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Abstract
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암 연구학

患者の薬剤耐性を予測するための「生きた」前臨床プラットフォームとしての患者由来腫瘍エクスプラント

Published: February 07, 2021
doi:
10.3791/62130
, , , , , , , , , , ,
1Leicester Cancer Research Center,University of Leicester, 2MRC Toxicology Unit

Summary

本論文では、患者に関連する生きた前臨床モデルシステムにおける腫瘍薬物反応を評価するための患者由来外植物の生成、薬物治療、分析の方法について説明する。

Abstract

薬剤耐性の理解と高耐性癌を感作するための新しい戦略の開発は、患者の応答を正確に予測できる適切な前臨床モデルの入手可能性に依存しています。既存の前臨床モデルの欠点の1つは、ヒト腫瘍微小環境(TME)を文脈的に保存し、腫瘍内不均一性を正確に表す能力ができないことであり、したがって、データの臨床翻訳を制限する。対照的に、ヒト腫瘍の生きた断片の培養を表すことによって、患者由来の外植(PDE)プラットフォームは、元の腫瘍の病理学的および構造的特徴を可能な限り密接に反映する3次元(3D)コンテキストで薬物応答を検査することを可能にする。PdEsを用いた以前の報告では、化学抵抗性腫瘍と化学感受性を区別するプラットフォームの能力が文書化されており、この分離は同じ化学療法に対する患者の応答を予測することが示されている。同時に、PEは、薬物応答を予測する腫瘍の分子、遺伝的、および組織学的特徴を問い合う機会を可能にし、それによって患者の階層化のためのバイオマーカーおよび耐性腫瘍を感作するための新しい介入アプローチを同定する。本論文では、患者サンプルの収集からエンドポイント分析まで、PDEの方法論を詳細に報告する。それは、必要に応じて、特定の腫瘍のオーダーメイド条件を強調し、外植派生と培養方法の詳細な説明を提供します。エンドポイント解析では、腫瘍領域と間質領域の両方で主要なバイオマーカーの空間プロファイリングを行う多重化免疫蛍光とマルチスペクトルイメージングに焦点を当てています。これらの方法を組み合わせることで、様々な臨床病理学的パラメータに関連し、バイオマーカー同定に使用される可能性のある定量的および定性的な薬物応答データを生成することができる。

Introduction

効果的で安全な抗癌剤の開発には、予測および薬力学的バイオマーカーの同定を促進できる作用機序に関する洞察を提供できる適切な前臨床モデルが必要です。腫瘍間ヘテロジニティー1、2、3、4、5、TME 6、7、8、9、10、11、12は抗癌剤反応に影響を与える知られており、細胞株、オルガノイド、マウスモデルなどの多くの既存の前臨床癌モデルは、これらの重要な重要な特性を十分に収容できない顔立ち。「理想的な」モデルは、腫瘍内の非悪性細胞との悪性細胞の複雑な空間相互作用を再現し、腫瘍内の地域差を反映することができるモデルです。この記事では、これらの要件の多くを満たすことができる新しいプラットフォームとして、PE に焦点を当てています13.

ヒトPDEの使用の最初の例は、組織培養とも呼ばれ、ホフマンらが切除したばかりのヒト腫瘍のスライスを生成し、コラーゲンマトリックス14、15で培養した1980年代後半にさかのぼる。これには、組織アーキテクチャを保存する3D培養システムを確立し、TME内の間質成分および細胞相互作用の維持を保証する。元の腫瘍を分解することなく、Hoffman et al.16は翻訳研究の新しいアプローチを告げ、この時以来、多くのグループは、組織の完全性を維持し、正確な薬物応答データ17、18、19、20、21、22、23、24を生成することを目的として、異なる外植法を最適化してきましたプロトコル間の違いは明らかですが、試験体らはゼラチンスポンジの外植を培養し、標本20、21、25を通して栄養素や薬物の拡散を助けるのに対し、Majumderらは同じ患者由来の自家血清の存在下で腫瘍および間質タンパク質で構成されるマトリックスの上に外植物を培養することによって腫瘍生態系を作り出した。 23.

さらに最近では、我々のグループは、2〜3mm3サイズの部分に腫瘍の断片化によって外植物を生成するプロトコルを設定し、培養システム24の空気液体界面で透過性膜に追加の成分を置かずに配置する。これらの多数の研究を組み合わせることで、PEは、元の腫瘍の空間的アーキテクチャと地域の不均一性を保持するヒト腫瘍の無傷の生きた断片の培養を可能にすることが実証されている。オリジナルの実験では、 外植または組織培養は、通常、薬物治療に従ってホモジナイゼーションを行い、その後、組織培養薬応答アッセイ20、21、MTT(3-(6)-2、5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイド)アッセイ、乳酸デヒドロゲン酵素アッセイ、またはレサズラジン-27ベースのサンプルに様々な生存率アッセイを適用した。.エンドポイント解析技術、特にデジタル病理の最近の進歩は、現在、外植29、30で行うことができるエンドポイントテストとアッセイのレパートリーを拡大しています。これらの新しい技術を応用するために、外植はホルマリンに固定され、パラフィン(FFPE)に埋め込まれ、免疫染色技術を用いて分析され、空間プロファイリングが可能になります。このアプローチの例は、非小細胞肺癌(NSCLC)、乳癌、大腸癌、および中皮腫外植物について文書化されており、それによって増殖マーカー、Ki67、およびアポトーシスマーカー、切断ポリADPリボーゼポリメラーゼ(cPARP)は、細胞増殖および死の変化を監視するために使用された。

多重化された免疫蛍光は、エンドポイント35での外植における薬物応答の空間プロファイリングに特に適している。例えば、薬物治療13、36、37、38のTME内で、マクロファージやT細胞などの特定のクラスの免疫細胞の再局在化と空間分布を測定し、治療剤が「冷たい腫瘍」から「ホット腫瘍」39への移行を支持できるかどうかを調べることができます。 .近年、このグループは、異なる腫瘍タイプ(NSCLC、腎癌、乳癌、大腸癌、黒色腫)からのPEの誘導と、化学療法、低分子阻害剤、免疫チェックポイント阻害剤(ICI)を含む様々な抗癌剤の試験に焦点を当てています。エンドポイント分析方法は、TMEの異なる構成要素のバイオマーカーと同様に、生存可能性のためのバイオマーカーの空間プロファイリングを可能にする多重化された免疫蛍光を含むように最適化されています。

Protocol

1. 組織の収集 手術後、切除されたばかりのヒト腫瘍標本を、25mLの新鮮な培養培地(4.5 g/LグルコースおよびL-グルタミン+1%(v/v)胎児の子牛血清+1%ペニシリン-レンサマイシンを添加した改変イーグル培地を含むチューブに移し、氷の上に貯蔵する。無菌クラスIIフードで手術の2時間以内に外植を処理します。 2. Explant製剤 <ol…

Representative Results

mIF染色された組織学的切片のマルチスペクトルイメージングにより、個々の細胞集団の同定とフェノタイピング、および外植TMEにおける腫瘍および間質成分の同定が可能である(図2)。マルチスペクトルイメージングは、自己蛍光シグナルを他のシグナルからデコンボルテージし、その後の分析から除外することができるため、コラーゲン含有量の高い組織など、高い内?…

Discussion

本論文では、PEの生成、薬物治療、分析の方法を説明し、前臨床モデルシステムとしてのプラットフォームの利点を強調する。その脱構築を伴わない切除された腫瘍のex vivo培養は、腫瘍アーキテクチャ13、24、したがって、TMEにおける細胞成分の空間的相互作用ならびに腫瘍内不均一性の保持を可能にする。この方法は、腫瘍特異的マーカーを用い?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

私たちは、外科的切除腫瘍組織を提供してくれたレスターNHSトラスト大学病院の外科医と病理学者に感謝します。我々はまた、Vectra Polarisを使用したサポートのためのFFPE組織ブロックとキース・ストラートマンの組織処理および切除に関する支援をコアバイオテクノロジーサービス内の組織学施設に感謝します。この研究は、レスター大学、MRC毒物学ユニット、がん研究英国治療発見研究所、LifeArcの4つのパートナーで構成されるExplantコンソーシアムによって支援され、資金提供されました。CRUK-NIHRレスター実験がん医学センター(C10604/A25151)による追加サポートが提供されました。GM、CD、NAの資金は、ファイザーからの資金提供によって支援されている乳がんナウの触媒プログラム(2017NOVPCC1066)によって提供されました。

Materials

Acetic acid Sigma 320099 Staining reagent
Antibody Diluent / Block, 1x Perkin Elmer ARD1001EA Antibody diluent/blocking buffer
Barnstead NANOpure Diamond Barnstead Ultra Pure (UP) H2O machine
Citric Acid Monohydrate Sigma-Aldrich C7129 Reagent for citrate buffer
Costar Multiple Well Cell Culture Plates Corning Incorporated 3516 6 multiwell plate
DAPI Dilactate Life Technologies D3571
100 x 17 mm Dish, Nunclon Delta ThermoFisher Scientific 150350 100 mm diameter dish for tissue culture
DMEM (1x) Dubelcco's Modified Eagle Medium + 4.5 g/L D-Glucose + 110 mg/mL Sodium Pyruvate Gibco (Life Technologies) 10569-010 Tissue culture medium (500 mL)
DPX mountant VWR 360294H Mounting medium
DPX mountant Merck 6522 Mounting medium
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich 3609 Reagent for TE buffer
Eosin CellPath RBC-0100-00A Staining reagent
Foetal Bovine Serum Gibco 10500-064 For use in tissue culture medium
37% Formaldehyde Fisher (Acros) 119690010 10% Formalin
iGenix, microwave oven IG2095 iGenix IG2095 Microwave used for antigen retreival
Industrial methylated spirit (IMS) Genta Medical 199050 99% Industrial Denatured Alcohol (IDA)
InForm Advanced Image Analysis Software Akoya Biosciences InForm
Leica ASP3000 Tissue Processor Leica Biosystems Automated Vacuum Tissue Processor
Leica Arcadia H and C Leica Biosystems Embedding wax bath
Leica RM2125RT Leica Biosystems Rotary microtome
Leica ST4040 Linear Stainer Leica Biosystems H&E stainer
Mayer's Haematoxylin Sigma GHS132-1L Staining reagent
Millicell Cell Culture Inserts, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm Merck Milipore PICMORG50 Organotypic culture insert disc
Novolink Polymer Detection System Leica Biosystems RE7150-K DAB staining kit
OPAL 480 Akoya Biosciences FP1500001KT Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent
OPAL 520 Akoya Biosciences FP1487001KT Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent
OPAL 570 Akoya Biosciences FP1488001KT Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent
OPAL 620 Akoya Biosciences FP1495001KT Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent
OPAL 650 Akoya Biosciences FP1496001KT Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent
OPAL 690 Akoya Biosciences FP1497001KT Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent
OPAL 780 / OPAL TSA-DIG Reagent Akoya Biosciences FP1501001KT Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent and TSA-DIG reagent
Opal Polymer HRP Ms Plus Rb, 1x Perkin Elmer ARH1001EA HRP polymer
Penicillin/streptomycin solution Fisher Scientific 11548876 For use in tissue culture medium
PhenoChart Whole Slide Contextual Viewer Akoya Biosciences PhenoChart Viewer software for scanned images
Phosphate Buffered Saline Tablets Thermo Scientific Oxoid BR0014G PBS
1x Plus Amplification Diluent Perkin Elmer FP1498 Fluorophore diluent
Prolong Diamond Antifade Mountant Invitrogen P36961 Mounting medium
Slide Carrier Perkin Elmer To load slides into Slide Carrier Hotel for scanning with Vectra Polaris
Sodium Chloride Fisher Scientific S/3160/63 10% Formalin
Sodium Hydroxide pellets Fisher Scientific S/4920/53 Reagent for citrate buffer
Tenatex Toughened Wax – Pink (500 g) KEMDENT 1-601 Dental wax surface
Thermo Scientific Shandon Sequenza Slide Rack for Immunostaining Center Fisher Scientific 10098889 Holder for slides and slide clips
Thermo Scientific Shandon Plastic Coverplates Fisher Scientific 11927774 Slide clips
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) Sigma-Aldrich 252859 Reagent for TE buffer
VectaShield Vecta Laboratories H-1000-10 Mounting medium
Vectra Polaris Slide Scanner Perkin Elmer Vectra Polaris Slide scanner
Xylene Genta Medical XYL050 De-waxing agent
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