Summary

Examinando a regeneração muscular em modelos de zebrafish de doença muscular

Published: January 18, 2021
doi:

Summary

A regeneração muscular esquelética é impulsionada por células-tronco musculares residentes em tecidos, que são prejudicadas em muitas doenças musculares, como distrofia muscular, e isso resulta na incapacidade do músculo de se regenerar. Aqui, descrevemos um protocolo que permite o exame da regeneração muscular em modelos de zebrafish de doença muscular.

Abstract

O músculo esquelético tem uma notável capacidade de se regenerar após a lesão, que é impulsionada por células-tronco musculares residentes de tecido obrigatório. Após a lesão, a célula-tronco muscular é ativada e sofre proliferação celular para gerar um pool de míobios, que posteriormente se diferenciam para formar novas fibras musculares. Em muitas condições de perda muscular, incluindo distrofia muscular e envelhecimento, esse processo é prejudicado, resultando na incapacidade do músculo de se regenerar. O processo de regeneração muscular em zebrafish é altamente conservado com sistemas de mamíferos fornecendo um excelente sistema para estudar a função e a regeneração das células-tronco musculares, em condições de perda muscular, como distrofia muscular. Aqui, apresentamos um método para examinar a regeneração muscular em modelos de zebrafish de doença muscular. O primeiro passo envolve o uso de uma plataforma de genotipagem que permite a determinação do genótipo das larvas antes de provocar uma lesão. Tendo determinado o genótipo, o músculo é ferido usando uma facada de agulha, seguindo a qual a microscopia de luz polarizadora é usada para determinar a extensão da regeneração muscular. Por isso, fornecemos um gasoduto de alta produtividade que permite o exame da regeneração muscular em modelos de zebrafish de doença muscular.

Introduction

O músculo esquelético é responsável por 30-50% da massa corporal humana, e não é apenas indispensável para a locomoção, mas também serve como um órgão metabólico e de armazenamento crítico1. Apesar de ser pós-metótico, o músculo esquelético é altamente dinâmico e mantém uma tremenda capacidade regenerativa após lesão. Isso é atribuído à presença de células-tronco residentes em tecidos (também chamadas de células satélites), localizadas sob a lamina basal de miofibers e marcadas pelos fatores de transcrição emparelhados da proteína da caixa 7 (pax7) e/ou proteína de caixa emparelhada 3 (pax3),entre outros2,3. Após a lesão, a célula satélite é ativada e sofre proliferação celular para gerar um pool de míobios, que posteriormente se diferenciam para formar novas fibras musculares. A cascata altamente conservada de sinais pró-regenerativos que regulam a ativação celular por satélite e o reparo muscular robusto é afetada em várias condições, como miopatias e envelhecimento homeostático4,5.

Um grupo tão diversificado de miopatias é a distrofia muscular, caracterizada pelo perda muscular progressiva e degeneração6. Essas doenças são consequência de mutações genéticas em proteínas-chave, incluindo distrofina e laminina-α2 (LAMA2), responsáveis pela fixação das fibras musculares à matriz extracelular7,8. Dado que as proteínas implicadas na distrofia muscular desempenham um papel central na manutenção da estrutura muscular, por muitos anos acreditava-se que uma falha nesse processo era o mecanismo responsável pela patogênese da doença9. No entanto, estudos recentes identificaram defeitos na regulação de células-tronco musculares e subsequente comprometimento na regeneração muscular como segunda base possível para a patologia muscular observada na distrofia muscular10,11. Como tal, mais estudos são necessários para investigar como um comprometimento na função de células-tronco musculares e elementos de nicho associados contribui para a distrofia muscular.

Na última década, o zebrafish (Danio rerio) emergiu como um importante modelo vertebrado para modelagem dedoenças 12. Isso é atribuído ao rápido desenvolvimento externo do embrião de zebrafish, aliado à sua clareza óptica, que permite a visualização direta da formação muscular, crescimento e função. Além disso, não só o desenvolvimento e estrutura do músculo altamente conservado em zebrafish, eles também apresentam um processo altamente conservado de regeneração muscular13. Consequentemente, o zebrafish representa um excelente sistema para estudar a trajetória das doenças musculares e explorar como a regeneração muscular é afetada nele. Para isso, desenvolvemos um método que permite o estudo oportuno da regeneração muscular esquelética em modelos de zebrafish de doença muscular. Este oleoduto de alto rendimento envolve um método para genótipo embriões vivos14, após o qual uma lesão agulha-facada é realizada e a extensão da regeneração muscular é imageada usando microscopia de luz polarizadora. A utilização desta técnica revelará, portanto, a capacidade regenerativa do músculo em modelos de zebrafish de doença muscular.

Protocol

A manutenção de zebrafish foi realizada de acordo com os procedimentos operacionais padrão aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Universidade monash sob licença de colônia de reprodução ERM14481. 1. Determinação do genótipo de embriões vivos usando uma plataforma de genotipagem de embriões. Anesthetize 3 dias após a fertilização (dpf) embriões de zebrafish adicionando metanos de tricaine a uma concentração final de 0,016% (v/v) em embrião médio (5 mM NaCl, 0,…

Representative Results

A capacidade de quantificar a birefringência do músculo esquelético fornece um método não invasivo, mas altamente reprodutível, para examinar e comparar níveis de dano muscular, e examinar a regeneração muscular in vivo. A birefringência resulta da difração da luz polarizada através da matriz pseudo-cristalina dos sarcomeres musculares15, e após lesão ou dano ao músculo, é evidente uma redução na birefringência. Da mesma forma, a ativa?…

Discussion

A regeneração muscular esquelética é impulsionada por células-tronco musculares residentes em tecidos obrigatórios, cuja função é alterada em muitas doenças musculares, como distrofia muscular, impedindo posteriormente o processo de regeneração muscular. Aqui, descrevemos um protocolo de alta produtividade para examinar a regeneração muscular em modelos de zebrafish vivos de doença muscular. O primeiro passo do gasoduto utiliza uma plataforma de genotipagem de embriões14, que é um…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gostaríamos de agradecer ao Dr. Alex Fulcher e à Monash Micro Imaging pela assistência com a manutenção e configuração dos microscópios. O Instituto Australiano de Medicina Regenerativa é apoiado por subsídios do Governo do Estado de Victoria e do Governo Australiano. Este trabalho foi financiado por uma concessão de projeto da Associação de Distrofia Muscular (EUA) para P.D.C (628882).

Materials

24 well plates Thermo Fischer 142475
30 gauge needles Terumo NN-3013R
90 mm Petri Dishes Pacific Laboratory Products PT S9014S20
DNA extraction chips wFluidx ZEG chips
Embryo genotyping platform wFluidx ZEG base unit Zebrafish Embryo Genotyper
Glass pipette Hirschmann 9260101
Glass plate dish WPI FD35-100 Commonly referred to as FluoroDish
Incubator Thermoline Scientific TEI-43L
Plastic pipette Livingstone PTP03-01
Polarizing microscope Abrio N/A

References

  1. Egan, B., Zierath, J. R. Exercise Metabolism and the Molecular Regulation of Skeletal Muscle Adaptation. Cell Metabolism. 17 (2), 162-184 (2013).
  2. Seale, P., Sabourin, L. A., Girgis-Gabardo, A., Mansouri, A., Gruss, P., Rudnicki, M. A. Pax7 is required for the specification of myogenic satellite cells. Cell. 102 (6), 777-786 (2000).
  3. Relaix, F., Rocancourt, D., Mansouri, A., Buckingham, M. A Pax3/Pax7-dependent population of skeletal muscle progenitor cells. Nature. 435 (7044), 948-953 (2005).
  4. Sousa-Victor, P., et al. Geriatric muscle stem cells switch reversible quiescence into senescence. Nature. 506 (7488), 316-321 (2014).
  5. Egerman, M. A., et al. GDF11 Increases with Age and Inhibits Skeletal Muscle Regeneration. Cell Metabolism. 22 (1), 164-174 (2015).
  6. Emery, A. E. The muscular dystrophies. The Lancet. 359 (9307), 687-695 (2002).
  7. Emery, A. E. H. . Duchenne muscular dystrophy. , (1993).
  8. Anne Helbling-Leclerc, P. G. Mutations in the laminin α2-chain gene (LAMA2) cause merosin-deficient congenital muscular dystrophy. Nature Genetics. (11), 216-218 (1995).
  9. Campbell, K. P. Three muscular dystrophies: loss of cytoskeleton-extracellular matrix linkage. Cell. 80 (5), 675-679 (1995).
  10. Cerletti, M., et al. Highly efficient, functional engraftment of skeletal muscle stem cells in dystrophic muscles. Cell. 134 (1), 37-47 (2008).
  11. Dumont, N. A., et al. Dystrophin expression in muscle stem cells regulates their polarity and asymmetric division. Nature Medicine. 21 (12), 1455-1463 (2015).
  12. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews. Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
  13. Gurevich, D. B., et al. Asymmetric division of clonal muscle stem cells coordinates muscle regeneration in vivo. Science. 353 (6295), (2016).
  14. Lambert, C. J., et al. An automated system for rapid cellular extraction from live zebrafish embryos and larvae: Development and application to genotyping. PloS One. 13 (3), 0193180 (2018).
  15. Berger, J., Sztal, T., Currie, P. D. Quantification of birefringence readily measures the level of muscle damage in zebrafish. Biochemical and Biophysical Research Communications. 423 (4), 785-788 (2012).
  16. Hall, T. E., et al. The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin alpha2-deficient congenital muscular dystrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (17), 7092-7097 (2007).
  17. Otten, C., et al. Xirp Proteins Mark Injured Skeletal Muscle in Zebrafish. PLOS ONE. 7 (2), 31041 (2012).
  18. Otten, C., Abdelilah-Seyfried, S. Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle. Journal of Visualized Experiments JoVE. (71), e4351 (2013).
  19. Nguyen, P. D., et al. Muscle Stem Cells Undergo Extensive Clonal Drift during Tissue Growth via Meox1-Mediated Induction of G2 Cell-Cycle Arrest. Cell Stem Cell. 21 (1), 107-119 (2017).
  20. Ruparelia, A. A., Ratnayake, D., Currie, P. D. Stem cells in skeletal muscle growth and regeneration in amniotes and teleosts: Emerging themes. Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 9 (2), 365 (2020).

Play Video

Cite This Article
Montandon, M., Currie, P. D., Ruparelia, A. A. Examining Muscle Regeneration in Zebrafish Models of Muscle Disease. J. Vis. Exp. (167), e62071, doi:10.3791/62071 (2021).

View Video