JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
암 연구학

Экспланты опухолей, полученные от пациентов, как «живая» доклиническая платформа для прогнозирования лекарственной устойчивости у пациентов

Published: February 07, 2021
doi:
10.3791/62130
, , , , , , , , , , ,
1Leicester Cancer Research Center,University of Leicester, 2MRC Toxicology Unit

Summary

В этой статье описываются методы генерации, медикаментозного лечения и анализа эксплантов, полученных от пациента, для оценки реакций на лекарства от опухоли в живой, соответствующей пациенту, доклинической модельной системе.

Abstract

Понимание лекарственной устойчивости и разработка новых стратегий сенсибилизации высокорезистентных видов рака зависят от наличия подходящих доклинических моделей, которые могут точно прогнозировать реакцию пациентов. Одним из недостатков существующих доклинических моделей является невозможность контекстуально сохранить микроокружение опухоли человека (TME) и точно представить внутриопухолевую гетерогенность, тем самым ограничивая клиническую трансляцию данных. Напротив, представляя культуру живых фрагментов опухолей человека, платформа эксплантата, полученная от пациента (ФДЭ), позволяет исследовать лекарственные реакции в трехмерном (3D) контексте, который максимально точно отражает патологические и архитектурные особенности исходных опухолей. Предыдущие отчеты с ФДЭ документировали способность платформы отличать хемочувствительные опухоли от хеморезистентных, и было показано, что эта сегрегация является прогностической реакцией пациентов на одну и ту же химиотерапию. Одновременно ФДЭ позволяют исследовать молекулярные, генетические и гистологические особенности опухолей, которые предсказывают реакции на лекарства, тем самым выявляя биомаркеры для стратификации пациентов, а также новые интервенционные подходы к сенсибилизации резистентных опухолей. В этом документе подробно описывается методология ФДЭ, от сбора образцов пациентов до анализа конечных точек. В нем приводится подробное описание методов экстраплантного получения и культивирования, выделяя индивидуальные условия для конкретных опухолей, где это уместно. Для анализа конечных точек основное внимание уделяется мультиплексированной иммунофлуоресценции и мультиспектральной визуализации для пространственного профилирования ключевых биомаркеров как в опухолевых, так и в стромальных областях. Комбинируя эти методы, можно генерировать количественные и качественные данные о лекарственном ответе, которые могут быть связаны с различными клинико-патологическими параметрами и, таким образом, потенциально могут быть использованы для идентификации биомаркеров.

Introduction

Разработка эффективных и безопасных противоопухолевых агентов требует соответствующих доклинических моделей, которые также могут дать представление о механизмах действия, которые могут облегчить идентификацию прогностических и фармакодинамических биомаркеров. Известно, что меж- и внутриопухолевая гетерогенность1,2,3,4,5 и TME6,7,8,9,10,11,12 влияют на реакции на противоопухолевые препараты, и многие существующие доклинические модели рака, такие как клеточные линии, органоиды и мышиные модели, не способны полностью приспособиться к этим критическим Функции. «Идеальная» модель — это модель, которая может повторять сложные пространственные взаимодействия злокачественных и незлокачественных клеток в опухолях, а также отражать региональные различия в опухолях. В этой статье основное внимание уделяется PDE как новой платформе, которая может выполнять многие из этих требований13.

Первый пример использования ФДЭ человека, также известный как гистокультуры, относится к концу 1980-х годов, когда Hoffman et al. генерировали срезы свежерезецированных опухолей человека и культивировали их в коллагеновой матрице14,15. Это включало в себя создание системы 3D-культур, которая сохраняла архитектуру тканей, обеспечивая поддержание стромальных компонентов и клеточных взаимодействий в TME. Не деконструируя исходную опухоль, Hoffman et al.16 провозгласили новый подход к трансляционным исследованиям, и с этого времени многие группы оптимизировали различные методы экспланта с целью сохранения целостности тканей и получения точных данных о лекарственном ответе17,18,19,20,21,22,23,24 , хотя некоторые различия между протоколами очевидны. Butler et al. культивировали экспланты в желатиновых губках, чтобы помочь диффузии питательных веществ и лекарств через образец20,21,25,тогда как Majumder et al. создали опухолевую экосистему путем культивирования эксплантов поверх матрицы, состоящей из опухолевых и стромальных белков в присутствии аутологичной сыворотки, полученной от того же пациента22, 23г.

Совсем недавно наша группа установила протокол, в соответствии с которым экспланты генерируются путем фрагментации опухолей на кусочки размером 2 – 3 мм3,которые затем помещаются без дополнительных компонентов на проницаемые мембраны на воздушно-жидкостном интерфейсе культуральной системы24. Взятые вместе, эти многочисленные исследования продемонстрировали, что ФДЭ позволяют культивировать неповрежденные, живые фрагменты опухолей человека, которые сохраняют пространственную архитектуру и региональную гетерогенность исходных опухолей. В оригинальных экспериментах экспланты или гистокультуры обычно подвергали гомогенизации после медикаментозной обработки, после чего к гомогенизированным образцам применяли различные анализы жизнеспособности, такие как анализ реакции на гистокультурные лекарственные средства20,21,анализ МТТ (3-(6)-2,5-дифенилтетразолия бромида), анализ лактатдегидрогеназы или анализ на основе ресазурина26,27,28 . Недавний прогресс в методах анализа конечных точек, особенно цифровой патологии, теперь расширил репертуар тестов и анализов конечных точек, которые могут быть выполнены на эксплантатах29,30. Чтобы применить эти новые технологии, вместо гомогенизации экспланты фиксируются в формалине, встраиваются в парафин (FFPE), а затем анализируются с использованием методов иммуноокрашения, что позволяет пространственное профилирование. Примеры этого подхода были задокументированы для немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ), рака молочной железы, колоректального рака и эксплантов мезотелиомы, при этом иммуногистохимическое окрашивание для маркера пролиферации Ki67 и апоптотического маркера, расщепленной поли-АДФ рибозной полимеразы (cPARP), использовалось для мониторинга изменений в пролиферации клеток и гибели клеток24,31,32,33,34.

Мультиплексированная иммунофлуоресценция особенно поддается пространственному профилированию ответов на лекарственные средства в эксплантатах в конечной точке35. Например, можно измерить релокализацию и пространственное распределение специфических классов иммунных клеток, таких как макрофаги или Т-клетки, в пределах ТМЭ при медикаментозномлечении 13,36,37,38и исследовать, может ли терапевтический агент способствовать переходу от «холодной опухоли» к «горячей опухоли»39. . В последние годы эта группа сосредоточилась на получении ФДЭ из различных типов опухолей (НМРЛ, рак почек, рак молочной железы, колоректальный рак, меланома) и тестировании ряда противоопухолевых агентов, включая химиотерапию, ингибиторы малых молекул и ингибиторы иммунных контрольных точек (ИКИ). Методы анализа конечных точек были оптимизированы для включения мультиплексированной иммунофлуоресценции, чтобы обеспечить пространственное профилирование биомаркеров для жизнеспособности, а также биомаркеров для различных компонентов TME.

Protocol

1. Сбор тканей После операции перенесите свежерезецированные образцы опухоли человека в трубку, содержащую 25 мл свежей питательной среды (модифицированная среда Eagle от Dulbecco, дополненная 4,5 г / л глюкозы и L-глутамина + 1% (v / v) сыворотки для телят плода + 1% пенициллина-стрептом?…

Representative Results

Мультиспектральная визуализация гистологических срезов, окрашенных mIF, позволяет идентифицировать и фенотипировать отдельные клеточные популяции и идентифицировать опухолевые и стромальные компоненты в эксплантном TME(рисунок 2). Мультиспектральная визуализация осо?…

Discussion

В данной работе описываются методы генерации, медикаментозного лечения и анализа ФДЭ и подчеркиваются преимущества платформы как доклинической модельной системы. Культивирование ex vivo свежерезецированной опухоли, которое не предполагает ее деконструкции, позволяет сохранить архите?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим хирургов и патологоанатомов в университетских больницах Лестера NHS Trust за предоставление хирургической резецированной опухолевой ткани. Мы также благодарим гистологический центр в рамках Core Biotechnology Services за помощь в обработке тканей и секционировании тканевых блоков FFPE и Kees Straatman за поддержку с использованием Vectra Polaris. Это исследование было поддержано и профинансировано консорциумом Explant, состоящим из четырех партнеров: Университета Лестера, Токсикологического подразделения MRC, Лаборатории терапевтических открытий Рака Великобритании и LifeArc. Дополнительную поддержку оказал Центр экспериментальной онкологической медицины CRUK-NIHR Leicester (C10604/A25151). Финансирование GM, CD и NA было предоставлено программой Breast Cancer Now’s Catalyst Program (2017NOVPCC1066), которая поддерживается финансированием Pfizer.

Materials

Acetic acid Sigma 320099 Staining reagent
Antibody Diluent / Block, 1x Perkin Elmer ARD1001EA Antibody diluent/blocking buffer
Barnstead NANOpure Diamond Barnstead Ultra Pure (UP) H2O machine
Citric Acid Monohydrate Sigma-Aldrich C7129 Reagent for citrate buffer
Costar Multiple Well Cell Culture Plates Corning Incorporated 3516 6 multiwell plate
DAPI Dilactate Life Technologies D3571
100 x 17 mm Dish, Nunclon Delta ThermoFisher Scientific 150350 100 mm diameter dish for tissue culture
DMEM (1x) Dubelcco's Modified Eagle Medium + 4.5 g/L D-Glucose + 110 mg/mL Sodium Pyruvate Gibco (Life Technologies) 10569-010 Tissue culture medium (500 mL)
DPX mountant VWR 360294H Mounting medium
DPX mountant Merck 6522 Mounting medium
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich 3609 Reagent for TE buffer
Eosin CellPath RBC-0100-00A Staining reagent
Foetal Bovine Serum Gibco 10500-064 For use in tissue culture medium
37% Formaldehyde Fisher (Acros) 119690010 10% Formalin
iGenix, microwave oven IG2095 iGenix IG2095 Microwave used for antigen retreival
Industrial methylated spirit (IMS) Genta Medical 199050 99% Industrial Denatured Alcohol (IDA)
InForm Advanced Image Analysis Software Akoya Biosciences InForm
Leica ASP3000 Tissue Processor Leica Biosystems Automated Vacuum Tissue Processor
Leica Arcadia H and C Leica Biosystems Embedding wax bath
Leica RM2125RT Leica Biosystems Rotary microtome
Leica ST4040 Linear Stainer Leica Biosystems H&E stainer
Mayer's Haematoxylin Sigma GHS132-1L Staining reagent
Millicell Cell Culture Inserts, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm Merck Milipore PICMORG50 Organotypic culture insert disc
Novolink Polymer Detection System Leica Biosystems RE7150-K DAB staining kit
OPAL 480 Akoya Biosciences FP1500001KT Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent
OPAL 520 Akoya Biosciences FP1487001KT Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent
OPAL 570 Akoya Biosciences FP1488001KT Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent
OPAL 620 Akoya Biosciences FP1495001KT Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent
OPAL 650 Akoya Biosciences FP1496001KT Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent
OPAL 690 Akoya Biosciences FP1497001KT Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent
OPAL 780 / OPAL TSA-DIG Reagent Akoya Biosciences FP1501001KT Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent and TSA-DIG reagent
Opal Polymer HRP Ms Plus Rb, 1x Perkin Elmer ARH1001EA HRP polymer
Penicillin/streptomycin solution Fisher Scientific 11548876 For use in tissue culture medium
PhenoChart Whole Slide Contextual Viewer Akoya Biosciences PhenoChart Viewer software for scanned images
Phosphate Buffered Saline Tablets Thermo Scientific Oxoid BR0014G PBS
1x Plus Amplification Diluent Perkin Elmer FP1498 Fluorophore diluent
Prolong Diamond Antifade Mountant Invitrogen P36961 Mounting medium
Slide Carrier Perkin Elmer To load slides into Slide Carrier Hotel for scanning with Vectra Polaris
Sodium Chloride Fisher Scientific S/3160/63 10% Formalin
Sodium Hydroxide pellets Fisher Scientific S/4920/53 Reagent for citrate buffer
Tenatex Toughened Wax – Pink (500 g) KEMDENT 1-601 Dental wax surface
Thermo Scientific Shandon Sequenza Slide Rack for Immunostaining Center Fisher Scientific 10098889 Holder for slides and slide clips
Thermo Scientific Shandon Plastic Coverplates Fisher Scientific 11927774 Slide clips
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) Sigma-Aldrich 252859 Reagent for TE buffer
VectaShield Vecta Laboratories H-1000-10 Mounting medium
Vectra Polaris Slide Scanner Perkin Elmer Vectra Polaris Slide scanner
Xylene Genta Medical XYL050 De-waxing agent
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gerlinger, M., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. The New England Journal of Medicine. 366 (10), 883-892 (2012).
  2. Jamal-Hanjani, M., et al. Tracking the evolution of non-small-cell lung cancer. The New England Journal of Medicine. 376 (22), 2109-2121 (2017).
  3. McGranahan, N., Swanton, C. Biological and therapeutic impact of intratumor heterogeneity in cancer evolution. Cancer Cell. 27 (1), 15-26 (2015).
  4. Casey, T., et al. Molecular signatures suggest a major role for stromal cells in development of invasive breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment. 114 (1), 47-62 (2009).
  5. Gerdes, M. J., et al. Emerging understanding of multiscale tumor heterogeneity. Frontiers in Oncology. 4, 366 (2014).
  6. Komohara, Y., Takeya, M. CAFs and TAMs: maestros of the tumour microenvironment. The Journal of Pathology. 241 (3), 313-315 (2017).
  7. Miyake, M., et al. CXCL1-mediated interaction of cancer cells with tumor-associated macrophages and cancer-associated fibroblasts promotes tumor progression in human bladder cancer. Neoplasia. 18 (10), 636-646 (2016).
  8. Hisamitsu, S., et al. Interaction between cancer cells and cancer-associated fibroblasts after cisplatin treatment promotes cancer cell regrowth. Human Cell. 32 (4), 453-464 (2019).
  9. Witz, I. P. The tumor microenvironment: the making of a paradigm. Cancer Microenvironment. 2, 9-17 (2009).
  10. Fu, X. T., et al. Tumor-associated macrophages modulate resistance to oxaliplatin via inducing autophagy in hepatocellular carcinoma. Cancer Cell International. 19, 71 (2019).
  11. Chen, D., Zhang, X. Tipping tumor microenvironment against drug resistance. Journal of Oncology Translational Research. 1 (1), 106 (2015).
  12. Roma-Rodrigues, C., Mendes, R., Baptista, P. V., Fernandes, A. R. Targeting tumor microenvironment for cancer therapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (4), 840 (2019).
  13. Powley, I. R., et al. Patient-derived explants (PDEs) as a powerful preclinical platform for anti-cancer drug and biomarker discovery. British Journal of Cancer. 122 (6), 735-744 (2020).
  14. Freeman, A. E., Hoffman, R. M. In vivo-like growth of human tumors in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 83 (8), 2694-2698 (1986).
  15. Vescio, R., et al. A. al. In vivo-like drug responses of human tumors growing in three-dimensional gel-supported primary culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 84 (14), 5029-5033 (1987).
  16. Hoffman, R. M. 3D Sponge-matrix histoculture: an overview. Methods in Molecular Biology. 1760, 11-17 (2018).
  17. Vescio, R. A., Connors, K. M., Kubota, T., Hoffman, R. M. Correlation of histology and drug response of human tumors grown in native-state three-dimensional histoculture and in nude mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 88 (12), 5163-5166 (1991).
  18. Furukawa, T., Kubota, T., Hoffman, R. M. Clinical applications of the histoculture drug response assay. Clinical Cancer Research. 1 (3), 305-311 (1995).
  19. Centenera, M. M., Raj, G. V., Knudsen, K. E., Tilley, W. D., Butler, L. M. Ex vivo culture of human prostate tissue and drug development. Nature Reviews Urology. 10 (8), 483-487 (2013).
  20. Centenera, M. M., et al. Evidence for efficacy of new Hsp90 inhibitors revealed by ex vivo culture of human prostate tumors. Clinical Cancer Research. 18 (13), 3562-3570 (2012).
  21. Dean, J. L., et al. Therapeutic response to CDK4/6 inhibition in breast cancer defined by ex vivo analyses of human tumors. Cell Cycle. 11 (14), 2756-2761 (2012).
  22. Majumder, B., et al. Predicting clinical response to anticancer drugs using an ex vivo platform that captures tumour heterogeneity. Nature Communications. 6, 6169 (2015).
  23. Goldman, A., et al. Temporally sequenced anticancer drugs overcome adaptive resistance by targeting a vulnerable chemotherapy-induced phenotypic transition. Nature Communications. 6, 6139 (2015).
  24. Karekla, E., et al. Ex vivo explant cultures of non-small cell lung carcinoma enable evaluation of primary tumor responses to anticancer therapy. 암 연구학. 77 (8), 2029-2039 (2017).
  25. Ricciardelli, C., et al. Novel ex vivo ovarian cancer tissue explant assay for prediction of chemosensitivity and response to novel therapeutics. Cancer Letters. 421, 51-58 (2018).
  26. Yoshimasu, T., et al. Histoculture drug response assay (HDRA) guided induction concurrent chemoradiotherapy for mediastinal node-positive non-small cell lung cancer. Gan To Kagaku Ryoho. Cancer and chemotherapy. 30 (2), 231-235 (2003).
  27. Pirnia, F., et al. Ex vivo assessment of chemotherapy-induced apoptosis and associated molecular changes in patient tumor samples. Anticancer Research. 26, 1765-1772 (2006).
  28. Maund, S. L., Nolley, R., Peehl, D. M. Optimization and comprehensive characterization of a faithful tissue culture model of the benign and malignant human prostate. Laboratory Investigation. 94 (2), 208-221 (2014).
  29. Vasaturo, A., Galon, J. Multiplexed immunohistochemistry for immune cell phenotyping, quantification and spatial distribution in situ. Methods in Enzymology. 635, 51-66 (2020).
  30. Fuhrman, K., et al. Molecularly guided digital spatial profiling for multiplexed analysis of gene expression with spatial and single cell resolution. Journal of Biomolecular Techniques. 31, 14-15 (2020).
  31. Twiddy, D., et al. A TRAIL-R1-specific ligand in combination with doxorubicin selectively targets primary breast tumour cells for apoptosis. Breast Cancer Research. 12 (1), 58 (2010).
  32. Cai, H., et al. Cancer chemoprevention: Evidence of a nonlinear dose response for the protective effects of resveratrol in humans and mice. Science Translational Medicine. 7 (298), (2015).
  33. Busacca, S., et al. Resistance to HSP90 inhibition involving loss of MCL1 addiction. Oncogene. 35 (12), 1483-1492 (2016).
  34. Kolluri, K. K., et al. Loss of functional BAP1 augments sensitivity to TRAIL in cancer cells. Elife. 7, 30224 (2018).
  35. Toki, M. I., et al. High-plex predictive marker discovery for melanoma immunotherapy-treated patients using digital spatial profiling. Clinical Cancer Research. 25 (18), 5503-5512 (2019).
  36. Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
  37. Park, I. J., et al. Prediction of radio-responsiveness with immune-profiling in patients with rectal cancer. Oncotarget. 8 (45), 79793-79802 (2017).
  38. Mezheyeuski, A., et al. Multispectral imaging for quantitative and compartment-specific immune infiltrates reveals distinct immune profiles that classify lung cancer patients. The Journal of Pathology. 244 (4), 421-431 (2018).
  39. Kather, J. N., et al. Topography of cancer-associated immune cells in human solid tumors. Elife. 7, 36967 (2018).
  40. Zollinger, D. R., Lingle, S. E., Sorg, K., Beechem, J. M., Merritt, C. R. GeoMx™ RNA assay: high multiplex, digital, spatial analysis of RNA in FFPE tissue. Methods in Molecular Biology. 2148, 331-345 (2020).
  41. Zugazagoitia, J., et al. Biomarkers associated with beneficial PD-1 checkpoint blockade in non-small cell lung cancer (NSCLC) identified using high-plex digital spatial profiling. Clinical Cancer Research. 26 (16), 4360-4368 (2020).
  42. Allo, B., Lou, X., Bouzekri, A., Ornatsky, O. Clickable and high-sensitivity metal-containing tags for mass cytometry. Bioconjugate Chemistry. 29 (6), 2028-2038 (2018).
  43. Gerdtsson, E., et al. Multiplex protein detection on circulating tumor cells from liquid biopsies using imaging mass cytometry. Convergent Science Physical Oncology. 4 (1), 015002 (2018).
  44. Reck, M., et al. Pembrolizumab versus chemotherapy for PD-L1-positive non-small-cell lung cancer. The New England Journal of Medicine. 375 (19), 1823-1833 (2016).
  45. Le, D. T., et al. KEYNOTE-164: Phase 2 study of pembrolizumab for patients with previously treated, microsatellite instability-high advanced colorectal carcinoma. Journal of Clinical Oncology. 34, 3631 (2016).
  46. Diaz, L. A., et al. KEYNOTE-177: Randomized phase III study of pembrolizumab versus investigator-choice chemotherapy for mismatch repair-deficient or microsatellite instability-high metastatic colorectal carcinoma. Journal of Clinical Oncology. 35, 815 (2017).
  47. Long, G. V., et al. Impact of baseline serum lactate dehydrogenase concentration on the efficacy of pembrolizumab and ipilimumab in patients with advanced melanoma: data from KEYNOTE-006. European Journal of Cancer. 72, 122-123 (2017).
  48. Voong, K. R., Feliciano, J., Becker, D., Levy, B. Beyond PD-L1 testing-emerging biomarkers for immunotherapy in non-small cell lung cancer. Annals of Translational Medicine. 5 (18), 376 (2017).

Tags

Keywords: Patient-derived Tumor ExplantsPreclinical PlatformDrug Resistance Prediction3D Tumor ContextDrug ResponseDrug MetabolismPharmacodynamic BiomarkersOrganotypic CultureDrug TreatmentFormalin FixationHistological Processing
check_url/kr/62130?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Viticchié, G., Powley, I., Demetriou, C., Cooper, J., Butterworth, M., Patel, M., Abid, N., Miles, G., Howells, L., Pringle, H., MacFarlane, M., Pritchard, C. Patient-Derived Tumor Explants As a “Live” Preclinical Platform for Predicting Drug Resistance in Patients. J. Vis. Exp. (168), e62130, doi:10.3791/62130 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image