Het onderzoeken van Spierregeneratie in Zebrafish Modellen van Spierziekte
Summary
Skeletspierregeneratie wordt aangedreven door weefsel ingezeten spierstamcellen, die bij veel spierziekten zoals spierdystrofie worden aangetast, en dit resulteert in het onvermogen van spieren om te regenereren. Hier beschrijven we een protocol dat het mogelijk maakt om spierregeneratie te onderzoeken in zebravismodellen van spierziekte.
Abstract
Skeletspier heeft een opmerkelijk vermogen om te regenereren na letsel, dat wordt aangedreven door obligate weefsel ingezetene spierstamcellen. Na een blessure wordt de spierstamcel geactiveerd en ondergaat celproliferatie om een pool van myoblasten te genereren, die vervolgens differentiëren om nieuwe spiervezels te vormen. In veel spier verspillen voorwaarden, met inbegrip van spierdystrofie en veroudering, dit proces wordt aangetast, wat resulteert in het onvermogen van de spier om te regenereren. Het proces van spierregeneratie bij zebravissen is zeer geconserveerd met zoogdiersystemen die een uitstekend systeem bieden om de functie en regeneratie van spierstamcellen te bestuderen, in spierverspillende omstandigheden zoals spierdystrofie. Hier presenteren we een methode om spierregeneratie te onderzoeken in zebravismodellen van spierziekte. De eerste stap omvat het gebruik van een genotyperingsplatform dat de bepaling van het genotype van de larven mogelijk maakt voordat een verwonding wordt veroorzaakt. Na het genotype te hebben bepaald, wordt de spier verwond met behulp van een naaldsteek, waarna polariserende lichtmicroscopie wordt gebruikt om de mate van spierregeneratie te bepalen. We bieden daarom een pijpleiding met hoge doorvoer die het mogelijk maakt om spierregeneratie te onderzoeken in zebravismodellen van spierziekten.
Introduction
Skeletspieren zijn goed voor 30-50% van de menselijke lichaamsmassa en zijn niet alleen onmisbaar voor voortbeweging, maar het dient ook als een kritisch metabolisch en opslagorgaan1. Ondanks het feit dat postmitotisch, skeletspieren is zeer dynamisch en behoudt een enorme regeneratieve capaciteit na blessure. Dit wordt toegeschreven aan de aanwezigheid van in weefsel ingezeten stamcellen (ook wel satellietcellen genoemd), gelegen onder de basale lamina van myofiberen en gekenmerkt door de transcriptiefactoren gekoppeld dooseiwit 7 (pax7) en/of gepaard dooseiwit 3 (pax3), onder andere2,3. Na letsel wordt de satellietcel geactiveerd en ondergaat celproliferatie om een pool van myoblasten te genereren, die vervolgens differentiëren om nieuwe spiervezels te vormen. De sterk geconserveerde cascade van pro-regeneratieve signalen die satellietcelactivering en robuust spierherstel reguleren , wordt beïnvloed in verschillende omstandigheden zoals myopathieën en homeostatische veroudering4,5.
Een dergelijke diverse groep myopathieën is spierdystrofie, gekenmerkt door progressieve spierverspilling en degeneratie6. Deze ziekten zijn het gevolg van genetische mutaties in belangrijke eiwitten, waaronder dystrofine en laminine-α2 (LAMA2), verantwoordelijk voor de aanhechting van spiervezels aan de extracellulaire matrix7,8. Gezien het feit dat eiwitten die betrokken zijn bij spierdystrofie zo’n centrale rol spelen bij het behoud van de spierstructuur, werd jarenlang aangenomen dat een mislukking in dit proces het mechanisme was dat verantwoordelijk was voor ziektepathogenese9. Recente studies hebben echter defecten in de regulatie van spierstamcellen en daaropvolgende stoornissen in spierregeneratie geïdentificeerd als een tweede mogelijke basis voor de spierpathologie waargenomen bij spierdystrofie10,11. Als zodanig zijn verdere studies nodig om te onderzoeken hoe een stoornis in de spierstamcelfunctie en bijbehorende niche-elementen bijdraagt aan spierdystrofie.
In de afgelopen tien jaar is zebravis (Danio rerio) naar voren gekomen als een belangrijk gewerveld model voor ziektemodellering12. Dit wordt toegeschreven aan de snelle externe ontwikkeling van het zebravisembryo, in combinatie met de optische helderheid, die de directe visualisatie van spiervorming, groei en functie mogelijk maakt. Bovendien is niet alleen de ontwikkeling en structuur van spieren sterk geconserveerd in zebravissen, ze vertonen ook een zeer geconserveerd proces van spierregeneratie13. Bijgevolg vertegenwoordigen zebravissen een uitstekend systeem om de pathobiologie van spierziekten te bestuderen en te onderzoeken hoe spierregeneratie erin wordt beïnvloed. Hiervoor hebben we een methode ontwikkeld die het mogelijk maakt om skeletspierregeneratie tijdig te bestuderen in zebravismodellen van spierziekten. Deze pijpleiding met hoge doorvoer omvat een methode om levende embryo’s14te genotypen, waarna een naaldsteekletsel wordt uitgevoerd en de mate van spierregeneratie wordt afgebeeld met behulp van polariserende lichtmicroscopie. Het gebruik van deze techniek zal daarom het regeneratieve vermogen van spieren in zebravismodellen van spierziekte onthullen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Skeletspierregeneratie wordt aangedreven door obligate weefsel ingezetene spierstamcellen, waarvan de functie wordt gewijzigd bij veel spierziekten zoals spierdystrofie, waardoor het proces van spierregeneratie wordt belemmerd. Hier beschrijven we een protocol met hoge doorvoer om spierregeneratie te onderzoeken in levende zebravismodellen van spierziekte. De eerste stap van de pijpleiding maakt gebruik van een embryo genotypering platform14, dat is een gebruiksvriendelijke en nauwkeurige methode …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen Dr. Alex Fulcher en Monash Micro Imaging bedanken voor hulp bij het onderhoud en de installatie van microscopen. Het Australian Regenerative Medicine Institute wordt ondersteund door subsidies van de staatsregering van Victoria en de Australische regering. Dit werk werd gefinancierd door een projectsubsidie van de Muscular Dystrophy Association (USA) aan P.D.C (628882).
Materials
| 24 well plates | Thermo Fischer | 142475 | |
| 30 gauge needles | Terumo | NN-3013R | |
| 90 mm Petri Dishes | Pacific Laboratory Products PT | S9014S20 | |
| DNA extraction chips | wFluidx | ZEG chips | |
| Embryo genotyping platform | wFluidx | ZEG base unit | Zebrafish Embryo Genotyper |
| Glass pipette | Hirschmann | 9260101 | |
| Glass plate dish | WPI | FD35-100 | Commonly referred to as FluoroDish |
| Incubator | Thermoline Scientific | TEI-43L | |
| Plastic pipette | Livingstone | PTP03-01 | |
| Polarizing microscope | Abrio | N/A |
References
- Egan, B., Zierath, J. R. Exercise Metabolism and the Molecular Regulation of Skeletal Muscle Adaptation. Cell Metabolism. 17 (2), 162-184 (2013).
- Seale, P., Sabourin, L. A., Girgis-Gabardo, A., Mansouri, A., Gruss, P., Rudnicki, M. A. Pax7 is required for the specification of myogenic satellite cells. Cell. 102 (6), 777-786 (2000).
- Relaix, F., Rocancourt, D., Mansouri, A., Buckingham, M. A Pax3/Pax7-dependent population of skeletal muscle progenitor cells. Nature. 435 (7044), 948-953 (2005).
- Sousa-Victor, P., et al. Geriatric muscle stem cells switch reversible quiescence into senescence. Nature. 506 (7488), 316-321 (2014).
- Egerman, M. A., et al. GDF11 Increases with Age and Inhibits Skeletal Muscle Regeneration. Cell Metabolism. 22 (1), 164-174 (2015).
- Emery, A. E. The muscular dystrophies. The Lancet. 359 (9307), 687-695 (2002).
- Emery, A. E. H. . Duchenne muscular dystrophy. , (1993).
- Anne Helbling-Leclerc, P. G. Mutations in the laminin α2-chain gene (LAMA2) cause merosin-deficient congenital muscular dystrophy. Nature Genetics. (11), 216-218 (1995).
- Campbell, K. P. Three muscular dystrophies: loss of cytoskeleton-extracellular matrix linkage. Cell. 80 (5), 675-679 (1995).
- Cerletti, M., et al. Highly efficient, functional engraftment of skeletal muscle stem cells in dystrophic muscles. Cell. 134 (1), 37-47 (2008).
- Dumont, N. A., et al. Dystrophin expression in muscle stem cells regulates their polarity and asymmetric division. Nature Medicine. 21 (12), 1455-1463 (2015).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews. Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
- Gurevich, D. B., et al. Asymmetric division of clonal muscle stem cells coordinates muscle regeneration in vivo. Science. 353 (6295), (2016).
- Lambert, C. J., et al. An automated system for rapid cellular extraction from live zebrafish embryos and larvae: Development and application to genotyping. PloS One. 13 (3), 0193180 (2018).
- Berger, J., Sztal, T., Currie, P. D. Quantification of birefringence readily measures the level of muscle damage in zebrafish. Biochemical and Biophysical Research Communications. 423 (4), 785-788 (2012).
- Hall, T. E., et al. The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin alpha2-deficient congenital muscular dystrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (17), 7092-7097 (2007).
- Otten, C., et al. Xirp Proteins Mark Injured Skeletal Muscle in Zebrafish. PLOS ONE. 7 (2), 31041 (2012).
- Otten, C., Abdelilah-Seyfried, S. Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle. Journal of Visualized Experiments JoVE. (71), e4351 (2013).
- Nguyen, P. D., et al. Muscle Stem Cells Undergo Extensive Clonal Drift during Tissue Growth via Meox1-Mediated Induction of G2 Cell-Cycle Arrest. Cell Stem Cell. 21 (1), 107-119 (2017).
- Ruparelia, A. A., Ratnayake, D., Currie, P. D. Stem cells in skeletal muscle growth and regeneration in amniotes and teleosts: Emerging themes. Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 9 (2), 365 (2020).
