Kas Hastalığının Zebra Balığı Modellerinde Kas Yenilenmesinin İncelenmesi
Summary
İskelet kas rejenerasyonu, kas distrofisi gibi birçok kas hastalığında bozulan doku yerleşik kas kök hücreleri tarafından yönlendirilir ve bu da kasın yenilenememesi ile sonuçlanır. Burada, kas hastalığının zebra balığı modellerinde kas yenilenmesinin incelenmesini sağlayan bir protokol açıklıyoruz.
Abstract
İskelet kası, zorunlu doku yerleşik kas kök hücreleri tarafından yönlendirilen yaralanmadan sonra yenilenme konusunda dikkat çekici bir yete sahiptir. Yaralanmadan sonra, kas kök hücresi aktive edilir ve daha sonra yeni kas lifleri oluşturmak için farklılaşarak bir mioblast havuzu oluşturmak için hücre çoğalmasından geçer. Kas distrofisi ve yaşlanma da dahil olmak üzere birçok kas israfı koşulunda, bu işlem bozulur ve bu da kasın yenilenememesine neden olur. Zebra balıklarında kas yenilenme süreci, kas distrofisi gibi kas israfı koşullarında kas kök hücre fonksiyonunu ve yenilenmeyi incelemek için mükemmel bir sistem sağlayan memeli sistemleri ile yüksek oranda korunur. Burada, kas hastalığının zebra balığı modellerinde kas yenilenmesini incelemek için bir yöntem sunuyoruz. İlk adım, bir yaralanma ortaya çıkmadan önce larvaların genotipinin belirlenmesine izin veren bir genotipleme platformunun kullanılmasını içerir. Genotip belirlendikten sonra, kas bir iğne bıçağı kullanılarak kas yaralanır, ardından kas yenilenmesinin boyutunu belirlemek için polarize edici ışık mikroskopisi kullanılır. Bu nedenle, kas hastalığının zebra balığı modellerinde kas yenilenmesinin incelenmesini sağlayan yüksek verimli bir boru hattı sağlıyoruz.
Introduction
İskelet kası insan vücut kütlesinin% 30-50’sini oluşturur ve sadece hareketlilik için vazgeçilmez değildir, aynı zamanda kritik bir metabolik ve depolama organı olarak da hizmet eder1. Postmitotik olmasına rağmen, iskelet kası son derece dinamiktir ve yaralanmadan sonra muazzam bir rejeneratif kapasiteye sahip olur. Bu, miyofiberlerin bazal laminası altında bulunan ve transkripsiyon faktörleri ile işaretlenmiş kutu protein 7 ( pax7 ) ve / veya eşleştirilmiş kutu protein 3( pax3 ) ile işaretlenmiş doku yerleşik kök hücrelerin (uydu hücreleri olarak da adlandırılır) varlığınaatfedilir. Yaralanmadan sonra, uydu hücresi aktive edilir ve daha sonra yeni kas lifleri oluşturmak için farklılaşılan bir mioblast havuzu oluşturmak için hücre çoğalmasından geçer. Uydu hücresi aktivasyonunu ve sağlam kas onarımını düzenleyen pro-rejeneratif sinyallerin yüksek oranda korunmuş kaskadı miyopatiler ve homeostatik yaşlanma4,5gibi çeşitli durumlarda etkilenir.
Bu kadar çeşitli miyopatilerden biri, ilerleyici kas israfı ve dejenerasyon ile karakterize kas distrofisidir6. Bu hastalıklar, kas liflerinin hücre dışı matris7,8’ebağlanmasından sorumlu olan distrofin ve laminin-α2 (LAMA2) dahil olmak üzere anahtar proteinlerdeki genetik mutasyonların sonucudur. Kas distrofisine karışan proteinlerin kas yapısının korunmasında bu kadar merkezi bir rol oynadığı göz önüne alındığında, uzun yıllar boyunca bu süreçteki bir başarısızlığın hastalık patogenezden sorumlu mekanizma olduğuna inanılıyordu9. Bununla birlikte, son çalışmalar kas kök hücrelerinin düzenlenmesinde kusurlar ve kas yenilenmesinde daha sonra bozulmayı kas distrofisinde gözlenen kas patolojisinin ikinci olası temeli olarak tanımlamıştır10,11. Bu nedenle, kas kök hücre fonksiyonundaki ve ilişkili niş elemanlardaki bir bozukluğun kas distrofisine nasıl katkıda bulunduğunu araştırmak için daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır.
Son on yılda, zebra balığı (Danio rerio) hastalık modellemesi için önemli bir omurgalı modeli olarak ortaya çıkmıştır12. Bu, zebra balığı embriyosunun hızlı dış gelişimine, kas oluşumunun, büyümesinin ve işlevinin doğrudan görselleştirilmesine izin veren optik netliği ile birleştiğinde atfedilir. Ek olarak, sadece zebra balıklarında yüksek oranda korunan kas gelişimi ve yapısı değil, aynı zamanda yüksek oranda korunmuş bir kas rejenerasyon sürecigösterirler 13. Sonuç olarak, zebra balığı kas hastalıklarının patobiyolojisini incelemek ve kas yenilenmesinin içinde nasıl etkilendiğini keşfetmek için mükemmel bir sistemi temsil eder. Bu amaçla, kas hastalığının zebra balığı modellerinde iskelet kas rejenerasyonunun zamanında incelenmesini sağlayan bir yöntem geliştirdik. Bu yüksek verim boru hattı genotip canlı embriyolar için bir yöntem içerir14, ardından bir iğne-bıçak yaralanması gerçekleştirilir ve kas rejenerasyonunun boyutu polarize ışık mikroskopisi kullanılarak görüntülenmiştir. Bu nedenle bu tekniğin kullanımı, kas hastalığının zebra balığı modellerinde kasın rejeneratif kapasitesini ortaya getirecektir.
Protocol
Representative Results
Discussion
İskelet kas rejenerasyonu, kas distrofisi gibi birçok kas hastalığında işlevi değiştirilen ve daha sonra kas yenilenme sürecini engelleyen zorunlu doku yerleşik kas kök hücreleri tarafından yönlendirilir. Burada, kas hastalığının canlı zebra balığı modellerinde kas yenilenmesini incelemek için yüksek verim protokolünü açıklıyoruz. Boru hattının ilk adımı, aşağı akış rejenerasyon testini gerçekleştirmeden önce, canlı larvaların genotipini belirlemek için kullanıcı dostu ve do?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Alex Fulcher’a ve Monash Micro Imaging’e mikroskop bakımı ve kurulumu konusunda yardımları için teşekkür ederiz. Avustralya Rejeneratif Tıp Enstitüsü, Victoria Eyalet Hükümeti ve Avustralya Hükümeti’nin hibeleriyle desteklenmektedir. Bu çalışma, P.D.’ye (628882) bir Musküler Distrofi Derneği (ABD) projesi hibesi ile finanse .C.
Materials
| 24 well plates | Thermo Fischer | 142475 | |
| 30 gauge needles | Terumo | NN-3013R | |
| 90 mm Petri Dishes | Pacific Laboratory Products PT | S9014S20 | |
| DNA extraction chips | wFluidx | ZEG chips | |
| Embryo genotyping platform | wFluidx | ZEG base unit | Zebrafish Embryo Genotyper |
| Glass pipette | Hirschmann | 9260101 | |
| Glass plate dish | WPI | FD35-100 | Commonly referred to as FluoroDish |
| Incubator | Thermoline Scientific | TEI-43L | |
| Plastic pipette | Livingstone | PTP03-01 | |
| Polarizing microscope | Abrio | N/A |
References
- Egan, B., Zierath, J. R. Exercise Metabolism and the Molecular Regulation of Skeletal Muscle Adaptation. Cell Metabolism. 17 (2), 162-184 (2013).
- Seale, P., Sabourin, L. A., Girgis-Gabardo, A., Mansouri, A., Gruss, P., Rudnicki, M. A. Pax7 is required for the specification of myogenic satellite cells. Cell. 102 (6), 777-786 (2000).
- Relaix, F., Rocancourt, D., Mansouri, A., Buckingham, M. A Pax3/Pax7-dependent population of skeletal muscle progenitor cells. Nature. 435 (7044), 948-953 (2005).
- Sousa-Victor, P., et al. Geriatric muscle stem cells switch reversible quiescence into senescence. Nature. 506 (7488), 316-321 (2014).
- Egerman, M. A., et al. GDF11 Increases with Age and Inhibits Skeletal Muscle Regeneration. Cell Metabolism. 22 (1), 164-174 (2015).
- Emery, A. E. The muscular dystrophies. The Lancet. 359 (9307), 687-695 (2002).
- Emery, A. E. H. . Duchenne muscular dystrophy. , (1993).
- Anne Helbling-Leclerc, P. G. Mutations in the laminin α2-chain gene (LAMA2) cause merosin-deficient congenital muscular dystrophy. Nature Genetics. (11), 216-218 (1995).
- Campbell, K. P. Three muscular dystrophies: loss of cytoskeleton-extracellular matrix linkage. Cell. 80 (5), 675-679 (1995).
- Cerletti, M., et al. Highly efficient, functional engraftment of skeletal muscle stem cells in dystrophic muscles. Cell. 134 (1), 37-47 (2008).
- Dumont, N. A., et al. Dystrophin expression in muscle stem cells regulates their polarity and asymmetric division. Nature Medicine. 21 (12), 1455-1463 (2015).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews. Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
- Gurevich, D. B., et al. Asymmetric division of clonal muscle stem cells coordinates muscle regeneration in vivo. Science. 353 (6295), (2016).
- Lambert, C. J., et al. An automated system for rapid cellular extraction from live zebrafish embryos and larvae: Development and application to genotyping. PloS One. 13 (3), 0193180 (2018).
- Berger, J., Sztal, T., Currie, P. D. Quantification of birefringence readily measures the level of muscle damage in zebrafish. Biochemical and Biophysical Research Communications. 423 (4), 785-788 (2012).
- Hall, T. E., et al. The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin alpha2-deficient congenital muscular dystrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (17), 7092-7097 (2007).
- Otten, C., et al. Xirp Proteins Mark Injured Skeletal Muscle in Zebrafish. PLOS ONE. 7 (2), 31041 (2012).
- Otten, C., Abdelilah-Seyfried, S. Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle. Journal of Visualized Experiments JoVE. (71), e4351 (2013).
- Nguyen, P. D., et al. Muscle Stem Cells Undergo Extensive Clonal Drift during Tissue Growth via Meox1-Mediated Induction of G2 Cell-Cycle Arrest. Cell Stem Cell. 21 (1), 107-119 (2017).
- Ruparelia, A. A., Ratnayake, D., Currie, P. D. Stem cells in skeletal muscle growth and regeneration in amniotes and teleosts: Emerging themes. Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 9 (2), 365 (2020).
