Esame della rigenerazione muscolare nei modelli zebrafish di malattia muscolare
Summary
La rigenerazione del muscolo scheletrico è guidata dalle cellule staminali muscolari residenti nei tessuti, che sono compromesse in molte malattie muscolari come la distrofia muscolare, e questo si traduce nell’incapacità del muscolo di rigenerarsi. Qui, descriviamo un protocollo che consente l’esame della rigenerazione muscolare in modelli di zebrafish di malattia muscolare.
Abstract
Il muscolo scheletrico ha una notevole capacità di rigenerarsi dopo una lesione, che è guidata da cellule staminali muscolari residenti nel tessuto obbligato. A seguito di lesioni, la cellula staminale muscolare viene attivata e subisce la proliferazione cellulare per generare un pool di mioblasti, che successivamente si differenziano per formare nuove fibre muscolari. In molte condizioni di deperimento muscolare, tra cui la distrofia muscolare e l’invecchiamento, questo processo è compromesso con conseguente incapacità del muscolo di rigenerarsi. Il processo di rigenerazione muscolare nel pesce zebra è altamente conservato con sistemi di mammiferi che forniscono un eccellente sistema per studiare la funzione e la rigenerazione delle cellule staminali muscolari, in condizioni di deperimento muscolare come la distrofia muscolare. Qui, presentiamo un metodo per esaminare la rigenerazione muscolare nei modelli di zebrafish di malattia muscolare. Il primo passo prevede l’utilizzo di una piattaforma di genotipizzazione che permette la determinazione del genotipo delle larve prima di suscitare una lesione. Dopo aver determinato il genotipo, il muscolo viene ferito usando una pugnalata con ago, a seguito della quale viene utilizzata la microscopia a luce polarizzante per determinare l’entità della rigenerazione muscolare. Forniamo quindi una pipeline ad alta produttività che consente l’esame della rigenerazione muscolare in modelli zebrafish di malattia muscolare.
Introduction
Il muscolo scheletrico rappresenta il 30-50% della massa corporea umana e non è solo indispensabile per la locomozione, ma funge anche da organo metabolico e di stoccaggio critico1. Nonostante sia postmitotico, il muscolo scheletrico è altamente dinamico e mantiene un’enorme capacità rigenerativa dopo l’infortunio. Ciò è attribuito alla presenza di cellule staminali residenti nei tessuti (chiamate anche cellule satelliti), situate sotto la lamina basale delle miofibre e contrassegnate dai fattori di trascrizione accoppiati box protein 7 (pax7) e / o paired box protein 3 (pax3), tra gli altri2,3. A seguito di lesioni, la cellula satellite viene attivata e subisce la proliferazione cellulare per generare un pool di mioblasti, che successivamente si differenziano per formare nuove fibre muscolari. La cascata altamente conservata di segnali pro-rigenerativi che regolano l’attivazione delle cellule satelliti e la robusta riparazione muscolare è influenzata in varie condizioni come le miopatie e l’invecchiamento omeostatico4,5.
Uno di questi diversi gruppi di miopatie è la distrofia muscolare, caratterizzata da progressivo deperimento muscolare e degenerazione6. Queste malattie sono la conseguenza di mutazioni genetiche in proteine chiave, tra cui distrofina e laminina-α2 (LAMA2), responsabili dell’attaccamento delle fibre muscolari alla matrice extracellulare7,8. Dato che le proteine implicate nella distrofia muscolare svolgono un ruolo così centrale nel mantenimento della struttura muscolare, per molti anni si è creduto che un fallimento in questo processo fosse il meccanismo responsabile della patogenesi della malattia9. Tuttavia, studi recenti hanno identificato difetti nella regolazione delle cellule staminali muscolari e conseguente compromissione nella rigenerazione muscolare come seconda possibile base per la patologia muscolare osservata nella distrofia muscolare10,11. Pertanto, sono necessari ulteriori studi per indagare su come una compromissione della funzione delle cellule staminali muscolari e degli elementi di nicchia associati contribuisca alla distrofia muscolare.
Negli ultimi dieci anni, il pesce zebra (Danio rerio) è emerso come un importante modello di vertebrati per la modellazione delle malattie12. Ciò è attribuito al rapido sviluppo esterno dell’embrione di zebrafish, insieme alla sua chiarezza ottica, che consente la visualizzazione diretta della formazione, della crescita e della funzione muscolare. Inoltre, non solo lo sviluppo e la struttura del muscolo sono altamente conservati nel pesce zebra, ma mostrano anche un processo altamente conservato di rigenerazione muscolare13. Di conseguenza, i pesci zebra rappresentano un ottimo sistema per studiare la patobiologia delle malattie muscolari ed esplorare come la rigenerazione muscolare è influenzata in essa. A tal fine, abbiamo sviluppato un metodo che consente lo studio tempestivo della rigenerazione del muscolo scheletrico in modelli di zebrafish di malattia muscolare. Questa pipeline ad alto rendimento comporta un metodo per genotipizzare gli embrioni vivi14, a seguito del quale viene eseguita una lesione da pugnalata con ago e l’entità della rigenerazione muscolare viene cioè utilizzando la microscopia a luce polarizzante. L’utilizzo di questa tecnica rivelerà quindi la capacità rigenerativa del muscolo nei modelli di zebrafish di malattia muscolare.
Protocol
Representative Results
Discussion
La rigenerazione del muscolo scheletrico è guidata da cellule staminali muscolari residenti nel tessuto obbligato, la cui funzione è alterata in molte malattie muscolari come la distrofia muscolare, ostacolando successivamente il processo di rigenerazione muscolare. Qui, descriviamo un protocollo ad alto rendimento per esaminare la rigenerazione muscolare in modelli di zebrafish vivi di malattia muscolare. Il primo passo della pipeline utilizza una piattaforma di genotipizzazione degli embrioni14</sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare il Dr. Alex Fulcher e Monash Micro Imaging per l’assistenza con la manutenzione e la configurazione del microscopio. L’Australian Regenerative Medicine Institute è supportato da sovvenzioni del governo statale di Victoria e del governo australiano. Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione del progetto della Muscular Dystrophy Association (USA) a P.D.C (628882).
Materials
| 24 well plates | Thermo Fischer | 142475 | |
| 30 gauge needles | Terumo | NN-3013R | |
| 90 mm Petri Dishes | Pacific Laboratory Products PT | S9014S20 | |
| DNA extraction chips | wFluidx | ZEG chips | |
| Embryo genotyping platform | wFluidx | ZEG base unit | Zebrafish Embryo Genotyper |
| Glass pipette | Hirschmann | 9260101 | |
| Glass plate dish | WPI | FD35-100 | Commonly referred to as FluoroDish |
| Incubator | Thermoline Scientific | TEI-43L | |
| Plastic pipette | Livingstone | PTP03-01 | |
| Polarizing microscope | Abrio | N/A |
References
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