Summary
Este protocolo aísla ARN total de alta calidad de muestras fecales de sujetos animales y humanos. Se utiliza un kit de aislamiento de miARN comercial con una adaptación significativa para aislar ARN puro con cantidad y calidad optimizadas. Los aislados de ARN son buenos para la mayoría de los ensayos de ARN aguas abajo, como la secuenciación, la micromatriz y la RT-PCR.
Abstract
Cada vez está más claro que el ARN existe en la luz intestinal y las heces en animales y humanos. El protocolo descrito a continuación aísla el ARN total, incluidos los microARN, de muestras fecales de sujetos animales y humanos. El objetivo es aislar el ARN total con alta pureza y cantidad para análisis posteriores como secuenciación de ARN, RT-PCR y microarray. Las ventajas de este protocolo optimizado en el aislamiento de miARN son la capacidad de aislar productos de ARN altamente purificados con pasos de lavado adicionales descritos, una mayor cantidad de ARN obtenida con un método mejorado en la resuspensión de la muestra y consejos importantes de descontaminación. Una limitación es la incapacidad de procesar y purificar muestras más grandes de más de 200 mg, ya que estos tamaños de muestra causarían una dificultad en la formación clara de la interfase. En consecuencia, el gran tamaño de la muestra puede contaminar la fase acuosa a extraer como se describe en el protocolo con materias orgánicas que afectan la calidad del ARN aislado al final. Sin embargo, los aislados de ARN de una muestra de hasta 200 mg son suficientes para la mayoría de los análisis posteriores.
Introduction
El ARN extracelular está siendo reconocido como un factor significativo que media muchos procesos biológicos1. El ARN extracelular en las heces fue reportado por primera vez en 2008 como un marcador de cáncer de colon y colitis ulcerosa activa2, y recientemente se reveló como un componente normal de la luz intestinal y las heces y media las comunicaciones huésped-microbio 3,4,5. El propósito de este protocolo de aislamiento de ARN es extraer ARN extracelular de alta calidad de muestras fecales recolectadas de sujetos animales y humanos. El protocolo fue adaptado de un kit de aislamiento de miARN comercial. El ARN adquirido se utiliza para análisis posteriores como secuenciación de ARN, RT-PCR y microarrays. El protocolo incluye varios consejos importantes y útiles para maximizar la cantidad y calidad del ARN que se encuentra en las heces de animales y humanos. La razón para desarrollar y optimizar este método de aislamiento de ARN (incluido el microARN) es disminuir el ARN microbiano en las heces, limitar las variables en los estudios de investigación y analizar la composición del ARN en el intestino sin tener en cuenta varios factores de confusión y fuentes de contaminación. Cabe destacar que este aislamiento de ARN minimiza la liberación de ARN de células vivas y microbios vivos (ARN celular). Se centra en los ARN extracelulares que han sido liberados por las células intestinales o han sido adquiridos a través de la ingesta de alimentos. Principalmente, este método no es adecuado para estudios donde se investiga el transcriptoma microbiano.
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Protocol
Todos los métodos que involucran animales de investigación descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Hospital Brigham and Women's, Escuela de Medicina de Harvard.
Todos los métodos que involucran sujetos de investigación humanos descritos aquí están de acuerdo con las pautas establecidas por el Comité de Investigación Humana de Partners.
1. Recogida de muestras fecales
- Autoclave o preparar un tubo de microcentrífuga estéril y libre de nucleasas de 2 ml con tapón de rosca para cada sujeto animal en un experimento.
- Para sujetos humanos, proporcione un dispositivo apropiado, libre de nucleasas y estéril para la recolección de muestras de heces para cada sujeto.
- Recolectar 25-100 mg (aproximadamente 1-4 pellets fecales para muestras fecales de ratón) de muestras fecales de cada sujeto animal en un ambiente estéril.
NOTA: Se prefieren dos o más gránulos fecales (~ 50 mg o más pesados) para obtener ARN de la más alta pureza.- Utilice todo el equipo de protección personal (EPP) y los materiales necesarios, por ejemplo: un par de guantes de laboratorio, un aerosol desinfectante y una toalla de papel estéril, para esterilizar el área de trabajo, donde se coloca el sujeto de investigación animal, para evitar la contaminación de la muestra fecal.
- Para sujetos humanos, instruya a cada sujeto de investigación / recolector para recolectar 100-200 mg de muestras de heces en un ambiente lo más estéril posible. Utilice una operación estéril estándar y evite la contaminación de las muestras de heces.
- Utilice todo el equipo de protección personal (EPP) y los materiales necesarios, por ejemplo: un par de guantes de laboratorio, un aerosol desinfectante y una toalla de papel estéril, para esterilizar el área de trabajo, donde se coloca el sujeto de investigación animal, para evitar la contaminación de la muestra fecal.
- Recoja muestras fecales de cada sujeto animal directamente en un tubo de microcentrífuga de 2 ml con tapón de rosca sin tocar ninguna otra superficie para evitar la contaminación.
- Para sujetos humanos, indique a cada sujeto que defeque directamente en un dispositivo de recolección apropiado provisto (por ejemplo, un kit de recolección de muestras de heces estériles) para evitar la contaminación.
NOTA: Indique al sujeto que evite la contaminación por superficies de inodoros, agua, orina o cualquier otra superficie/objeto no estéril.
- Para sujetos humanos, indique a cada sujeto que defeque directamente en un dispositivo de recolección apropiado provisto (por ejemplo, un kit de recolección de muestras de heces estériles) para evitar la contaminación.
- Congele las muestras fecales recogidas en tubos de microcentrífuga de 2 ml inmediatamente a -80 °C o colóquelas en un cubo de hielo seco para obtener una mejor cantidad y calidad de ARN antes de la resuspensión de las heces como se describe en los pasos a continuación.
- En el caso de las muestras de heces humanas, alícuota cada muestra fresca de 200 mg en tubos de microcentrífuga de 2 ml con tapones de rosca y congelarlos a -80 °C antes de la resuspensión de las heces como se describe a continuación.
- Para el almacenamiento de muestras de heces que no estén en tubos de microcentrífuga de 2 ml con tapones de rosca, pesar y transferir 100-200 mg de cada una de las muestras congeladas a tubos de microcentrífuga separados de 2 ml con tapones de rosca antes de la resuspensión de las heces como se describe a continuación.
NOTA: Para muestras de heces humanas, evite tomar más de 200 mg de muestras de heces para el aislamiento de ARN, ya que puede causar dificultades en los siguientes pasos. Con una muestra sobrecargada en un tubo de microcentrífuga de 2 ml, la fase acuosa, la fase orgánica y la interfase pueden no estar claramente formadas y separadas. El procedimiento se puede pausar aquí.
- Para el almacenamiento de muestras de heces que no estén en tubos de microcentrífuga de 2 ml con tapones de rosca, pesar y transferir 100-200 mg de cada una de las muestras congeladas a tubos de microcentrífuga separados de 2 ml con tapones de rosca antes de la resuspensión de las heces como se describe a continuación.
- En el caso de las muestras de heces humanas, alícuota cada muestra fresca de 200 mg en tubos de microcentrífuga de 2 ml con tapones de rosca y congelarlos a -80 °C antes de la resuspensión de las heces como se describe a continuación.
2. Preparaciones de soluciones de lavado
- Agregue 21 ml de etanol 100% grado de la American Chemical Society (ACS) a la solución de lavado 1 proporcionada en el kit de aislamiento de miARN (consulte la Tabla de materiales) para alcanzar el volumen final de 30 ml, como se muestra en la botella. Vórtice hasta que todo se disuelva en la botella.
- Agregue 40 ml de etanol 100% de grado ACS a la solución de lavado 2/3 proporcionada para alcanzar el volumen final de 50 ml, como se muestra en la botella. Vórtice durante 5 s o hasta que la mezcla final esté bien mezclada.
3. Preparaciones de equipos y materiales
- Rocíe el área de trabajo y el equipo, por ejemplo: el banco de laboratorio, el área de trabajo en la campana de humos químicos y los bastidores de tubos de microcentrífuga, con una solución de descontaminación de ribonucleasa (RNasa) (por ejemplo, solución de descontaminación de RNasa disponible comercialmente). Para evitar la contaminación, aplicar con la solución de descontaminación RNasa en las superficies donde y cuando se considere necesario.
- Póngase una bata de laboratorio limpia, póngase una máscara facial y use guantes de laboratorio apropiados para proteger el ARN en las muestras fecales de las nucleasas presentes en la piel humana. Rocíe los guantes con una solución de descontaminación RNasa y cámbiese los guantes con frecuencia para evitar la contaminación.
- Prepare un cubo de hielo seco para muestras fecales almacenadas a -80 °C para evitar la descongelación antes de la resuspensión de las heces y un cubo de hielo para materiales, por ejemplo: Ácido-fenol: cloroformo, para prolongar la vida útil.
NOTA: Asegúrese de que los materiales, incluidos los medios utilizados en el protocolo, sean estériles sin contaminación de nucleasas.
4. Resuspensión de heces
- Resuspender 25-100 mg de muestras fecales en 600 μL de solución salina tamponada con fosfato estéril (DPBS) de Dulbecco.
PRECAUCIÓN: Las muestras fecales deben procesarse inmediatamente cuando se descongelan a partir de -80 °C sin siquiera descongelarse parcialmente para minimizar la liberación de RNasas y ARN celular a medida que los cristales de hielo rompen los compartimentos celulares interiores y exteriores cuando las células de la muestra se descongelan.- Agregue 600 μL de 1x DPBS al tubo de microcentrífuga de 2 ml con un tapón de rosca que contenga muestras fecales a temperatura ambiente (RT).
- Incubar la mezcla de muestras fecales sumergidas en 600 μL de 1x DPBS en el tubo de microcentrífuga de 2 ml tapado durante 30 min a RT.
- Vuelva a suspender la mezcla triturando con la punta de la pipeta de 1 ml y el vórtice bien con el tubo de microcentrífuga de 2 ml tapado. Para optimizar y aumentar la cantidad y calidad de ARN, resuspenda la mezcla con un homogeneizador con el ajuste para un ciclo a S4000 (o 4000 rpm) y 45 s.
5. Extracción orgánica
PRECAUCIÓN: Utilice la campana extractora de humos químicos peligrosos para los siguientes pasos hasta el Paso 6 con el uso de ácido-fenol: cloroformo y etanol de grado ACS 100% debido a su toxicidad e inflamabilidad. Cambie el EPP según sea necesario y siga las precauciones estándar adecuadas cuando se trate de materiales peligrosos.
- Extraer ARN con 600 μL de ácido-fenol: cloroformo (el volumen de ácido-fenol: cloroformo requerido es igual al volumen inicial de 1x DPBS añadido en el Paso 4.1).
- Añadir 600 μL de ácido-fenol: cloroformo a la suspensión del paso 4.1.
NOTA: Retire ácido-fenol: cloroformo de la fase inferior en la botella ya que la fase superior se mezcla con un tampón acuoso. Si se altera la interfase entre estas dos fases, espere y retire ácido-fenol: cloroformo solo cuando la interfase se restablezca para evitar la contaminación.
- Añadir 600 μL de ácido-fenol: cloroformo a la suspensión del paso 4.1.
- Vortex la mezcla durante 60 s para mezclar bien. Alternativamente, para optimizar y aumentar la cantidad de ARN en el rendimiento, mezcle utilizando un homogeneizador con el ajuste para un ciclo a S4000 y 45 s.
- Centrifugar durante 15 min a 10.000 x g a RT para separar las fases acuosa y orgánica con una microcentrífuga. Después de la centrifugación, la interfase debe ser compacta. Si no, repita la centrifugación.
NOTA: Si la interfase no pudiera ser tan compacta como se deseaba posiblemente debido a la relación desigual entre el volumen inicial y el volumen de ácido-fenol añadido: cloroformo después de varias repeticiones de centrifugación, proceda a recuperar la fase acuosa con un mayor cuidado para evitar la contaminación. - Recuperar la fase acuosa y transferirla a un nuevo tubo de microcentrífuga de 2 ml con una tapa de bisagra (no proporcionada por el kit de aislamiento de miARN).
- Retire la fase acuosa (o superior) con cuidado sin alterar la fase inferior y transfiérala a un nuevo tubo de microcentrífuga de 2 ml con una tapa de bisagra. Tenga en cuenta el volumen transferido (por ejemplo, ~ 500 μL).
NOTA: Cuando la interfase es compacta y la fase superior está claramente separada, posiblemente haya algunas partículas residuales diminutas flotando en la parte superior de la fase acuosa. Pipetear cuidadosamente para evitar estos residuos y recuperar sólo la fase acuosa visible y claramente separada para garantizar un rendimiento de ARN de calidad, incluso si sólo se puede obtener un pequeño volumen de la fase acuosa.
- Retire la fase acuosa (o superior) con cuidado sin alterar la fase inferior y transfiérala a un nuevo tubo de microcentrífuga de 2 ml con una tapa de bisagra. Tenga en cuenta el volumen transferido (por ejemplo, ~ 500 μL).
6. Aislamiento final de ARN
- Agregue 1.25 volúmenes de etanol RT ACS grado 100% a la fase acuosa en el tubo de microcentrífuga de 2 ml (por ejemplo, agregue 625 μL de etanol al 100% si se recuperan 500 μL de fase acuosa del Paso 5.4.). Vórtice 3 s.
- Cargue la mezcla de fase acuosa/etanol a través del cartucho de filtro incluido en el kit de aislamiento de miARN.
- Para cada muestra, coloque el cartucho filtrante en uno de los tubos de recolección suministrados por el kit.
- Pipetear y cargar 600 μL de la mezcla de fase acuosa/etanol en el cartucho filtrante.
NOTA: Mezcle brevemente la mezcla para mezclar completamente el etanol con la fase acuosa antes del pipeteo. No se pueden cargar más de 700 μL de la mezcla de fase acuosa/etanol a la vez.
- Pipetear y cargar 600 μL de la mezcla de fase acuosa/etanol en el cartucho filtrante.
- Centrifugar a 10.000 x g durante 90 s para filtrar a través de la mezcla. Girar a una velocidad más alta puede dañar el filtro.
- Desechar el filtrado y repetir los pasos 6.2.1 a 6.2.2 hasta que toda la mezcla se filtre a través de la misma membrana filtrante en aplicaciones sucesivas. Mantenga y reutilice el mismo tubo de recolección para los pasos de lavado a continuación.
- Lave el filtro con 700 μL de miRNA Wash Solution 1.
PRECAUCIÓN: miRNA Wash Solution 1 contiene tiocianato de guanidina que puede causar irritación de la piel y daño ocular grave. Use el EPP necesario, por ejemplo: guantes, protector facial, bata protectora de laboratorio. Cambie los guantes con frecuencia según sea necesario.- Aplique 700 μL de miRNA Wash Solution 1, la solución de trabajo preparada con etanol 100% de grado ACS, en el cartucho de filtro.
- Centrifugar durante 60 s para filtrar la solución de lavado de miARN 1 a través del cartucho filtrante.
- Deseche el filtrado del tubo de recolección y coloque el mismo cartucho de filtro en el mismo tubo de recolección.
- Lave el filtro con Wash Solution 2/3 una vez cada uno con volúmenes de 700 μL, 500 μL y 250 μL consecutivamente.
- Aplique 700 μL de Wash Solution 2/3, la solución de trabajo preparada con etanol 100% de grado ACS, en el cartucho del filtro.
- Centrifugadora a 10.000 x g durante 1 min.
- Deseche el filtrado del tubo de recolección y coloque el mismo cartucho de filtro en el mismo tubo de recolección.
- Aplique 500 μL de solución de lavado 2/3 en el cartucho filtrante.
- Centrifugadora a 10.000 x g durante 1 min.
- Deseche el filtrado del tubo de recolección y coloque el mismo cartucho de filtro en el mismo tubo de recolección.
- Aplique 250 μL de solución de lavado 2/3 en el cartucho filtrante.
- Centrifugadora a 10.000 x g durante 1 min.
- Deseche el filtrado del tubo de recolección.
- Transfiera el cartucho del filtro a un nuevo tubo de recolección y gire el conjunto durante 5 minutos para eliminar el líquido residual del filtro.
- Aplique 700 μL de Wash Solution 2/3, la solución de trabajo preparada con etanol 100% de grado ACS, en el cartucho del filtro.
- Para cada muestra, coloque el cartucho filtrante en uno de los tubos de recolección suministrados por el kit.
7. ARN eluyente con 50 μL de agua libre de nucleasas
- Transfiera el cartucho filtrante a un nuevo tubo de recolección. Pipetear 50 μL de agua libre de nucleasas al centro del filtro y tapar el tubo de recolección.
- Incubar en RT durante 10 min.
- Girar durante 5 minutos a 8.000 x g para recuperar el ARN en el nuevo tubo de recolección.
- Determinar la concentración y pureza del ARN fecal recuperado utilizando un fluorómetro. El ARN fecal recuperado puede almacenarse a -80 °C.
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Representative Results
Se aislaron ARN representativos de muestras fecales de ratón de 50 mg (2 gránulos fecales de ratón) y 100 mg de muestras de heces humanas respectivamente y se eluyeron en agua libre de nucleasas de 50 μL. El análisis espectrofotómetro de la concentración sugiere que se aisló una cantidad total de 49 μg y 16 μg de ARN respectivamente (Tabla 1). La pureza del ARN fue alta como lo indica una relación A260 / A280 de ~ 2.0 y una relación A260 / A230 de ~ 1.8 (Tabla 1). Como se informó3, la mayoría de los ARN en las heces son microARN y esos microARN pueden existir en el exosoma. De acuerdo con esto, un ensayo de electroforesis de ARN basado en chip sugiere que los aislados representativos de ARN de heces de ratón y humanos son bajos o carecen de composiciones de ARNr 18S y 28S, y el tamaño de los aislados de ARN cae en la región pequeña de ARN (Figura 1A). Otra pequeña electroforesis de ARN con la electroforesis basada en chips revela que una gran parte de los ARN son de tamaño microARN (Figura 1B). Esto es consistente con la observación de que la cuantificación completada mediante el uso de un pequeño bioanalizador de ARN es comparable a la obtenida con ensayos previos6.
| ID de muestra | Volumen de elución (μL) | Concentración de ARN (ng/μL) | A260/A280 | A260/A230 | Rendimiento (ng) |
| Ratón | 50 | 978.333 | 2.036 | 1.897 | 48916.65 |
| Humano | 50 | 330.759 | 1.981 | 1.849 | 16537.95 |
Tabla 1: Análisis representativo de nanogotas de ARN aislado con este protocolo. Se aislaron ARN representativos de 2 gránulos fecales de ratón o muestras de heces humanas de 100 mg, eluidas en agua libre de nucleasas de 50 μL. La concentración de ARN, la proporción de A260/A280 y la relación de A260/A230 se midieron con nanogota.
Figura 1: Análisis representativos de electroforesis basados en chips de la distribución de tamaño de aislados de ARN fecal. (A) Los ARN representativos aislados de 2 gránulos fecales de ratón (panel izquierdo) y muestras de heces humanas de 100 mg (panel derecho) utilizando el protocolo descrito aquí se caracterizaron utilizando el ensayo de electroforesis basado en chip. Este ensayo sugiere que la mayoría de los aislados de ARN eran ARN pequeños. (B) Los aislados se sometieron a la electroforesis de ARN pequeño con el sistema de electroforesis basado en chip para analizar la distribución de tamaño de los aislados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Es importante utilizar la técnica libre de RNasa para prevenir la contaminación por RNasa durante el aislamiento7. Después de la centrifugación y la formación de una interfase compacta, es clave evitar la interfase, la fase inferior y el contaminante de partículas flotando en la parte superior de la fase acuosa al recuperar la fase acuosa. Además, se agregan dos pasos de lavado con solución de lavado 2/3 de 500 μL y 250 μL para eliminar los contaminantes en la membrana del filtro y optimizar la calidad. Además, no se recomienda un material de muestra inicial de más de 200 mg, ya que puede crear dificultades en la formación clara de una interfase. Del mismo modo, no se recomienda un material de muestra de menos de 25 mg, ya que puede no ser suficiente para extraer suficientes muestras de ARN para el análisis posterior.
El increíble crecimiento en el estudio del microbioma ha llevado las mediciones de especies microbianas, genes a estudios metatranscripcionales del perfil microbiano8. Los microARN en las heces han sido estudiados como marcadores de enfermedades 9,10,11. Desde el primer relato de microARN fecal que media las interacciones huésped-microbio3, cada vez más estudios comienzan a investigar las contribuciones del huésped y la dieta en el ecosistema intestinal12,13,14. Cabe destacar que, debido a la riqueza de microbios en la luz intestinal y las heces, los estudios que se centran en el brazo huésped de la interacción huésped-microbio exigen una contaminación mínima de ARN de los microbios. Por lo tanto, un protocolo de extracción de ARN que incluya pasos de lisado celular15 no es ideal para el estudio de los ARN liberados del huésped y la dieta. Como tal, adaptamos este protocolo para eliminar los pasos de lisis para minimizar las contaminaciones de ARN de bacterias vivas y células huésped vivas en las heces.
Este protocolo funciona para estudios donde el ARN extracelular en el contenido de la luz fecal o intestinal es un objetivo de interés. El ARN aislado utilizando este protocolo es ARN total, incluyendo microARN como componente principal. Este protocolo no distingue si el ARN está en exosomas, microvesículas o en forma libre de vesículas.
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Disclosures
Los autores declaran no tener intereses financieros relevantes o materiales relacionados con el método de investigación descrito en este documento de protocolo.
Acknowledgments
Recibimos asistencia técnica de la Instalación de Biopolímeros de la Escuela de Medicina de Harvard para el bioanalizador. Este trabajo fue apoyado por la beca de investigación de la Sociedad Nacional de Esclerosis Múltiple RG-1707-28516 (H.L.W. y SL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acid-Phenol: Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | Thermo Fischer Scientific | AM9720 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fischer Scientific | 14190-144 | |
| Gloves | |||
| Microcentrifuge | |||
| mirVana miRNA Isolation Kit | Thermo Fischer Scientific | AM1561 | |
| Nuclease-Free microcentrifuge tubes (1.5 mL, 2 mL) | |||
| Nuclease-Free Water (Not DEPC-treated) | Thermo Fischer Scientific | AM9937 | |
| Pipettor and Nuclease-Free Pipette tips (with filter) | |||
| PowerLyzer 24 Homogenizer | QIAGEN | 13155 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Thermo Fischer Scientific | AM9780 | |
| Vortex Shaker |
References
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