Patienten-abgeleitete Tumor-Explantate als "Live" präklinische Plattform zur Vorhersage von Arzneimittelresistenzen bei Patienten
Summary
Dieser Beitrag beschreibt Methoden zur Generierung, medikamentösen Behandlung und Analyse von patientenabgeleiteten Explantaten zur Beurteilung von Tumormedikamentenreaktionen in einem lebenden, patientenrelevanten, präklinischen Modellsystem.
Abstract
Das Verständnis der Arzneimittelresistenz und die Entwicklung neuartiger Strategien zur Sensibilisierung hochresistenter Krebsarten beruhen auf der Verfügbarkeit geeigneter präklinischer Modelle, die das Ansprechen der Patienten genau vorhersagen können. Einer der Nachteile bestehender präklinischer Modelle ist die Unfähigkeit, die menschliche Tumormikroumgebung (TME) kontextuell zu erhalten und die intratumorale Heterogenität genau darzustellen, wodurch die klinische Übersetzung von Daten eingeschränkt wird. Im Gegensatz dazu ermöglicht die PDE-Plattform (Patient Derived Explant) durch die Darstellung der Kultur lebender Fragmente menschlicher Tumoren die Untersuchung von Arzneimittelreaktionen in einem dreidimensionalen (3D) Kontext, der die pathologischen und architektonischen Merkmale der ursprünglichen Tumoren so genau wie möglich widerspiegelt. Frühere Berichte mit PDEs haben die Fähigkeit der Plattform dokumentiert, chemosensitive von chemoresistenten Tumoren zu unterscheiden, und es wurde gezeigt, dass diese Segregation prädiktiv für das Ansprechen von Patienten auf dieselben Chemotherapien ist. Gleichzeitig ermöglichen PDEs die Möglichkeit, molekulare, genetische und histologische Merkmale von Tumoren zu untersuchen, die Arzneimittelreaktionen vorhersagen, wodurch Biomarker für die Patientenstratifizierung sowie neuartige interventionelle Ansätze zur Sensibilisierung resistenter Tumore identifiziert werden. Dieses Papier berichtet ausführlich über die PDE-Methodik, von der Sammlung von Patientenproben bis hin zur Endpunktanalyse. Es enthält eine detaillierte Beschreibung der Explantatableitungs- und Kulturmethoden und hebt gegebenenfalls maßgeschneiderte Bedingungen für bestimmte Tumore hervor. Für die Endpunktanalyse liegt der Schwerpunkt auf der multiplexierten Immunfluoreszenz und der multispektralen Bildgebung für die räumliche Profilierung wichtiger Biomarker sowohl in tumoralen als auch in stromalen Regionen. Durch die Kombination dieser Methoden ist es möglich, quantitative und qualitative Drug-Response-Daten zu generieren, die mit verschiedenen klinisch-pathologischen Parametern in Beziehung gesetzt und somit potenziell für die Identifizierung von Biomarkern verwendet werden können.
Introduction
Die Entwicklung wirksamer und sicherer Krebsmedikamente erfordert geeignete präklinische Modelle, die auch Einblicke in Wirkmechanismen geben können, die die Identifizierung prädiktiver und pharmakodynamischer Biomarker erleichtern können. Es istbekannt,dass die inter- und intratumorische Heterogenität1,2,3,4,5 und die TME6,7,8,9,10,11 ,12 die Reaktionen auf Krebsmedikamente beeinflussen, und viele bestehende präklinische Krebsmodelle wie Zelllinien, Organoide und Mausmodelle sind nicht in der Lage, diese entscheidenden Funktionen. Ein “ideales” Modell ist eines, das die komplexen räumlichen Interaktionen von malignen mit nicht-malignen Zellen innerhalb von Tumoren rekapitulieren und die regionalen Unterschiede innerhalb von Tumoren widerspiegeln kann. Dieser Artikel konzentriert sich auf PDEs als eine aufstrebende Plattform, die viele dieser Anforderungen erfüllen kann13.
Das erste Beispiel für die Verwendung menschlicher PDEs, auch histokulturen genannt, stammt aus den späten 1980er Jahren, als Hoffman et al. Scheiben von frisch resezierten menschlichen Tumoren erzeugten und in einer Kollagenmatrixkultivierten 14,15. Dies beinhaltete die Etablierung eines 3D-Kultursystems, das die Gewebearchitektur bewahrte und die Aufrechterhaltung der Stromakomponenten und Zellinteraktionen innerhalb der TME sicherstellte. Ohne den ursprünglichen Tumor zu dekonstruieren, läuteten Hoffman et al.16 einen neuen Ansatz der translationalen Forschung ein, und seit dieser Zeit haben viele Gruppen verschiedene Explantatmethoden optimiert, mit dem Ziel, die Gewebeintegrität zu erhalten und genaue Arzneimittelreaktionsdaten zu generieren17,18,19,20,21,22,23,24 , obwohl einige Unterschiede zwischen den Protokollen offensichtlich sind. Butler et al. kultivierten Expflanzen in Gelatineschwämmen, um die Diffusion von Nährstoffen und Medikamenten durch die Probe20,21,25zu unterstützen, während Majumder et al. ein Tumorökosystem schufen, indem sie Explantaten auf einer Matrix kultivierten, die aus Tumor- und Stromalproteinen in Gegenwart von autologem Serum bestand, das vom selben Patienten stammt22, 23.
In jüngerer Zeit hat unsere Gruppe ein Protokoll aufgestellt, bei dem Explantaten durch Fragmentierung von Tumoren in 2 – 3 mm3-großeStücke erzeugt werden, die dann ohne zusätzliche Komponenten auf durchlässigen Membranen an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche eines Kultursystems platziert werden24. Zusammengenommen haben diese zahlreichen Studien gezeigt, dass PDEs die Kultur intakter, lebender Fragmente menschlicher Tumoren ermöglichen, die die räumliche Architektur und regionale Heterogenität der ursprünglichen Tumoren beibehalten. In ursprünglichen Experimenten wurden Explantaten oder Histokulturen in der Regel nach einer medikamentösen Behandlung einer Homogenisierung unterzogen, wonach verschiedene Lebensfähigkeitstests auf die homogenisierten Proben angewendet wurden, wie der Histokultur-Wirkstoff-Response-Assay20,21, der MTT-Assay (3-(6)-2,5-Diphenyltetrazoliumbromid), der Lactatdehydrogenase-Assay oder der Resazurin-basierte Assay26,27,28 . Jüngste Fortschritte bei den Techniken der Endpunktanalyse, insbesondere der digitalen Pathologie, haben nun das Repertoire an Endpunkttests und Assays erweitert, die an Explantaten durchgeführt werden können29,30. Um diese neuen Technologien anzuwenden, werden Explantate anstelle der Homogenisierung in Formalin fixiert, in Paraffin (FFPE) eingebettet und dann mit Immunfärbungstechniken analysiert, was eine räumliche Profilierung ermöglicht. Beispiele für diesen Ansatz wurden für nicht-kleinzelligen Lungenkrebs (NSCLC), Brustkrebs, Darmkrebs und Mesotheliom-Explantaten dokumentiert, wobei die immunhistochemische Färbung für den Proliferationsmarker Ki67 und den apoptotischen Marker, die gespaltene Poly-ADP-Ribose-Polymerase (cPARP), verwendet wurde, um Veränderungen in der Zellproliferation und im Zelltod zu überwachen24,31,32,33,34.
Die multiplexierte Immunfluoreszenz ist besonders geeignet für die räumliche Profilierung von Arzneimittelreaktionen in Explantaten am Endpunkt35. Beispielsweise ist es möglich, die Relokalisierung und räumliche Verteilung bestimmter Klassen von Immunzellen, wie Makrophagen oder T-Zellen, innerhalb der TME bei medikamentöser Behandlung13 , 36,37,38zumessen und zu untersuchen, ob einTherapeutikumden Übergang vom “kalten Tumor” zum “heißen Tumor” begünstigen kann39 . In den letzten Jahren hat sich diese Gruppe auf die Ableitung von PDEs aus verschiedenen Tumorarten (NSCLC, Nierenkrebs, Brustkrebs, Darmkrebs, Melanom) und die Erprobung einer Reihe von Krebsmedikamenten konzentriert, darunter Chemotherapien, niedermolekulare Inhibitoren und Immun-Checkpoint-Inhibitoren (ICIs). Endpunktanalysemethoden wurden optimiert, um die multiplexierte Immunfluoreszenz einzubeziehen, um eine räumliche Profilierung von Biomarkern für die Lebensfähigkeit sowie von Biomarkern für verschiedene Bestandteile der TME zu ermöglichen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieser Beitrag beschreibt die Methoden zur Erzeugung, medikamentösen Behandlung und Analyse von PDEs und beleuchtet die Vorteile der Plattform als präklinisches Modellsystem. Die Ex-vivo-Kultivierung eines frisch resezierten Tumors, die keine Dekonstruktion beinhaltet, ermöglicht die Beibehaltung der Tumorarchitektur13,24 und damit der räumlichen Wechselwirkungen zellulärer Komponenten in der TME sowie der intratumoralen Heterogenität. Diese Methode zeigt, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken den Chirurgen und Pathologen des University Hospitals of Leicester NHS Trust für die Bereitstellung von chirurgisch reseziertem Tumorgewebe. Wir danken auch der Histology-Einrichtung innerhalb von Core Biotechnology Services für die Hilfe bei der Gewebeverarbeitung und dem Schneiden von FFPE-Gewebeblöcken und Kees Straatman für die Unterstützung bei der Verwendung des Vectra Polaris. Diese Forschung wurde vom Explant Consortium unterstützt und finanziert, das aus vier Partnern besteht: der University of Leicester, der MRC Toxicology Unit, den Cancer Research UK Therapeutic Discovery Laboratories und LifeArc. Zusätzliche Unterstützung kam vom CRUK-NIHR Leicester Experimental Cancer Medicine Centre (C10604/A25151). Die Finanzierung für GM, CD und NA wurde durch das Catalyst-Programm von Breast Cancer Now (2017NOVPCC1066) bereitgestellt, das durch Eine Finanzierung von Pfizer unterstützt wird.
Materials
| Acetic acid | Sigma | 320099 | Staining reagent |
| Antibody Diluent / Block, 1x | Perkin Elmer | ARD1001EA | Antibody diluent/blocking buffer |
| Barnstead NANOpure Diamond | Barnstead | Ultra Pure (UP) H2O machine | |
| Citric Acid Monohydrate | Sigma-Aldrich | C7129 | Reagent for citrate buffer |
| Costar Multiple Well Cell Culture Plates | Corning Incorporated | 3516 | 6 multiwell plate |
| DAPI Dilactate | Life Technologies | D3571 | |
| 100 x 17 mm Dish, Nunclon Delta | ThermoFisher Scientific | 150350 | 100 mm diameter dish for tissue culture |
| DMEM (1x) Dubelcco's Modified Eagle Medium + 4.5 g/L D-Glucose + 110 mg/mL Sodium Pyruvate | Gibco (Life Technologies) | 10569-010 | Tissue culture medium (500 mL) |
| DPX mountant | VWR | 360294H | Mounting medium |
| DPX mountant | Merck | 6522 | Mounting medium |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 3609 | Reagent for TE buffer |
| Eosin | CellPath | RBC-0100-00A | Staining reagent |
| Foetal Bovine Serum | Gibco | 10500-064 | For use in tissue culture medium |
| 37% Formaldehyde | Fisher (Acros) | 119690010 | 10% Formalin |
| iGenix, microwave oven IG2095 | iGenix | IG2095 | Microwave used for antigen retreival |
| Industrial methylated spirit (IMS) | Genta Medical | 199050 | 99% Industrial Denatured Alcohol (IDA) |
| InForm Advanced Image Analysis Software | Akoya Biosciences | InForm | |
| Leica ASP3000 Tissue Processor | Leica Biosystems | Automated Vacuum Tissue Processor | |
| Leica Arcadia H and C | Leica Biosystems | Embedding wax bath | |
| Leica RM2125RT | Leica Biosystems | Rotary microtome | |
| Leica ST4040 Linear Stainer | Leica Biosystems | H&E stainer | |
| Mayer's Haematoxylin | Sigma | GHS132-1L | Staining reagent |
| Millicell Cell Culture Inserts, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Merck Milipore | PICMORG50 | Organotypic culture insert disc |
| Novolink Polymer Detection System | Leica Biosystems | RE7150-K | DAB staining kit |
| OPAL 480 | Akoya Biosciences | FP1500001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 520 | Akoya Biosciences | FP1487001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 570 | Akoya Biosciences | FP1488001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 620 | Akoya Biosciences | FP1495001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 650 | Akoya Biosciences | FP1496001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 690 | Akoya Biosciences | FP1497001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 780 / OPAL TSA-DIG Reagent | Akoya Biosciences | FP1501001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent and TSA-DIG reagent |
| Opal Polymer HRP Ms Plus Rb, 1x | Perkin Elmer | ARH1001EA | HRP polymer |
| Penicillin/streptomycin solution | Fisher Scientific | 11548876 | For use in tissue culture medium |
| PhenoChart Whole Slide Contextual Viewer | Akoya Biosciences | PhenoChart | Viewer software for scanned images |
| Phosphate Buffered Saline Tablets | Thermo Scientific Oxoid | BR0014G | PBS |
| 1x Plus Amplification Diluent | Perkin Elmer | FP1498 | Fluorophore diluent |
| Prolong Diamond Antifade Mountant | Invitrogen | P36961 | Mounting medium |
| Slide Carrier | Perkin Elmer | To load slides into Slide Carrier Hotel for scanning with Vectra Polaris | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S/3160/63 | 10% Formalin |
| Sodium Hydroxide pellets | Fisher Scientific | S/4920/53 | Reagent for citrate buffer |
| Tenatex Toughened Wax – Pink (500 g) | KEMDENT | 1-601 | Dental wax surface |
| Thermo Scientific Shandon Sequenza Slide Rack for Immunostaining Center | Fisher Scientific | 10098889 | Holder for slides and slide clips |
| Thermo Scientific Shandon Plastic Coverplates | Fisher Scientific | 11927774 | Slide clips |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Sigma-Aldrich | 252859 | Reagent for TE buffer |
| VectaShield | Vecta Laboratories | H-1000-10 | Mounting medium |
| Vectra Polaris Slide Scanner | Perkin Elmer | Vectra Polaris | Slide scanner |
| Xylene | Genta Medical | XYL050 | De-waxing agent |
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