Undersøke muskelregenerering i sebrafiskmodeller av muskelsykdom
Summary
Skjelettmuskelregenerering er drevet av vev bosatt muskel stamceller, som er svekket i mange muskelsykdommer som muskeldystrofi, og dette resulterer i manglende evne til muskel å regenerere. Her beskriver vi en protokoll som tillater undersøkelse av muskelregenerering i sebrafiskmodeller av muskelsykdom.
Abstract
Skjelettmuskulaturen har en bemerkelsesverdig evne til å regenerere etter skade, som drives av obligatoriske vev bosatt muskel stamceller. Etter skade aktiveres muskelstammecellen og gjennomgår celleproliferasjon for å generere et basseng av myoblaster, som senere skiller seg ut for å danne nye muskelfibre. I mange muskelsløse forhold, inkludert muskeldystrofi og aldring, er denne prosessen svekket, noe som resulterer i manglende evne til muskel å regenerere. Prosessen med muskelregenerering i sebrafisk er høyt bevart med pattedyrsystemer som gir et utmerket system for å studere muskelstammecellefunksjon og regenerering, i muskelsvjerningsforhold som muskeldystrofi. Her presenterer vi en metode for å undersøke muskelregenerering i sebrafiskmodeller av muskelsykdom. Det første trinnet innebærer bruk av en genotypingsplattform som tillater bestemmelse av larvens genotype før det fremkaller en skade. Etter å ha bestemt genotypen, blir muskelen skadet ved hjelp av et nålestikk, hvoretter polariserende lysmikroskopi brukes til å bestemme omfanget av muskelregenerering. Vi gir derfor en høy gjennomstrømningsrørledning som gjør det mulig å undersøke muskelregenerering i sebrafiskmodeller av muskelsykdom.
Introduction
Skjelettmuskulatur står for 30-50% av kroppsmassen, og er ikke bare uunnværlig for bevegelse, men det fungerer også som et kritisk metabolsk og lagringsorgan1. Til tross for at den er postmitotisk, er skjelettmuskelen svært dynamisk og beholder en enorm regenerativ kapasitet etter skade. Dette tilskrives tilstedeværelsen av vev bosatt stamceller (også kalt satellittceller), plassert under basal lamina av myofibers og preget av transkripsjonsfaktorene parret boksprotein 7 (pax7) og / eller parret boksprotein 3 (pax3), blant annet2,3. Etter skade aktiveres satellittcellen og gjennomgår celleproliferasjon for å generere et basseng av myoblaster, som senere skiller seg ut for å danne nye muskelfibre. Den svært konserverte kaskaden av pro-regenerative signaler som regulerer satellittcelleaktivering og robust muskelreparasjon påvirkes under ulike forhold som myopatier og homeostatiskaldring 4,5.
En slik mangfoldig gruppe myopatier er muskeldystrofi, preget av progressiv muskels kaste bort og degenerasjon6. Disse sykdommene er konsekvensen av genetiske mutasjoner i viktige proteiner, inkludert dystrofin og laminin-α2 (LAMA2), ansvarlig for vedlegg av muskelfibre til den ekstracellulære matrisen7,8. Gitt at proteiner implisert i muskeldystrofi spiller en så sentral rolle i å opprettholde muskelstruktur, ble det i mange år antatt at en svikt i denne prosessen var mekanismen som var ansvarlig for sykdomspatogenese9. Nyere studier har imidlertid identifisert feil i reguleringen av muskelstammeceller og påfølgende svekkelse i muskelregenerering som andre mulige grunnlag for muskelpatologien observert i muskeldystrofi10,11. Som sådan er det nødvendig med ytterligere studier for å undersøke hvordan en svekkelse i muskel stamcellefunksjon og tilhørende nisjeelementer bidrar til muskeldystrofi.
I løpet av det siste tiåret har sebrafisk (Danio rerio) dukket opp som en viktig virveldyrmodell for sykdomsmodellering12. Dette tilskrives den raske eksterne utviklingen av sebrafiskembryoet, kombinert med sin optiske klarhet, noe som gjør det mulig direkte visualisering av muskeldannelse, vekst og funksjon. I tillegg er ikke bare utviklingen og strukturen av muskel høyt bevart i sebrafisk, de viser også en svært bevart prosess med muskelregenerering13. Følgelig representerer sebrafisk et utmerket system for å studere patobiologien til muskelsykdommer, og utforske hvordan muskelregenerering påvirkes i den. For dette formål har vi utviklet en metode som muliggjør rettidig studie av skjelettmuskulaturregenerering i sebrafiskmodeller av muskelsykdom. Denne rørledningen med høy gjennomstrømning innebærer en metode for å genotype levende embryoer14, hvoretter en nålstikkskade utføres og omfanget av muskelregenerering er avbildet ved hjelp av polariserende lysmikroskopi. Utnyttelsen av denne teknikken vil derfor avsløre den regenerative kapasiteten til muskler i sebrafiskmodeller av muskelsykdom.
Protocol
Representative Results
Discussion
Skjelettmuskelregenerering er drevet av obligatoriske vev bosatt muskel stamceller, hvis funksjon er endret i mange muskelsykdommer som muskeldystrofi, og deretter hindrer prosessen med muskelregenerering. Her beskriver vi en protokoll med høy gjennomstrømning for å undersøke muskelregenerering i levende sebrafiskmodeller av muskelsykdom. Det første trinnet i rørledningen bruker en embryo genotyping plattform14, som er en brukervennlig og nøyaktig metode for å bestemme genotypen av levende…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil takke Dr. Alex Fulcher og Monash Micro Imaging for hjelp med vedlikehold og oppsett av mikroskop. Australian Regenerative Medicine Institute støttes av tilskudd fra delstatsregjeringen i Victoria og den australske regjeringen. Dette arbeidet ble finansiert av et muskeldystrofiforening (USA) prosjektstipend til P.D.C (628882).
Materials
| 24 well plates | Thermo Fischer | 142475 | |
| 30 gauge needles | Terumo | NN-3013R | |
| 90 mm Petri Dishes | Pacific Laboratory Products PT | S9014S20 | |
| DNA extraction chips | wFluidx | ZEG chips | |
| Embryo genotyping platform | wFluidx | ZEG base unit | Zebrafish Embryo Genotyper |
| Glass pipette | Hirschmann | 9260101 | |
| Glass plate dish | WPI | FD35-100 | Commonly referred to as FluoroDish |
| Incubator | Thermoline Scientific | TEI-43L | |
| Plastic pipette | Livingstone | PTP03-01 | |
| Polarizing microscope | Abrio | N/A |
References
- Egan, B., Zierath, J. R. Exercise Metabolism and the Molecular Regulation of Skeletal Muscle Adaptation. Cell Metabolism. 17 (2), 162-184 (2013).
- Seale, P., Sabourin, L. A., Girgis-Gabardo, A., Mansouri, A., Gruss, P., Rudnicki, M. A. Pax7 is required for the specification of myogenic satellite cells. Cell. 102 (6), 777-786 (2000).
- Relaix, F., Rocancourt, D., Mansouri, A., Buckingham, M. A Pax3/Pax7-dependent population of skeletal muscle progenitor cells. Nature. 435 (7044), 948-953 (2005).
- Sousa-Victor, P., et al. Geriatric muscle stem cells switch reversible quiescence into senescence. Nature. 506 (7488), 316-321 (2014).
- Egerman, M. A., et al. GDF11 Increases with Age and Inhibits Skeletal Muscle Regeneration. Cell Metabolism. 22 (1), 164-174 (2015).
- Emery, A. E. The muscular dystrophies. The Lancet. 359 (9307), 687-695 (2002).
- Emery, A. E. H. . Duchenne muscular dystrophy. , (1993).
- Anne Helbling-Leclerc, P. G. Mutations in the laminin α2-chain gene (LAMA2) cause merosin-deficient congenital muscular dystrophy. Nature Genetics. (11), 216-218 (1995).
- Campbell, K. P. Three muscular dystrophies: loss of cytoskeleton-extracellular matrix linkage. Cell. 80 (5), 675-679 (1995).
- Cerletti, M., et al. Highly efficient, functional engraftment of skeletal muscle stem cells in dystrophic muscles. Cell. 134 (1), 37-47 (2008).
- Dumont, N. A., et al. Dystrophin expression in muscle stem cells regulates their polarity and asymmetric division. Nature Medicine. 21 (12), 1455-1463 (2015).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews. Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
- Gurevich, D. B., et al. Asymmetric division of clonal muscle stem cells coordinates muscle regeneration in vivo. Science. 353 (6295), (2016).
- Lambert, C. J., et al. An automated system for rapid cellular extraction from live zebrafish embryos and larvae: Development and application to genotyping. PloS One. 13 (3), 0193180 (2018).
- Berger, J., Sztal, T., Currie, P. D. Quantification of birefringence readily measures the level of muscle damage in zebrafish. Biochemical and Biophysical Research Communications. 423 (4), 785-788 (2012).
- Hall, T. E., et al. The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin alpha2-deficient congenital muscular dystrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (17), 7092-7097 (2007).
- Otten, C., et al. Xirp Proteins Mark Injured Skeletal Muscle in Zebrafish. PLOS ONE. 7 (2), 31041 (2012).
- Otten, C., Abdelilah-Seyfried, S. Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle. Journal of Visualized Experiments JoVE. (71), e4351 (2013).
- Nguyen, P. D., et al. Muscle Stem Cells Undergo Extensive Clonal Drift during Tissue Growth via Meox1-Mediated Induction of G2 Cell-Cycle Arrest. Cell Stem Cell. 21 (1), 107-119 (2017).
- Ruparelia, A. A., Ratnayake, D., Currie, P. D. Stem cells in skeletal muscle growth and regeneration in amniotes and teleosts: Emerging themes. Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 9 (2), 365 (2020).
