Gestion avancée du rythme cardiaque par application d’une photostimulation optogénétique multisite dans les cœurs murins
Summary
Ce travail rapporte une méthode pour contrôler le rythme cardiaque de cœurs murins intacts de souris transgéniques channelrhodopsin-2 (ChR2) en utilisant la photostimulation locale avec un réseau micro-LED et la cartographie optique simultanée du potentiel de membrane épicardique.
Abstract
Les tachyarythmies ventriculaires sont une cause majeure de mortalité et de morbidité dans le monde. La défibrillation électrique utilisant des chocs électriques à haute énergie est actuellement le seul traitement de la fibrillation ventriculaire potentiellement mortelle. Cependant, la défibrillation peut avoir des effets secondaires, y compris une douleur intolérable, des lésions tissulaires et une aggravation du pronostic, indiquant un besoin médical important pour le développement de stratégies de gestion du rythme cardiaque plus douces. Outre les approches électriques réductrices d’énergie, l’optogénétique cardiaque a été introduite comme un outil puissant pour influencer l’activité cardiaque en utilisant des canaux ioniques membranaires sensibles à la lumière et des impulsions lumineuses. Dans la présente étude, une méthode robuste et valide pour une photostimulation réussie de cœurs murins intacts perfusés de Langendorff sera décrite sur la base d’une stimulation multisite appliquant un réseau 3 x 3 de microdiodes électroluminescentes (micro-LED). La cartographie optique simultanée des ondes de tension de la membrane épicardique permet d’étudier les effets de la stimulation spécifique à la région et d’évaluer l’activité cardiaque nouvellement induite directement sur place. Les résultats obtenus montrent que l’efficacité de la défibrillation dépend fortement des paramètres choisis pour la photostimulation lors d’une arythmie cardiaque. Il sera démontré que la zone éclairée du cœur joue un rôle crucial pour le succès de l’arrêt ainsi que la façon dont le contrôle ciblé de l’activité cardiaque pendant l’éclairage pour modifier les schémas d’arythmie peut être atteint. En résumé, cette technique offre la possibilité d’optimiser la manipulation du mécanisme sur site sur la voie du contrôle en retour en temps réel du rythme cardiaque et, en ce qui concerne la spécificité de la région, de nouvelles approches pour réduire les dommages potentiels au système cardiaque par rapport à l’utilisation d’applications de choc électrique non spécifiques.
Introduction
Les premières recherches sur la dynamique spatio-temporelle au cours de l’arythmie ont révélé que les schémas électriques complexes au cours de la fibrillation cardiaque sont entraînés par des ondes d’excitation rotatives de type vortex1. Cette découverte a donné de nouvelles informations sur les mécanismes sous-jacents des arythmies, ce qui a ensuite conduit au développement de nouvelles thérapies de terminaison électrique basées sur l’excitation multi-sites du myocarde 2,3,4. Cependant, les traitements utilisant la stimulation de champ électrique sont non locaux et peuvent innerver toutes les cellules excitables environnantes, y compris le tissu musculaire, causant des dommages cellulaires et tissulaires, ainsi que des douleurs intolérables. Contrairement aux thérapies électriques, les approches optogénétiques fournissent une technique spécifique et protectrice des tissus pour évoquer les potentiels d’action des cardiomyocytes avec une grande précision spatiale et temporelle. Par conséquent, la stimulation optogénétique a le potentiel de contrôler invasivement le moins possible des schémas d’activation chaotiques pendant la fibrillation cardiaque.
L’introduction du canal ionique sensible à la lumière channelrhodopsin-2 (ChR2) dans les cellules excitables par manipulation génétique 5,6,7, a permis la dépolarisation du potentiel membranaire des cellules excitables par photostimulation. Plusieurs applications médicales, notamment l’activation des réseaux neuronaux, le contrôle de l’activité cardiaque, la restauration de la vision et de l’ouïe, le traitement des lésions de la moelle épinière, et d’autres 8,9,10,11,12,13,14 ont été développées. L’application de ChR2 en cardiologie a un potentiel important en raison de son temps de réponse milliseconde15, ce qui le rend bien adapté au contrôle ciblé de la dynamique cardiaque arythmique.
Dans cette étude, la photostimulation multisite des cœurs intacts d’un modèle murin transgénique est montrée. En résumé, une lignée de souris transgéniques alpha-MHC-ChR2 a été établie dans le cadre du septième programme-cadre de la Communauté européenne FP7/2007-2013 (HEALTH-F2-2009-241526) et aimablement fournie par le professeur S. E. Lehnart. En général, les mâles adultes transgéniques C57/B6/J, exprimant la Cre-recombinase sous contrôle de l’alpha-CMH, ont été jumelés pour s’accoupler avec la femelle B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm27.1(CAG-COP4*H134R/tdTomato)Hye/J. Comme la cassette cardiaque STOP a été supprimée à la deuxième génération, la progéniture a montré une expression stable du CMH-ChR2 et a été utilisée pour maintenir des colonies photosensibles cardiaques. Toutes les expériences ont été effectuées sur des souris adultes des deux sexes âgées de 36 à 48 semaines. L’éclairage est réalisé à l’aide d’un réseau de micro-LED 3 x 3, fabriqué comme décrit en16,17, sauf que le boîtier à base de silicium et les fibres de verre optiques courtes ne sont pas mis en œuvre. Sa première utilisation dans une application cardiaque se trouve dans18. Un réseau linéaire de micro-LED basé sur une technologie de fabrication similaire a été appliqué comme sonde pénétrante pour la stimulation cardiaque19. Les micro-LED sont disposées en un réseau 3 x 3 à un pas de 550 μm, fournissant à la fois une haute résolution spatiale et une puissance rayonnante élevée sur une très petite surface. Les auteurs démontrent dans ce travail une photostimulation multisite locale polyvalente qui pourrait ouvrir la voie au développement de nouvelles méthodes de thérapie antiarythmique.
Le protocole expérimental suivant implique une perfusion de Langendorff rétrograde ex vivo, pour laquelle l’aorte canulée fonctionne comme une entrée de perfusion. En raison de la pression de perfusion appliquée et de la contraction cardiaque, le perfusat circule dans les artères coronaires, qui se ramifient hors de l’aorte. Dans le travail présenté, le cœur est perfusé à l’aide d’une configuration à pression constante obtenue en élevant les réservoirs perfusats à 1 m de hauteur, ce qui équivaut à 73,2 mmHg, ce qui donne un débit de 2,633 ± 0,583 mL / min. Deux types de solution de Tyrode sont utilisés comme perfusat au cours de l’expérience. La solution de Tyrode régulier soutient un rythme sinusal stable, tandis que la solution de Tyrode Low-K+ est mélangée avec Pinacidil pour permettre l’induction de l’arythmie dans les cœurs murins. L’utilisation d’un bain-marie hexagonal permet l’observation du cœur à travers six fenêtres planes différentes, permettant le couplage de plusieurs composants optiques avec moins de distorsion par réfraction.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un traitement réussi des tachyarythmies cardiaques est la clé de la thérapie cardiaque. Cependant, les mécanismes biophysiques sous-jacents à l’initiation, à la perpétuation et à l’arrêt de l’arythmie ne sont pas entièrement compris. Par conséquent, la recherche cardiaque vise à optimiser la thérapie par choc électrique vers une fin plus douce des arythmies, augmentant ainsi la qualité de vie des patients 28,29,30,31.<sup class="xr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier Marion Kunze et Tina Althaus pour leur excellent soutien technique lors des expériences. La recherche qui a conduit aux résultats a reçu un financement du septième programme-cadre de la Communauté européenne FP7/2007-2013 sous le numéro de convention de subvention HEALTH-F2-2009-241526. Le Centre allemand de recherche cardiovasculaire, DZHK e.V. (projet MD28), le site partenaire de Göttingen, la Fondation allemande pour la recherche CRC 1002 (projet C03) et la Société Max Planck ont également apporté leur soutien. Ce travail a été en partie soutenu par BrainLinks-BrainTools, Cluster of Excellence financé par la Fondation allemande pour la recherche (DFG, numéro de subvention EXC 1086).
Materials
| Chemical Components | |||
| Blebbistatin | TargetMol | T6038 | 10 mM stock solution |
| BSA/Albumin | Sigma-Aldrich | A4919 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | CaCl2 |
| Carbogen | Westfalen | 50 l bottle | |
| DI-4-ANBDQPQ | AAT Bioquest | 21499 | Dye for Optical Mapping |
| Glucose | Sigma-Aldrich | D9434 | C6H12O6 |
| Heparin | LEO Pharma | Heparin-Natrium Leo 25.000 I.E./5 ml, available only on prescription | |
| Hydrochlorid Acid | Merck | 1.09057.1000 | HCl, 1 M stock solution |
| Isoflurane | CP Pharma | 1 ml/ml, available only on prescription | |
| Magnesium Chloride | Merck | 8.14733.0500 | MgCl2 |
| Monopotassium Phosphate | Sigma-Aldrich | 30407 | KH2PO4 |
| Pinacidil monohydrate | Sigma-Aldrich | P154-500mg | 10 mM stock solution |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | KCl |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | NaHCO3 |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | NaCl |
| Sodium Hydroxide | Merck | 1.09137.1000 | NaOH, 1 M stock solution |
| Electrical Setup | |||
| Biopac MP150 | Biopac Systems | MP150WSW | data acquisition and analysis system |
| Custom-built ECG, alternative ECG100C | Biopac Systems | ECG100C | Electrocardiogram Amplifier |
| Custom-built water bath heater using heating cable | RMS Heating System | HK-5,0-12 | Heating cable 120W |
| Hexagonal water bath | |||
| LED Driver Power supply | Thorlabs | KPS101 | 15 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for One K- or T-Cube. |
| LEDD1B LED Driver | Thorlabs | LEDD1B | T-Cube LED Driver, 1200 mA Max Drive Current |
| MAP, ECG Electrode | Hugo Sachs Elektronik | BS4 73-0200 | Mini-ECG Electrode for isoalted hearts |
| micro-LED Driver e.g. AFG | Agilent Instruments | A-2230 | Arbitrary function generator (AFG) |
| Signal Generator | Agilent Instruments | A-2230 | AFG |
| micro-LED Array Components | |||
| Epoxid glue | Epoxy Technology | EPO-TEK 353ND | Two component epoxy |
| Fluoropolymer | Asahi Glass Co. Ltd. | Cytop 809M | Fluoropolymer with high transparency |
| Image reversal photoresist | Merck KGaA | AZ 5214E | Image Reversal Resist for High Resolution |
| LED chip | Cree Inc. | C460TR2227-S2100 | Blue micro-LED |
| Photoresist | Merck KGaA | AZ 9260 | Thick Positive Photoresists |
| Polyimide | UBE Industries Ltd. | U-Varnish S | Polyimide Solution |
| Silicone | NuSil Technology LLC | MED-6215 | Low viscosity silicone elastomer |
| Solvent free adhesive | John P. Kummer GmbH | Epo-Tek 301-2 | Epoxy resin with low viscosity |
| Optical Mapping | |||
| Blue Filter | Chroma Technology Corporation | ET470/40x | Blue excitation filter |
| Camera | Photometrics | Cascade 128+ | High performance EMCCD Camera |
| Camera Objective | Navitar | DO-5095 | Navitar high speed fixed focal length lenses work with CCD and CMOS cameras |
| Dichroic Mirror | Semrock | FF685-Di02-25×36 | 685 nm edge BrightLine® single-edge standard epi-fluorescence dichroic beamsplitter |
| Emmision Filter | Semrock | FF01-775/140-25 | 775/140 nm BrightLine® single-band bandpass filter |
| Heatsink | Advanced Thermal Solutions | ATSEU-077A-C3-R0 | Heat Sinks – LED STAR LED Heatsink, 45mm dia., 68mm, Black/Silver, Unthreaded Baseplate Hardware |
| LED 1 and LED 2 | LED Engin Osram | LZ4-00B208 | High Power LEDs – Single Colour Blue, 460 nm 130 lm, 700mA |
| LED 3 | Thorlabs | M625L3 | 625 nm, 700 mW (Min) Mounted LED, 1000 mA |
| Lenses | LED Engin Osram | LLNF-2T06-H | LED Lighting Lenses Assemblies LZ4 LENS NARROW FLOOD BEAM |
| Photodiode for power meter | Thorlabs | S120VC | Standard Photodiode Power Sensor |
| Power Meter | Thorlabs | PM100D | Compact Power and Energy Meter |
| Red Filter | Semrock | FF02-628/40-25 | BrightLine® single-band bandpass filter |
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