בחינת התחדשות שרירים במודלים של דגי זברה של מחלת שרירים
Summary
התחדשות שרירי השלד מונעת על ידי תאי גזע שריריים תושב רקמות, אשר לקויים במחלות שרירים רבות כגון ניוון שרירים, וזה גורם לחוסר היכולת של השריר להתחדש. כאן, אנו מתארים פרוטוקול המאפשר בדיקה של התחדשות שרירים במודלים של דגי זברה של מחלת שרירים.
Abstract
לשריר השלד יש יכולת יוצאת דופן להתחדש בעקבות פציעה, המונעת על ידי תאי גזע שריריים תושב רקמות. בעקבות פציעה, תא גזע השריר מופעל ועובר התפשטות תאים כדי ליצור מאגר של myoblasts, אשר לאחר מכן להבדיל כדי ליצור סיבי שריר חדשים. במצבים רבים של בזבוז שרירים, כולל ניוון שרירים והזדקנות, תהליך זה נפגע וכתוצאה מכך חוסר היכולת של השריר להתחדש. תהליך התחדשות השרירים בדגי זברה נשמר מאוד במערכות יונקים המספקות מערכת מצוינת לחקר תפקוד תאי גזע שריריים והתחדשות, בתנאים מבזבזי שרירים כגון ניוון שרירים. כאן, אנו מציגים שיטה לבחון התחדשות שרירים במודלים של דגי זברה של מחלת שרירים. הצעד הראשון כרוך בשימוש בפלטפורמת genotyping המאפשרת קביעת הגנוטיפ של הזחלים לפני גרימת פציעה. לאחר שקבע את הגנוטיפ, השריר נפגע באמצעות דקירת מחט, שלאחריה מיקרוסקופיה אור מקוטב משמש כדי לקבוע את מידת התחדשות השרירים. לכן אנו מספקים צינור תפוקה גבוהה המאפשר בדיקה של התחדשות שרירים במודלים של דגי זברה של מחלת שרירים.
Introduction
שריר השלד מהווה 30-50% ממסת גוף האדם, והוא לא רק הכרחי לקטר, אלא הוא משמש גם כאיבר מטבולי ואחסון קריטי1. למרות היותו פוסט-מיטוטי, שריר השלד דינמי מאוד ושומר על יכולת התחדשות אדירה בעקבות פציעה. זה מיוחס לנוכחות של תאי גזע תושב רקמות (המכונה גם תאי לווין), הממוקם מתחת למינה הבסיסית של myofibers ומסומן על ידי גורמי שעתוק זיווג חלבון תיבה 7 (pax7) ו / או חלבון תיבת מזווג 3 (pax3), בין היתר2,3. בעקבות פציעה, תא הלוויין מופעל ועובר התפשטות תאים כדי ליצור מאגר של myoblasts, אשר לאחר מכן להבדיל כדי ליצור סיבי שריר חדשים. מפל שמור מאוד של אותות פרו-רגנרטיביים המסדירים את הפעלת תאי הלוויין ותיקון שרירים חזק מושפע בתנאים שונים כגון מיופתיות והזדקנות הומיאוסטטית4,5.
קבוצה מגוונת כזו של מיופתיות היא ניוון שרירים, המאופיין בבזבוז שרירים מתקדם וניוון6. מחלות אלה הן תוצאה של מוטציות גנטיות בחלבונים מרכזיים, כולל דיסטרופין ולמינין-α2 (LAMA2), האחראי על צירוף סיבי שריר למטריקס החוץ תאי7,8. בהתחשב בכך חלבונים מעורבים ניוון שרירים לשחק תפקיד מרכזי כזה בשמירה על מבנה השריר, במשך שנים רבות האמינו כי כישלון בתהליך זה היה המנגנון האחראי על פתוגנזההמחלה 9. עם זאת, מחקרים אחרונים זיהו פגמים בוויסות תאי גזע שרירים ופגיעה לאחר מכן בהתחדשות השרירים כבסיס אפשרי שני לפתולוגיית השרירים שנצפו בניוון שרירים10,11. ככזה, דרושים מחקרים נוספים כדי לחקור כיצד פגיעה בתפקוד תאי גזע שרירים ואלמנטים נישה הקשורים תורם ניוון שרירים.
בעשור האחרון, דגי זברה(דניו rerio)הופיעו כמודל בעל חוליות חשוב עבור מודל מחלות12. זה מיוחס להתפתחות החיצונית המהירה של העובר דג הזברה, יחד עם הבהירות האופטית שלו, המאפשרת הדמיה ישירה של היווצרות שרירים, צמיחה ותפקוד. בנוסף, לא רק הפיתוח והמבנה של שריר שמור מאוד דגי זברה, הם גם מציגים תהליך שמור מאוד שלהתחדשות שרירים 13. כתוצאה מכך, דגי זברה מייצגים מערכת מצוינת לחקר הפתוביולוגיה של מחלות שרירים, ולחקור כיצד התחדשות השרירים מושפעת ממנה. לכך פיתחנו שיטה המאפשרת מחקר בזמן של התחדשות שרירי השלד במודלים של דגי זברה של מחלת שרירים. צינור תפוקה גבוה זה כרוך בשיטה לגנוטיפ עוברים חיים14, ולאחר מכן מתבצעת פגיעה דקירת מחט ומידת התחדשות השרירים מצטלם באמצעות מיקרוסקופיית אור מקוטבת. ניצול טכניקה זו יחשוף אפוא את היכולת המתחדשת של השריר במודלים של דגי זברה של מחלת שרירים.
Protocol
Representative Results
Discussion
התחדשות שרירי השלד מונעת על ידי תאי גזע שרירים תושב רקמות מחייבים, שתפקידם משתנה במחלות שרירים רבות כגון ניוון שרירים, ובהמשך פוגע בתהליך של התחדשות השרירים. כאן, אנו מתארים פרוטוקול תפוקה גבוהה כדי לבחון התחדשות שרירים במודלים של דגי זברה חיים של מחלת שרירים. השלב הראשון של הצינור משתמש ב…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות לד”ר אלכס פולצ’ר, ול-מונאש מיקרו הדמיה על הסיוע בתחזוקת מיקרוסקופ והגדרתם. המכון האוסטרלי לרפואה רגנרטיבית נתמך על ידי מענקים מממשלת מדינת ויקטוריה וממשלת אוסטרליה. עבודה זו מומנה על ידי מענק פרויקט של האגודה לניוון שרירים (ארה”ב) ל-P.D.C (628882).
Materials
| 24 well plates | Thermo Fischer | 142475 | |
| 30 gauge needles | Terumo | NN-3013R | |
| 90 mm Petri Dishes | Pacific Laboratory Products PT | S9014S20 | |
| DNA extraction chips | wFluidx | ZEG chips | |
| Embryo genotyping platform | wFluidx | ZEG base unit | Zebrafish Embryo Genotyper |
| Glass pipette | Hirschmann | 9260101 | |
| Glass plate dish | WPI | FD35-100 | Commonly referred to as FluoroDish |
| Incubator | Thermoline Scientific | TEI-43L | |
| Plastic pipette | Livingstone | PTP03-01 | |
| Polarizing microscope | Abrio | N/A |
References
- Egan, B., Zierath, J. R. Exercise Metabolism and the Molecular Regulation of Skeletal Muscle Adaptation. Cell Metabolism. 17 (2), 162-184 (2013).
- Seale, P., Sabourin, L. A., Girgis-Gabardo, A., Mansouri, A., Gruss, P., Rudnicki, M. A. Pax7 is required for the specification of myogenic satellite cells. Cell. 102 (6), 777-786 (2000).
- Relaix, F., Rocancourt, D., Mansouri, A., Buckingham, M. A Pax3/Pax7-dependent population of skeletal muscle progenitor cells. Nature. 435 (7044), 948-953 (2005).
- Sousa-Victor, P., et al. Geriatric muscle stem cells switch reversible quiescence into senescence. Nature. 506 (7488), 316-321 (2014).
- Egerman, M. A., et al. GDF11 Increases with Age and Inhibits Skeletal Muscle Regeneration. Cell Metabolism. 22 (1), 164-174 (2015).
- Emery, A. E. The muscular dystrophies. The Lancet. 359 (9307), 687-695 (2002).
- Emery, A. E. H. . Duchenne muscular dystrophy. , (1993).
- Anne Helbling-Leclerc, P. G. Mutations in the laminin α2-chain gene (LAMA2) cause merosin-deficient congenital muscular dystrophy. Nature Genetics. (11), 216-218 (1995).
- Campbell, K. P. Three muscular dystrophies: loss of cytoskeleton-extracellular matrix linkage. Cell. 80 (5), 675-679 (1995).
- Cerletti, M., et al. Highly efficient, functional engraftment of skeletal muscle stem cells in dystrophic muscles. Cell. 134 (1), 37-47 (2008).
- Dumont, N. A., et al. Dystrophin expression in muscle stem cells regulates their polarity and asymmetric division. Nature Medicine. 21 (12), 1455-1463 (2015).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews. Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
- Gurevich, D. B., et al. Asymmetric division of clonal muscle stem cells coordinates muscle regeneration in vivo. Science. 353 (6295), (2016).
- Lambert, C. J., et al. An automated system for rapid cellular extraction from live zebrafish embryos and larvae: Development and application to genotyping. PloS One. 13 (3), 0193180 (2018).
- Berger, J., Sztal, T., Currie, P. D. Quantification of birefringence readily measures the level of muscle damage in zebrafish. Biochemical and Biophysical Research Communications. 423 (4), 785-788 (2012).
- Hall, T. E., et al. The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin alpha2-deficient congenital muscular dystrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (17), 7092-7097 (2007).
- Otten, C., et al. Xirp Proteins Mark Injured Skeletal Muscle in Zebrafish. PLOS ONE. 7 (2), 31041 (2012).
- Otten, C., Abdelilah-Seyfried, S. Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle. Journal of Visualized Experiments JoVE. (71), e4351 (2013).
- Nguyen, P. D., et al. Muscle Stem Cells Undergo Extensive Clonal Drift during Tissue Growth via Meox1-Mediated Induction of G2 Cell-Cycle Arrest. Cell Stem Cell. 21 (1), 107-119 (2017).
- Ruparelia, A. A., Ratnayake, D., Currie, P. D. Stem cells in skeletal muscle growth and regeneration in amniotes and teleosts: Emerging themes. Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 9 (2), 365 (2020).
