था जिसमें एक्स-लाइटवी 3 कताई डिस्क कॉन्फोकल हेड शामिल था, जिसमें 50 माइक्रोन पिनहोल पैटर्न था; एलडीआई-7 प्रकाशक; प्राइम95बी कैमरा और एक प्लानपो लैम्ब्डा 100x उद्देश्य। स्केल बार: 20 माइक्रोन करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
वीएफ 2.1सीएल को संजीद जाने वाली फिटसी जांच यह सुनिश्चित करती है कि इसका उपयोग मानक और जीएफपी फ़िल्टर कॉन्फ़िगरेशन के तहत प्रभावी ढंग से किया जा सकता है, और इसके लिए केवल एक चैनल अधिग्रहण प्रणाली की आवश्यकता होती है, जिनमें से दोनों फ्लोरोसेंट इमेजिंग प्लेटफार्मों की आम विशेषताएं हैं। इस डाई के साथ घने मानव आईपीएससी-सीएम मोनोलेयर का विश्लेषण हाल ही में8,9, 10,11बतायागया है । हमारा प्रोटोकॉल एकल, अलग आईपीएससी-सीएम की हमारी जांच के कारण इन अध्ययनों से अलग है, जो घने सिंकायल मोनोलेयर के विद्युत और पैराक्राइन प्रभावों से बेफिक्र है, और जटिल कॉन्फोकल या वाइड-फील्ड इमेजिंग व्यवस्थाओं के विपरीत एक किफायती और अनुकूलन फोटोमेट्री सिस्टम का हमारा उपयोग है।
यहां, हम अलग मानव आईपीएससी-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स और देशी कार्डियोमायोसाइट्स (पूरक फ़ाइलदेखें) से मजबूत ऑप्टिकल एपीएस के तेजी से अधिग्रहण और विश्लेषण के लिए हमारे प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। हम एकल सेल फोटोमेट्री मापन के लिए कला मंच के अनुकूलन राज्य के साथ मिलकर VF2.1Cl का उपयोग करें। इन प्रायोगिक प्रोटोकॉल विश्वविद्यालय चिकित्सा केंद्र गोटिंगेन (नंबर 10/9/15) की आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है ।
यहां हम इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल मॉडलिंग और कार्डियक ड्रग स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त अलग-थलग आईपीएससी-सीएम से विस्तृत एपी प्रोफाइल प्राप्त करने के लिए एक बुनियादी प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। हम अपने ?…
The authors have nothing to disclose.
लेखकों को अपनी तरह के वित्तीय योगदान है जो इस प्रकाशन के उत्पादन लागत को कवर के लिए केयर्न रिसर्च लिमिटेड स्वीकार करना चाहते हैं । इसके अलावा, हम सुश्री आईएनएस म्यूलर और सुश्री स्टेफनी केस्टेल को उनके उत्कृष्ट तकनीकी समर्थन के लिए धन्यवाद देते हैं ।
लेखकों के अनुसंधान को जर्मन सेंटर फॉर कार्डियोवैस्कुलर रिसर्च (डीजेएचके), ड्यूश फॉरचुंग्सजेमेन्सचैफ्ट (डीएफजी, जर्मन रिसर्च फाउंडेशन, वीओ 1568/3-1, IRTG1816 RP12, SFB1002 TPA13 और जर्मनी की उत्कृष्टता रणनीति के तहत-EXC 2067/1-390729940) और Else-Kröner-Fresenius Stiftung (EKFS 2016_A20) ।
Reagents | |||
0.25 Trypsin EDTA | Gibco | 25200056 | |
B27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
CaCl2 | Carl Roth | HN04.2 | |
D(+)-Glucose anhydrous BioChemica | ITW Reagents | A1422 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
FluoVolt Membrane Potential Kit | Invitrogen | F10488 | |
HEPES | Carl Roth | HN77.4 | |
KCl | Sigma-Aldrich | 6781.1 | |
Lamanin | Sigma-Aldrich | 114956-81-9 | |
Matrigel | BD | 354230 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | 9265.2 | |
Nifedipine | Sigma-Aldrich | 21829-25-4 | |
Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
ROCK Inhibitor Y27632 | Stemolecule | 04-0012-10 | |
RPMI 1640 Medium | Gibco | 61870010 | |
Versene EDTA | Gibco | 15040033 | |
Equipment | |||
495LP Dichroic Beamsplitter | Chroma Technology | ||
Axopatch 200B Amplifier | Molecular Devices | ||
Circle Coverslips, Thickness 0 | Thermo Scientific | CB00100RA020MNT0 | |
Digidata 1550B | Molecular Devices | ||
Dual OptoLED Power Supply | Cairn Research | ||
ET470/40x Excitation Filter | Chroma Technology | ||
ET535/50m | Chroma Technology | ||
Etched Neubauer Hemacytometer | Hausser Scientific | ||
Filter Cubes | Cairn Research | ||
IX73 Inverted Microscope | Olympus | ||
MonoLED | Cairn Research | ||
Multiport Adaptors | Cairn Research | ||
Myopacer Cell Stimulator | IonOptix | ||
Optomask Shutter | Cairn Research | ||
Optoscan System Controller | Cairn Research | ||
PH-1 Temperature Controlled Platform | Warner Instruments | ||
Photomultiplier Detector | Cairn Research | ||
PMT Amplifier Insert | Cairn Research | ||
PMT Supply Insert | Cairn Research | ||
RC-26G Open Bath Chamber | Warner Instruments | ||
SA-OLY/2AL Stage Adaptor | Olympus | ||
T565lpxr Dichroic Beamsplitter | Chroma Technology | ||
T660lpxr Dichroic Beamsplitter | Chroma Technology | ||
TC-20 Dual Channel Temperature Controller | npi Electronic | ||
UPLFLN 40X Objective | Olympus | ||
USB 3.0 Colour Camera | Imaging Source | ||
Software | |||
Clampex 11.1 | Molecular Devices | ||
Clampfit 11.1 | Molecular Devices | ||
IC Capture 2.4 | Imaging Source | ||
Prism 8 | Graphpad |